Solo testo.pdf - Fondazione Santa Lucia

Proposta sperimentale
Analizzeremo la regolazione post-trascrizionale degli mRNA per Neogenina,
Mash1 e Tipin in condizioni colturali normali e di stress in cellule silenziate
o meno per Sam68 mediante RNAi.
Analizzeremo in dettaglio la regione di legame per Sam68 su questi
mRNA e valuteremo l’impatto di questa interazione mediante vettori di
espressione contenenti un gene reporter fiancheggiato dalle regioni regolatorie
di legame per Sam68 dei geni bersaglio.
Visto il coinvolgimento di Sam68 nella mobilizzazione di mRNA in risposta
alla depolarizzazione di neuroni ippocampali, ci proponiamo di esaminare
in queste condizioni sperimentali la sua associazione con i bersagli molecolari
identificati. Mediante tecniche di frazionamento subcellulare su gradiente di
saccarosio separeremo la componente polisomale da quella ribonucleoproteica.
Mediante analisi in RT-PCR potremo valutare lo spostamento di questi
mRNA sui polisomi in seguito alla traslocazione di Sam68. Inoltre, ci proponiamo
di eseguire esperimenti di ibridazione in situ accoppiata a immunofluorescenza
per verificare la co-localizzazione di Sam68 con i suoi mRNA
bersaglio in seguito alla depolarizzazione dei neuroni.
Produrremo delle linee transgeniche di topi esprimenti nel sistema nervoso
alleli mutati di Sam68 nella regione di legame agli mRNA. Abbiamo
infatti dimostrato che due mutazioni diverse in tale dominio (G178E e V229F)
causano modificazioni opposte della capacità di Sam68 di favorire lo splicing
alternativo di geni bersaglio. L’espressione di questi transgeni nel sistema nervoso
potrà darci una risposta sul ruolo svolto da questa proteina nella regolazione
post-trascrizione dei suoi geni bersaglio Neogenina e Mash1, i quali
svolgono un ruolo essenziale nello sviluppo del sistema nervoso.
C.2.17 – Ruolo dei neuropeptidi: effetti neurofisiologici
(Alessandro Stefani)
Neuroscienze sperimentali
Il ruolo di diversi neuropeptidi, espressi in abbondanza nei gangli della
base, è largamente sconosciuto. Per l’enkefalina, co-rilasciata insieme al
GABA specie nei terminali striatonigrali e striatopallidali, è stato in parte
dimostrato un ruolo di modulatore presinaptico, ma è soprattutto di rilievo la
modificazione di sintesi che conseguirebbe alla denervazione dopaminergica
(modelli da 6-OHDA). Meno chiare sono le risultanze relative a neurotensina
(NT) e Sostanza P (SP) benché le loro interazioni con le amine biogene siano
state suggerite da tempo dalla farmacologia clinica.
Il territorio oggetto della presente ricerca corrente attiene all’approfondimento
degli effetti neurofisiologici di tali peptidi nel globo pallido (o pallido
esterno) di ratto adulto. Esamineremo l’azione esercitata da NT e SP su correnti
calciche ad alta soglia (in prevalenza da neuroni dissociati con metodo
enzimatico). Una modulazione delle stesse dovrebbe apportare significative
modifiche al pattern di scarica dei neuroni esaminati (benché in larga misura
la modalità di scarica sia dominata dalle conduttanze sodiche, vedi ad esempio
gli ultimi contributi di Kaneda/Kita), con riflessi plausibili sulla cascata di
2006 479