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Sezione III: Linea di ricerca corrente C
nali striatali del topo mutante R6/2, modello transgenico di HD. I nostri dati
hanno confermato, anche nel topo mutante, una particolare ricchezza di huntingtina
negli interneuroni colinergici, resistenti al danno eccitotossico. L’obiettivo
successivo è stato quello di indagare la presenza di altre proteine che
si sono dimostrate importanti nell’HD. La c-AMP-responsive-element (CREB)
è una proteina regolatrice di varie funzioni cellulari, recentemente dimostrata
essere coinvolta nei processi degenerativi dell’HD. Il nostro gruppo ha recentemente
dimostrato una correlazione tra i livelli di CREB e le diverse sottopopolazioni
neuronali striatali coinvolte nella degenerazione nell’HD (Giampà
C., DeMarch Z. et al. (2006) Eur J Neurosi 23(1): 11-20). Il progetto, che avrà
durata triennale, sarà rivolto allo studio di strategie terapeutiche per l’HD che
siano finalizzate all’aumento della CREB nei neuroni di proiezione che sono i
primi a degenerare nella patologia.
La prima parte del progetto mirerà allo studio dell’effetto di un inibitore
della fosfodiesterasi 4, il Rolipram, sull’espressione a livello proteico della
CREB nei neuroni di proiezione sia nel ratto normale che nel modello eccitotossico
da lesione con acido quinolinico. Ratti Wistar maschi verranno iniettati
stereotassicamente con acido quinolinico 10mM in anestesia generale,
dopo trattamento quotidiano con Rolipram a due differenti concentrazioni
(0.15 mg/Kg; 1,15 mg/Kg) saranno perfusi a diversi time-points e fissati in
paraformaldeide 4%. Verranno ottenute sezioni di encefalo dello spessore di
40 µm che saranno incubate con un cocktail di anticorpi primari diretti contro
la CREB e contro la calbindina (CALB). Le sezioni verranno in seguito
incubate con una miscela di appropriati anticorpi secondari fluorescenti,
montati su vetrini gelatinati e quindi esaminate con un microscopio ad epiilluminazione
in fluorescenza e con un microscopio confocale. I dati ottenuti
ci permetteranno di verificare una possibile strategia terapeutica per l’HD
rivolte ad intervenire sui livelli di CREB intrastriatale.
Risultati preliminari
È stato per ora studiato l’effetto di un inibitore della fosfodiesterasi 4, il
Rolipram, sull’espressione a livello proteico della CREB nei neuroni di proiezione
sia nel ratto normale che nel modello eccitotossico da lesione con acido
quinolinico. Ratti Wistar maschi sono stati iniettati stereotassicamente con
acido quinolinico (QA) 10mM in anestesia generale, dopo trattamento quotidiano
con Rolipram a due differenti concentrazioni (0.15 mg/Kg; 1,15 mg/Kg).
Le sezioni ottenute sono state incubate con un cocktail di anticorpi primari
diretti contro la CREB e contro la calbindina (CALB). Le sezioni sono state
esaminate con un microscopio ad epi-illuminazione in fluorescenza e con un
microscopio confocale.
Dai nostri studi preliminari si evince una significativa differenza tra la
quantità di CREB fosforilata nei neuroni di proiezione in animali lesionati con
QA trattati con Rolipram e ratti lesionati QA trattati con veicolo. Abbiamo inoltre
un significativo aumento dell’intensità della p-CREB in neuroni trattati con
Rolipram 0,15 mg/Kg rispetto ai ratti lesionati QA a tutti i time-points. Questo
effetto è evidente in particolar modo a 8 settimane dalla lesione dove si ha un
468 2006