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Neuroscienze sperimentali
– Analizzare la distribuzione di LSm1 di estratti di cervello su gradienti
di sucrosi: complessi attivi o inibiti nella traduzione sedimentano con velocità
caratteristiche.
– Immunoprecipitare LSm1, da estratti di cervello o da frazioni di gradienti
di sucrosi, e studiare in Western Blot quali proteine di traduzione si
associano.
– Introdurre siRNA in neuroni primari per abbassare il livello della proteina
SMN; siRNA saranno introdotti tramite trasfezione (elettroporazione),
un metodo già codificato in laboratorio. In tal modo, si potrà vedere se la
mancanza di SMN modifica la localizzazione di LSm1.
Per la linea di ricerca su splicing alternativo vogliamo studiare quale
cascata di segnali cambia lo splicing attraverso:
– Lo studio, tramite vari inibitori specifici, di come si propaga il segnale
da stress ossidativo e danno mitocondriale fino al cambio dello splicing.
– L’arricchimento di due famiglie di proteine che sono coinvolte nelle
scelte di diti di splicing – le proteine hnRNP e SR – per analizzare modulazioni
tramite metodi di proteomica. Questi esperimenti saranno eseguiti in
collaborazione con l’unità proteomica dell’IRCCS S. Lucia – Prof. Andrea
Urbani e Prof. Giorgio Federici.
– Studio di un modello che abbiamo sviluppato in precedenza: cellule di
neuroblastoma che esprimono poco SMN, per vedere se la mancanza della
proteina SMN porta a un cambiamento dello splicing simile a quello dovuto
al danno mitocondriale.
Risultati acquisiti
Per la funzione del complesso LSm1-7, abbiamo visto che:
– LSm1 è presente lungo i prolungamenti di neuroni primari di varie
origini.
– LSm1 è presente in aggregati puntiformi nei dendriti in tutto il cervello
di topo.
– Questi punti non contengono un marcatore della funzione conosciuta
di LSm1, che suggerisce un’altra funzione della proteina.
– LSm1 si lega ad mRNAs che sono localizzati lungo i dendriti neuronali.
Questi dati suggeriscono che LSm1 abbia un ruolo nel trasporto e/o nella
regolazione di mRNAs dendritici.
Per quanto riguarda lo splicing alternativo, abbiamo osservato che:
– Paraquat, un generatore di stress ossidativo ed un modello della SLA,
cambia il rapporto di isoforme che risultano da splicing alternativo.
– Tutti gli mRNAs che subiscono splicing alternativo (8/8 osservati) si
modificano e quindi cambia l’espressione genica.
– Cellule di origine neuronale sono più suscettibili rispetto a cellule di
origine diversa.
2006 457