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Sezione II
Il recettore P2Y 4
è stato quindi subclonato in un vettore recante un epitopo
Myc, così da ottenere una proteina di fusione Myc-P2Y 4
. Il plasmide è
stato successivamente trasfettato nel sistema di neuroblastoma umano SH-
SY5Y, allo scopo di analizzarne l’espressione mediante immunoblotting con
anticorpi specifici per il peptide Myc. La presenza di forme oligomeriche
anche nel caso della proteina di fusione Myc-P2Y 4
ha così validato l’esistenza
del complesso dimerico già riscontrato per il recettore P2Y 4
endogeno.
3. Se l’assenza di agenti riducenti ed il cross-linking favorissero la formazione
di forme oligomeriche del recettore P2Y 4
endogeno e trasfettato.
Per evidenziare le relative quantità e correlazioni tra le diverse forme
mono- e multi-meriche del recettore P2Y 4
endogeno e trasfettato sono stati
quindi svolti esperimenti di western blotting, variando le condizioni di riduzione
dei campioni ed utilizzando agenti cross-linkanti, in grado di formare
legami ammidici stabili tra proteine che interagiscono tra loro. Si è così
verificato che, in assenza di agenti denaturanti quali il ditiotreitolo ed il
2-mercaptoetanolo ed in presenza dell’agente cross-linkante disuccinilsuberato,
si determina un aumento dell’espressione del recettore P2Y 4
(endogeno e
trasfettato) nelle forme dimerica ed oligomerica, a scapito della forma monomerica.
Questi esperimenti consentono anche di stabilire che l’aggregazione
della subunità P2Y 4
dipende, almeno in parte, da ponti disolfuro.
4. Se in condizioni native il recettore P2Y 4
fosse presente come complesso
di alto peso molecolare.
Mediante la tecnica di elettroforesi Blu Nativa, adattata nel nostro laboratorio
allo studio dei recettori P2 endogeni e trasfettati, si è analizzata la struttura
quaternaria del recettore P2Y 4
. Si è così constatato che, in condizioni non denaturanti
simili a quelle fisiologiche, il recettore P2Y 4
è espresso come complesso di
altissimo peso molecolare che dà origine esclusivamente alla forma dimerica in
presenza di basse concentrazioni di agenti denaturanti. Queste osservazioni indicano
che il recettore P2Y 4
viene assemblato nelle cellule sottoforma di un grosso
complesso che potrebbe contenere non solo altre subunità P2Y 4
, presenti come
unità dimeriche, ma anche altre proteine di membrana e/o citosoliche.
5. Se il recettore P2Y 4
fosse effettivamente in grado di formare omooligomeri.
A conferma definitiva della dimerizzazione del recettore P2Y 4
è stato ottenuto,
mediante PCR e subclonaggio, un secondo costrutto recante la subunità
P2Y 4
fusa con un epitopo Flag ed è stata adottata la tecnica della co-trasfezione
Myc-P2Y 4
/Flag-P2Y 4
, immunoprecipitazione selettiva con anticorpo anti-Flag ed
immunoblotting con anticorpo anti-Myc. La presenza di immunoreazione esclusivamente
nel campione derivante dalle cellule co-trasfettate ha permesso di
visualizzare l’effettiva interazione tra subunità P2Y 4
differentemente marcate.
Conclusione
Il nostro studio ci ha permesso di identificare una complessa struttura quaternaria
del recettore metabotropico P2Y 4
specifico per i nucleotidi extracellulari
(D’Ambrosi N., Iafrate M. et al., 2006, Purinergic Signalling 2: 575-582).
234 2006