Solo testo.pdf - Fondazione Santa Lucia

Borse di studio
metilate rimangono citosine (Frommer M., McDonald L.E. et al., 1992, Proc
Nat Acad Sci USA 89: 1827-1831; Herman J.G., Graff J.R. et al., 1996, Proc Nat
Acad Sci USA 93(18): 9821-9826; Singal R., Ginger G.D., 1999, Blood 93: 4059-
4070). Come controlli positivo e negativo sono stati utilizzati DNA genomico
metilato in vitro estratto da linfociti e DNA genomico estratto da linfociti
rispettivamente. In particolare, 1µg di DNA genomico è stato denaturato con
NaOH 2M per 15 minuti e dopo è stato convertito con la soluzione di bisolfito
preparata fresca (10mM di idrochinone e bisolfito sodico 3M, pH 5.0). Ogni
reazione è stata incubata a 50°C per 16-20 h e dopo purificata usando Wizard
DNA purification kit (Promega, Madison, WI), seguita da trattamento desolfonante
con NaOH 3M, che cambia gli uracili a timine. Il DNA quindi viene precipitato
in etanolo e il pellet purificato è stato risospeso in 30 µl di ddH2O.
Nested PCR, clonaggio e sequenziamento – Il DNA purificato e convertito è
stato utilizzato per amplificare mediante PCR nested la banda di interesse. I
primers utilizzati per l’amplificazione sono i seguenti: a) Reelin C G-F: GGT
TTA AAG TAA TTT TGG GAG T; b) Reelin C G-R: CAA TAT ACA AAA AAA TAA
ACA CCT C; c) Reelin C G-Fnest: GTT TTT AAA ATT GAA TGA G. La banda
d’interesse è stata poi purificata da gel d’agarosio, ligata nel TOPO vector
(Invitrogen) e clonata in cellule di E.coli. Per ciascun individuo sono stati analizzati
mediante sequenziamento diretto 20 cloni, purificati mediante il Kit
QUIAGEN di estrazione di DNA plasmidico.
Western blotting – Per questi esperimenti è stato utilizzato il protocollo
descritto in Lugli et al. (Lugli G., Krueger J.M. et al., 2003, BMC Biochem 4: 9).
Risultati e discussione
Risultati preliminari per quattro coppie di autistici e controlli mostrano
che il pattern di metilazione nella zona studiata non è significativamente
diverso tra autistico e relativo controllo. Sono stati trovati anche dei polimorfismi
sia nella zona non codificante che nella zona codificante vicina al
promotore. Tali polimorfismi dovranno essere confermati mediante il
sequenziamento diretto del DNA genomico non convertito. Infatti anche
questi polimorfismi potrebbero alterare l’espressione o la funzione della
proteina reelin.
I risultati del Western Blotting mostrano differenze nel livello di espressione
della proteina reelin tra il controllo e il patologico sebbene non si
osservi un trend costante per tutte le 10 coppie analizzate (in alcune coppie il
livello di Reelin è inferiore nell’autistico rispetto al controllo mentre in altre è
inferiore nel controllo rispetto all’autistico). Tuttavia, i risultati del Western
Blotting potrebbero riflettere una diversa degradazione dei tessuti oggetto di
questo studio piuttosto che una reale differenza nel livello di espressione della
proteina reelin. Per questo motivo, si è deciso di quantificare il livello di RNA
messaggero nei vari campioni mediante esperimenti di PCR quantitativa.
2006 249