23-Linea C-neuroscie.. - Fondazione Santa Lucia

C–NEUROSCIENZE SPERIMENTALI 

GIORGIO BERNARDI 

Università di Roma Tor Vergata – Fondazione Santa Lucia

Sezione III: Attività per linea di ricerca corrente C 

C.1 –PLASTICITÀ DELLE CONNESSIONI NEURONALI IN RAPPORTO 

ALL’APPRENDIMENTO E ALLA MEMORIA IN CONDIZIONI FISIOPATOLOGICHE 

C.1.1 – Analisi comportamentale degli effetti di farmaci attivi sul sistema 

colinergico in presenza di danno colinergico del proencefalo basale 

(Laura Mandolesi) 

C.1.2 – Analisi stereo-morfologica di neuroni neocorticali in presenza 

di deplezione colinergica e trattamento con farmaci attivi sul sistema 

colinergico (Laura Petrosini) 

C.1.3 – Implicazione della trasmissione catecolaminergica mesolimbica 

e mesocorticale nei disturbi cognitivi di origine genetica ed ambientale 

(Stefano Puglisi-Allegra) 

C.2 –STUDIO MULTIDISCIPLINARE DEI MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI 

ALLA BASE DI PATOLOGIE NEURODEGENERATIVE 

C.2.1 – Meccanismo di neurodegenerazione nell’atrofia muscolare spinale 

ed altre malattie (Tilmann Achsel) 

C.2.2 – Alterazioni della morfologia corticale e spinale e modificazioni 

delle funzioni cognitive e motorie nel topo G93A, un modello murino 

della sclerosi laterale amiotrofica (Martine Ammassari-Teule) 

C.2.3 – Basi molecolari e cellulari della sindrome dell’X fragile (Claudia Bagni) 

C.2.4 – Analisi del ruolo della chinasi mutata nell’Atassia Telangiectasia 

(ATM) nella morte cellulare programmata, nella neurodegenerazione 

e nel controllo della stabilità delle proteine (Daniela Barilà) 

C.2.5 – Alterazioni funzionali nella attività elettrica dei neuroni 

dopaminergici della sostanza nera pars compacta: ruolo delle 

afferenze sinaptiche estrinseche (Nicola Berretta) 

C.2.6 – Ruolo delle Scaffolding Proteins e del recettore NMDA 

nella plasticità sinaptica corticostriatale in modelli sperimentali 

di malattie neurodegenerative (Paolo Calabresi) 

C.2.7 – Studio delle alterazioni indotte dalle Cu,Zn superossido dismutasi 

mutanti associate alla sclerosi laterale amiotrofica di tipo familiare 

(Maria Teresa Carrì) 

C.2.8 – Analisi dello stress e della morte cellulare nella malattia di Alzheimer 

in modelli animali e cellulari di nuova concezione (Francesco Cecconi) 

C.2.9 – Strategie terapeutiche per la Corea di Huntington. Il ruolo 

di c-AMP-responsive element (CREB) (Francesca R. Fusco) 

C.2.10 – Recettori metabotropici e ionotropici del glutammato: 

risposte neuronali e canali transienti (TRP) (Ezia Guatteo) 

C.2.11 – Ruolo della tossicità da glutammato in un modello sperimentale 

di Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) (Patrizia Longone) 

C.2.12 – Modulazione della trasmissione GABAergica mediata dalle amine 

in traccia in neuroni dopaminergici del mesencefalo ventrale 

(Nicola Biagio Mercuri) 

C.2.13 – Modulazione GABAergica e dopaminergica dell’eccitabilità 

dei neuroni dopaminergici in colture organotipiche di mesencefalo 

di topo (Nicola Biagio Mercuri) 

C.2.14 – Caratterizzazione di “ marcatori di danno ” in modelli sperimentali 

neurodegenerativi e di danno assonale (Marco Molinari) 

C.2.15 – Alterazioni patologiche della plasticità sinaptica nello striato 

come modello di patologie neurodegenerative (Antonio Pisani) 

402 2007

Neuroscienze sperimentali 

C.2.16 – Alterazioni di Fosfodiesterasi specifiche nei neuroni striatali 

in un modello di parkinsonismo sperimentale nel ratto 

(Giuseppe Sancesario) 

C.2.17 – Analisi della regolazione post-trascrizionale della espressione genica 

nel differenziamento neuronale (Claudio Sette) 

C.2.18 – Attualità della trasmissione neurotensinergica nel modello 

di parkinsonismo da 6-OHDA: immunochimica ed elettrofisiologia 

in vivo tra animali denervati e denervati con discinesie 

(Alessandro Stefani) 

C.2.19 – Investigazioni di Proteomica e Metabonomica nelle sindromi 

neurodegenerative (Andrea Urbani) 

C.2.20 – Patologie neurodegenerative e recettori purinergici (Cinzia Volonté) 

C.3 –STUDIO MULTIDISCIPLINARE DELL’IMMUNOPATOGENESI 

DELLA SCLEROSI MULTIPLA 

C.3.1 – Studio delle caratteristiche fenotipiche e funzionali dei linfociti T 

regolatori nella Sclerosi Multipla (Luca Battistini) 

C.3.2 – Studio dell’attività neuronale e sinaptica in topi con encefalite allergica 

sperimentale, modello animale di Sclerosi Multipla (Diego Centonze) 

C.3.3 – Studi di epidemiologia molecolare, caratterizzazione genotipo-fenotipo 

ed identificazione di nuovi loci e geni malattia nelle malattie 

neurologiche (Antonio Orlacchio) 

2007 403


C.1 –PLASTICITÀ DELLE CONNESSIONI NEURONALI IN RAPPORTO 

ALL’APPRENDIMENTO E ALLA MEMORIA IN CONDIZIONI FISIOPATOLOGICHE 

C.1.1 – Analisi comportamentale degli effetti di farmaci attivi 

sul sistema colinergico in presenza di danno colinergico 

del proencefalo basale (Laura Mandolesi) 

Anno d’inizio: 2007 

Durata: 12 mesi 

Parole chiave: Sistema colinergico; Donepezil; Ratto. 

Altri Enti coinvolti: Università di Roma La Sapienza; Università di Napoli 

Parthenope. 

Descrizione 

La malattia di Alzheimer è caratterizzata da un progressivo declino nelle 

funzioni cognitive, che include anche la perdita di memoria. Si pensa che 

l’ipofunzione colinergica sia una componente della malattia e molte evidenze 

cliniche e sperimentali supportano la nozione che una perdita della funzione 

colinergica contribuisca ai deficit cognitivi che caratterizzano tale malattia. Su 

questa base è stato proposto un iniziale approccio terapeutico che consiste nell’aumento 

farmacologico della funzione colinergica. La più efficace di tali strategie 

è l’aumento di ACh che si ottiene riducendone la degradazione da parte della 

acetilcolinesterasi. Tale azione può essere effettuata dal Donepezil, un antagonista 

della acetilcolinesterasi. Nonostante venga usato nel trattamento di pazienti 

con malattia di Alzheimer o con mild cognitive impairment, la valutazione degli 

effetti del trattamento cronico con Donepezil è quasi del tutto mancante nella 

letteratura sperimentale. Fra i vari tentativi di riprodurre la demenza tipo 

Alzheimer in modelli animali, uno dei più fruttuosi è quello in cui viene prodotta 

una ipofunzione colinergica attraverso la manipolazione sperimentale dei nuclei 

del proencefalo basale. In particolare, si può ottenere una selettiva lesione dei 

neuroni colinergici del proencefalo basale attraverso l’uso della immunotossina 

192-IgG saporina che blocca la sintesi proteica nei neuroni colinergici. Le iniezioni 

intraventricolari di tale tossina provocano lesioni del sistema proencefalico 

basale, rendendo il modello di deplezione colinergica particolarmente adatto per 

lo studio degli effetti dell’assenza della proiezione colinergica alla neocortex. 

Risultati e prodotti conseguiti 

Il progetto di ricerca, concluso nel 2006, dal titolo “ Analisi delle strategie di 

foraging in presenza di lesione cerebellare ” ha evidenziato un’alterazione nelle 

abilità di esplorazione spaziale da parte degli animali con lesione cerebellare. 

Attività previste 

Nel presente progetto di ricerca ci si propone di analizzare gli effetti comportamentali 

del trattamento con Donepezil in presenza di deplezione coliner- 

404 2007


gica del proencefalo basale. La batteria di test effettuati dopo il recupero postoperatorio 

permetterà di valutare diversi aspetti dei processi mnesici a breve e 

a lungo termine. 

Metodologia 

Saranno usati ratti Wistar che a 3 mesi di età riceveranno iniezioni intraventricolari 

bilaterali di tossina coniugata 192 IgG-saporina. Metà di tali animali 

riceveranno quotidianamente iniezioni i.p. di 0.5 mg/kg di Donepezil 1 

settimana prima e 2 settimane dopo la lesione colinergica. Un uguale numero 

di animali integri subirà o meno lo stesso trattamento farmacologico. In questo 

modo si otterranno quattro gruppi sperimentali, due trattati e due in condizioni 

standard, due con deplezione colinergica e due integri. 

Dopo 15 giorni di recupero post-operatorio, gli animali dei vari gruppi 

saranno sottoposti alla batteria di test comportamentali tesi ad evidenziare la 

comparsa di deficit mnesici spaziali precoci. Fra i test scelti, il labirinto radiale 

(con due protocolli sperimentali, di scelta libera e di scelta forzata, che permetteranno 

di distinguere le competenze procedurali dalle abilità di working 

memory spaziale), il labirinto ad acqua di Morris (che permetterà di studiare 

sia gli aspetti procedurali che quelli localizzatori della funzione spaziale, analizzandone 

le componenti a lungo termine), un labirinto sequenziale (che permetterà 

di analizzare l’apprendimento e la memorizzazione di sequenze spaziali, 

funzioni prevalentemente legate alle circuitazioni corticali pre-frontali, 

particolarmente influenzate dal danno al sistema colinergico proencefalico), 

ed infine l’open field (che permetterà di analizzare la costruzione della mappa 

spaziale). Alla fine della testatura comportamentale, gli animali saranno sacrificati. 

I cervelli saranno sottoposti ad analisi immuno- ed isto-chimiche del 

sistema colinergico, per verificare la presenza e la consistenza del danno colinergico 

proencefalico. 

C.1.2 – Analisi stereo-morfologica di neuroni neocorticali in presenza 

di deplezione colinergica e trattamento con farmaci attivi 

sul sistema colinergico (Laura Petrosini) 

Parole chiave: Sistema colinergico; Donepezil; Ratto. 

Altri Enti coinvolti: Università degli Studi di Roma La Sapienza. 

Descrizione 

La malattia di Alzheimer è caratterizzata da un progressivo declino nelle funzioni 

cognitive, che include anche la perdita di memoria. Si pensa che 

l’ipofunzione colinergica sia una componente della malattia e molte evidenze 

cliniche e sperimentali supportano la nozione che una perdita della funzione colinergica 

contribuisca ai deficit cognitivi che caratterizzano tale malattia. Su 

questa base è stato proposto un iniziale approccio terapeutico che consiste nell’aumento 

farmacologico della funzione colinergica. La più efficace di tali strategie 

è l’aumento di ACh che si ottiene riducendone la degradazione da parte della 

2007 405


acetilcolinesterasi. Tale azione può essere effettuata dal Donepezil, un antagonista 

della acetilcolinesterasi. Nonostante venga usato nel trattamento di pazienti 

con malattia di Alzheimer o con mild cognitive impairment, la valutazione degli 

effetti del trattamento cronico con Donepezil è quasi del tutto mancante nella letteratura 

sperimentale. Fra i vari tentativi di riprodurre la demenza tipo Alzheimer 

in modelli animali, uno dei più fruttuosi è quello in cui viene prodotta una ipofunzione 

colinergica attraverso la manipolazione sperimentale dei nuclei del 

proencefalo basale. In particolare, si può ottenere una selettiva lesione dei neuroni 

colinergici del proencefalo basale attraverso l’uso della immunotossina 192- 

IgG saporina che blocca la sintesi proteica nei neuroni colinergici. Le iniezioni 

intraventricolari di tale tossina provocano lesioni del sistema proencefalico 

basale, rendendo il modello di deplezione colinergica particolarmente adatto per 

lo studio degli effetti dell’assenza della proiezione colinergica alla neocortex. 

Nel presente progetto di ricerca ci si propone di analizzare se il trattamento 

con Donepezil sia in grado di modificare la struttura dei neuroni piramidali 

della corteccia parietale in presenza di deplezione colinergica del 

proencefalo basale. In particolare, dato l’interessamento dei diversi strati corticali 

in circuiti diversi di afferenze ed efferenze con altre strutture corticali e 

sottocorticali, ci si propone di analizzare i neuroni piramidali del III e del V 

strato della corteccia parietale. Considerata inoltre la specificità della funzionalità 

recettiva dell’arborizzazione apicale e basale nei neuroni piramidali, 

l’analisi sarà tesa ad indagare le eventuali difformità fra i cambiamenti intervenuti 

nelle due porzioni della ramificazione dendritica. 


Nel presente progetto di ricerca ci si è proposti di analizzare come le condizioni 

di allevamento (standard o arricchito) siano in grado di modificare la 

struttura dei neuroni piramidali del III strato della corteccia parietale in presenza 

di deplezione colinergica del proencefalo basale. Si può ottenere una 

selettiva lesione dei neuroni colinergici del proencefalo basale attraverso iniezioni 

intraparenchimali della immunotossina 192-IgG saporina che è in grado 

di bloccare la sintesi proteica nei neuroni colinergici. A tal scopo sono stati 

analizzati parametri quali il numero e la densità delle spine dendritiche sull’arborizzazione 

dendritica, l’estensione complessiva dell’arborizzazione; il 

numero totale dei nodi dendritici. 

I risultati di tali analisi hanno evidenziato una chiara risposta neuronale 

alla deplezione colinergica del proencefalo basale. Il numero delle spine dendritiche 

era infatti significativamente aumentato in presenza di danno colinergico 

del proencefalo basale nei neuroni piramidali degli animali lesi allevati in 

condizioni standard ma anche degli animali lesi allevati in ambiente arricchito 

che peraltro partivano da valori significativamente più alti. Tale incremento sia 

del numero totale sia della densità delle spine si accompagnava ad una riduzione 

dell’albero dendritico. L’arborizzazione dei dendriti apicali e basali 

infatti si riduceva significativamente in presenza di lesione colinergica. Tali 

indicazioni dimostrano una differenziata reazione dell’encefalo in risposta al 

danno colinergico a carico delle diverse componenti neuronali. 

406 2007



Saranno usati ratti Wistar che a 3 mesi di età riceveranno iniezioni intraventricolari 

bilaterali di 192 IgG saporina. Metà di tali animali riceveranno 

quotidianamente iniezioni i.p. di 0.5 mg/kg di Donepezil 1 settimana prima e 

2 settimane dopo la lesione colinergica. Un uguale numero di animali integri 

subirà o meno lo stesso trattamento farmacologico. In questo modo si otterranno 

quattro gruppi sperimentali, due trattati e due in condizioni standard, 

due con deplezione colinergica e due integri. 

Alla fine del periodo di testatura comportamentale, per ottenere una colorazione 

neuronale tipo Golgi, gli animali saranno anestetizzati e riceveranno 

iniezioni parietali di una soluzione di tracciante retrogrado BDA e di un agonista 

dei recettori glutammatergici NMDA. Dopo 96 ore, gli animali anestetizzati 

saranno sacrificati mediante perfusione transcardiaca di una soluzione di 

fissaggio. Una volta prelevati, i cervelli saranno conservati per 24 ore in sucrosio, 

e poi tagliati al microtomo congelatore in sezioni dello spessore di 50 

micron. I neuroni marcati con BDA saranno evidenziati usando il complesso 

avidina-biotina e analizzati alla Neurolucida. In particolare saranno analizzati 

i neuroni piramidali del terzo e del quinto strato in cui si prenderanno in considerazione 

cinque parametri: il numero delle spine dendritiche; la densità 

delle stesse sull’arborizzazione dendritica; l’estensione complessiva dell’arborizzazione; 

il numero totale delle ramificazioni, dato dalla somma dei nodi 

dendritici; il numero delle intersezioni dei dendriti con una serie di anelli concentrici, 

posti ad intervalli di 10 micron a partire dal centro del corpo cellulare. 

Tali parametri sono ritenuti indici di sinaptogenesi, fenomeno plastico di 

fondamentale importanza nel SNC. 

C.1.3 – Implicazione della trasmissione catecolaminergica mesolimbica 

e mesocorticale nei disturbi cognitivi di origine genetica 

ed ambientale (Stefano Puglisi-Allegra) 



Parole chiave: Corteccia prefrontale; Sistema mesolimbico; Dopamina; 

Noradrenalina; Neuroplasticità; Emozione; Motivazione; Attenzione; Stress; 

Genotipo. 

Altri Enti coinvolti: Dipartimento di Psicologia e Centro “ Daniel Bovet ”, 

Università di Roma La Sapienza. 

Descrizione 

Lo studio tratta del ruolo della trasmissione noradrenergica prefrontale e 

della regolazione su quella dopaminergica meso-accumbens nella ricomparsa 

della preferenza condizionata ad un ambiente precedentemente appaiato a 

sostanze d’abuso. A questo scopo sarà usato il test del “ reinstatement ” per 

verificare se la deafferentazione selettiva delle proiezioni noradrenergiche alla 

corteccia prefrontale mediale, effettuata dopo l’acquisizione di una preferenza 

2007 407


spaziale condizionata in topi del ceppo C57BL/6J e l’estinzione della stessa, 

impedisce il recupero, indotto da uno stressor (“ foot-shock ”) o dall’ampiamento 

di “ cues ” ambientali associati all’ambiente in cui viene somministrata 

la sostanza. 

Sarà inoltre studiato il ruolo della trasmissione catecolaminergica corticosottocorticale 

nell’acquisizione di una preferenza spaziale condizionata in 

presenza di sostanze naturali (ad es. cibo) o di sostanze note per la loro capacità 

di indurre delle reazioni avversive (ad es. ClLi, o stressor inevitabili) allo 

scopo di verificare se i circuiti fronto-cortico-limbici sono implicati in 

maniera simile nell’attribuzione di motivazione incentivante positiva o negativa. 

Un’attenzione specifica sarà rivolta allo studio degli effetti di uno stress 

inevitabile sulla risposta catecolaminergica nella corteccia prefrontale e della 

sua regolazione della risposta dopaminergica in aree mesolimbiche come il 

nucleus accumbens, un’area che ricopre un ruolo fondamentale nell’apprendimento 

e nell’attribuzione di motivazione incentivante. 


Lo scorso anno abbiamo studiato il ruolo della trasmissione catecolaminergica 

cortico-sottocorticale nell’acquisizione di una preferenza spaziale condizionata 

in presenza di sostanze naturali (cibo) o di sostanze note per la loro 

capacità di indurre delle reazioni avversive (ad es. ClLi, o stressor inevitabili). 

I risultati hanno mostrato che il sistema costituito dalla noradrenalina in corteccia 

prefrontale mediale e dalla dopamina nel nucleus accumbens è implicato 

nell’attribuzione di salienza motivazionale collegata sia a stimoli positivi 

che negativi. 

Abbiamo, inoltre, dimostrato che la risposta bifasica ad uno stress inevitabile 

da parte del sistema mesolimbico dopaminergico (attivazione della 

liberazione di dopamina nel nucleo accumbens seguita da una inibizione) è 

regolata dall’azione complementare della liberazione di noradrenalina e di 

dopamina nella corteccia prefrontale mediale che determinano rispettivamente 

l’attivazione e l’inibizione della liberazione di dopamina nel nucleus 

accumbens. 


Nel corso del 2007 sarà proseguito lo studio della trasmissione catecolaminergica 

cortico-sottocorticale nell’acquisizione di una preferenza spaziale 

condizionata in presenza di cibo di diversa appetibilità e di stimoli avversivi 

(stressor inevitabili) di diverse intensità allo scopo di verificare se i circuiti 

fronto-cortico-limbici sono implicati in maniera simile nell’attribuzione di 

motivazione incentivante positiva o negativa in rapporto alla salienza degli 

stimoli primari. 

Un’attenzione specifica sarà rivolta allo studio degli effetti di uno stress 

inevitabile sulla risposta catecolaminergica nella corteccia prefrontale e della 

sua regolazione della risposta dopaminergica in aree mesolimbiche come il 

nucleus accumbens, un’area che ricopre un ruolo fondamentale nell’apprendimento 

e nell’attribuzione di motivazione incentivante. 

408 2007


Sarà valutato il ruolo delle catecolamine corticali nella valutazione dell’evento 

stressante e sulla motivazione diretta alla gestione dello stress, con 

particolare attenzione alla controllabilià ed alla prevedibilità dell’evento stressante 

(attraverso il metodo del c.d. “ yoked vs avoider ”). Questi studi sono 

rivolti alla comprensione del ruolo del sistema mesocorticolimbico catecolaminergico 

nella motivazione incentivante ed avversiva acquisita. 

2007 409


C.2 –STUDIO MULTIDISCIPLINARE DEI MECCANISMI CELLULARI 

E MOLECOLARI ALLA BASE DI PATOLOGIE NEURODEGENERATIVE 

C.2.1 – Meccanismo di neurodegenerazione nell’atrofia muscolare 

spinale ed altre malattie (Tilmann Achsel) 



Parole chiave: Atrofia spinale muscolare; Sclerosi laterale amiotrofica; Processamento 

dei RNA messaggeri; Splicing alternativo. 

Descrizione 

L’atrofia muscolare spinale (ASM) è una malattia che è causata da una 

diminuzione della proteina SMN, un fattore coinvolto nello splicing. Nonostante 

la sua presenza ubiquitaria, ci sono indicazioni che i neuroni siano più 

suscettibili alla mancanza di SMN a causa di un suo secondo ruolo. Noi guarderemo 

in particolare le proteine LSm1-7, che interagiscono con SMN in vitro. 

Queste proteine formano un complesso che ha un ruolo, in tutte le cellule 

somatiche, nella regolazione della traduzione. In precedenza, abbiamo osservato 

che la proteina LSm1 è molto presente nei prolungamenti di neuroni. Ci 

proponiamo adesso di approfondire quale sia il ruolo di LSm1 nella regolazione 

della traduzione neuronale, e quale sia l’influenza di una mancanza della 

proteina SMN su localizzazione e funzione delle proteine LSm. 

In un secondo programma di ricerca, abbiamo studiato alterazioni di 

splicing dei messaggeri in un modello cellulare della sclerosi laterale amiotrofica 

(SLA). Queste alterazioni toccano una gran parte delle mRNA, e possono 

così contribuire significativamente alla destabilizzazione dei neuroni (vedi 

sotto). Vogliamo adesso stabilire la causa di queste alterazioni dello splicing. 

In più, la degradazione dei motoneuroni progredisce in modo simile in SLA e 

ASM, e la proteina SMN, proteina causativa della ASM, ha un ruolo nello splicing. 

Perciò, vogliamo studiare se un difetto simile allo splicing si manifesta 

pure in cellule modello di ASM. 


Abbiamo stabilito che il complesso delle proteine LSm1-LSm7, bersaglio 

della proteina SMN, che è colpita nella ASM, si associa con RNA messaggeri 

nei dendriti. La composizione proteica di questi complessi fornisce importanti 

informazioni sia su come gli RNA messaggeri vengano selezionati per il 

trasporto nei dendriti, sia su come siano attivati quando una stimulazione 

ripetitiva di una sinapsi richiede una sintesi proteica localizzata in tale 

regione. Questo è il primo complesso nei neuroni con una funzione specifica 

che può legare SMN; ora intendiamo quindi studiare il ruolo di SMN per 

l’assemblaggio e la funzione di questo complesso di RNA messaggero. 

Nel secondo programma di ricerca abbiamo dimostrato che un danno 

mitocondriale, precisamente l’abbassamento di ATP che risulta in seguito ad 

410 2007


esso, provoca un cambiamento di splicing alternativo in linee cellulari di 

origine neuronale. L’effetto riguarda probabilmente tutti gli RNA messaggeri 

che subiscono splicing alternativo ed è perciò capace di cambiare molti 

equilibri fisiologici di isoforme – fino a 30% dei geni umani esprimono più 

di una isoforma. Visto che il danno mitocondriale è importante nella patogenesi 

di varie malattie neurodegenerative, fra le quali la SLA, e visto che 

tale cambiamento di splicing non è osservato in linee cellulari non-neuronali, 

è possibile che questo meccanismo dia un contributo importante per la 

patogenesi di tali malattie. Vogliamo adesso dimostrare se cambiamenti 

simili avvengano pure in modelli murini della SLA, e chiarire la cascata di 

trasduzione del messaggio dall’abbassamento di ATP fino al macchinario 

dello splicing. 


• Analisi del complesso LSm1-mRNP in cellule primarie neuronali silenziate 

per SMN. 

• Analisi dello splicing alternativo in topi SOD G93A, modello murino 

della SLA, in vari tessuti del SNC ed in vari stadi della malattia, per vedere 

se il cambiamento è specifico per il tessuto colpito dalla malattia, cioè il 

midollo spinale, e se si osserva un cambiamento già in stadi pre-sintomatici, 

o solo come una conseguenza della degenerazione. 

• Analisi di varie cascate di chinasi per individuarne quella che trasmette 

il segnale del danno mitocondriale al macchinario dello splicing. Tale cascata 

di chinasi sarà un potenziale bersaglio per una strategia farmaceutica mirata 

a rallentare il progresso della malattia. 

C.2.2 –Alterazioni della morfologia corticale e spinale e modificazioni 

delle funzioni cognitive e motorie nel topo G93A, un modello 

murino della sclerosi laterale amiotrofica (Martine Teule-Ammassari) 



Parole chiave: Sclerosi Laterale Amiotrofica; Neurodegenerazione. 

Descrizione 

I sistemi di memoria, intesi come operazioni mnesiche specifiche a carico 

di circuiti anatomici circoscritti, sono stati a lungo considerati come delle 

unità funzionali indipendenti. Più recentemente, è stato osservato che i sistemi 

di memoria possono essere considerati come delle unità funzionali interattive 

poiché lesioni a carico di un sistema non solo lasciano inalterate operazioni 

dipendenti da un altro sistema ma possono anche incrementarle. Abbiamo 

quindi ipotizzato che l’analisi delle capacità di memoria e apprendimento 

residue o paradossalmente migliorate in pazienti o modelli animali di disfunzione 

cognitiva poteva fornire dei marcatori precoci della patologia. In quest’ambito 

abbiamo dimostrato che il topo Tg2576, considerato come un 

2007 411


modello animale della malattia di Alzheimer in quanto sovra-esprime la proteina 

mutata APP (swedish mutation), mostra alterazioni cognitive specificamente 

riconducibili ad una disfunzione ippocampica ma realizza, tuttavia, 

delle prestazioni superiori a quelle registrate negli animali wild-type in compiti 

striato-dipendenti. Intendiamo estendere l’analisi dell’interazione fra 

sistemi di memoria a patologie neurodegenerative quali la sclerosi laterale 

amiotrofica (utilizzando il topo G93A+/+) che sembra determinare un’alterazione 

delle funzioni esecutive legate alla corteccia frontale mentre operazioni 

ippocampo-dipendenti (memoria spaziale, condizionamento al contesto) sono 

paradossalmente migliorate. 


Sebbene i deficit motori e la neurodegenerazione dei motoneuroni spinali 

del topo G93A, un modello murino della forma sclerosi laterale amiotrofica, 

siano stati ampiamente descritti, esistono poche evidenze relative al loro 

profilo cognitivo e alla neurodegenerazione dei motoneuroni corticali. Dati 

recenti della letteratura rivelano un interesse crescente per i fenomeni di 

neurodegenerazione in varie aree del sistema nervoso centrale e, in particolare, 

per le loro modalità di sviluppo dalla fase pre-sintomatica alla fase sintomatica. 

Questo interesse è largamente dovuto al fatto che i pazienti SLA 

mostrano disturbi cognitivi specifici a carico delle funzioni esecutive, funzioni 

mediate da aree corticali prefrontali (infra-limbica e pre-limbica: 

IL/PL) molto vicine all’area motoria (M1). 

Il nostro progetto è quello di effettuare uno studio longitudinale delle 

funzioni esecutive e della morfologia di neuroni cortico-frontali nel topo 

G93A e di condurre, in parallelo, un’analisi della morfologia dei neuroni spinali 

allo scopo di evidenziare il sito primario di neurodegenerazione. Per 

quanto riguarda le funzioni esecutive, ci siamo interessati ad un indice di 

flessibilità comportamentale quale la resistenza all’estinzione di un riflesso 

di paura (fear conditioning extinction). Per quanto riguarda la neuromorfologia, 

abbiamo analizzato la struttura fine dei neuroni piramidali nelle aree 

IL/PL e nella area M1 mediante impregnazione di Golgi. Questi studi sono 

stati effettuati nell’animale adulto pre-sintomatico (3 mesi). 

I nostri dati hanno evidenziato una perseverazione della risposta condizionata 

nei topi G93A insieme ad anomalie strutturali nelle aree della corteccia 

prefrontale esaminate. In particolare, abbiamo osservato che il topo 

G93A perseverava notevolmente nel manifestare una risposta di immobilità 

alla presenza di uno stimolo condizionato (nel nostro caso un suono neutro 

associato ad uno shock durante la fase di condizionamento) contrariamente 

al topo wild-type che estingueva rapidamente la risposta condizionata. 

Parallelamente, l’analisi morfologica ha rivelato l’esistenza di modificazioni 

strutturali precoci associate alla mutazione Cu/Zn SOD1. Queste modificazioni 

consistevano in una riduzione della ramificazione dei dendriti basali 

(branching) e nella presenza di un maggior numero di spine dendritiche 

immature. È interessante sottolineare che queste alterazioni sono apparse 

estremamente simili nelle aree IL/PL e M1 mentre non sono state riscon- 

412 2007


trate nella corteccia visiva. Nel loro insieme i nostri dati sottolineano la presenza 

di alterazioni pre-sintomatiche a carico delle funzioni esecutive nei 

topi G93A, insieme alla presenza di anomalie strutturali in corteccia prefrontale 

a sostegno di una locale diminuzione di connettività nei circuiti 

cortico-frontali. 


Stiamo attualmente lavorando al perfezionamento di tecniche di immunoistochimica 

per valutare lo stato di connettività e di maturazione di spine 

anche a livello del midollo spinale: nello specifico, l’uso di sonde molecolari 

come il DiA (4-Di-16-ASP (4-(4-(dihexadecylamino)styryl)-N-methylpyridinium 

iodide)) da applicare su campioni di tessuto trattati con anticorpi che 

marcano selettivamente i motoneuroni, per evidenziare e studiare facilmente 

le terminazioni sinaptiche e ramificazioni dendritiche neuronali sia a livello 

spinale che centrale. Tale metodo ci permetterà di approfondire la natura e la 

progressione del deficit cognitivo su più momenti temporali: svezzamento (3 

settimane), età adulta presintomatica (3 mesi), età adulta sintomatica (4-5 

mesi). Implementando gli studi comportamentali già sperimentati, intendiamo 

definire il “ time course ” della degenerazione, e il suo rapporto di progressione 

tra livello spinale e corticale. 

C.2.3 – Basi molecolari e cellulari della sindrome dell’X fragile 

(Claudia Bagni) 



Parole chiave: Sindrome X Fragile; Gene FMR1; Ritardo mentale. 

Altri Enti coinvolti: Università Cattolica Sacro Cuore, Roma; Division 

of Neuroscience, University of Edinburgh, Edinburgh, UK; Wellcome Trust 

Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire, UK. 

Descrizione 

La Sindrome dell’X Fragile è la forma più frequente di ritardo mentale 

ereditario legata al malfunzionamento del gene FMR1 situato sul cromosoma 

X. Il quadro clinico consiste in un ritardo mentale di grado variabile, da 

moderato a severo, e da una serie di caratteristiche fisiche quali dismorfie del 

volto, macro-orchidismo nei maschi e lassità dei legamenti. 

FMRP appartiene alla famiglia delle proteine che legano l’RNA ed è stata 

implicata nel controllo traduzionale alle sinapsi. Non è ancora chiaro come 

l’assenza di un regolatore tradizionale come FMRP possa portare ad un deficit 

nell’apprendimento e nella memorizzazione e quindi al ritardo mentale osservato 

nei pazienti affetti dalla sindrome. 

Poiché ad oggi sono stati isolati soltanto alcuni RNA messaggeri regolati da 

FMRP è di primaria importanza estendere questo studio al fine di caratterizzare 

il complesso ribonucleoproteico in cui FMRP esercita una azione regolativa. 

2007 413



Tra gli RNA messaggeri in grado di interagire con la proteina FMRP 

abbiamo identificato l’mRNA codificante per la proteina PSD-95. In cellule neuronali 

ippocampali, in assenza di FMRP, l’mRNA per PSD-95 ha una vita media 

notevolmente ridotta. Questo potrebbe spiegare i fenomeni di non corretta plasticità 

sinaptica riscontrata nei pazienti e nel modello murino per la Sindrome. 

Abbiamo inoltre identificato la sequenza nucleotidica presente sul 3’UTR dell’mRNA 

per PSD-95 responsabile dell’interazione con FMRP e caratterizzato il 

dominio di FMRP responsabile di questa interazione. Infine, abbiamo dimostrato 

che la stabilità dell’mRNA di PSD-95 è regolato da attività sinaptica. Questi 

studi sono oggetto di un manoscritto spedito alla rivista Nature Neuroscience. 

Abbiamo inoltre caratterizzato la particella FMRP-mRNP durante lo sviluppo 

di cellule ippocampali e corticali e dimostrato che successivamente a 

stimolazione sinaptica la particella FMRP-mRNP si localizza nella regione 

postsinaptica per poi rilasciare, molto probabilmente, gli mRNA repressi traduzionalmente. 

Questi studi sono oggetto di una pubblicazione accettata su 

Molecular and Cellular Neuroscience. 


• Caratterizzazione del complesso FMRP che regola la stabilità dell’mRNA 

di PSD-95. 

• Caratterizzazione del complesso FMRP che regola la traduzione degli 

mRNA alle sinapsi. 

C.2.4 – Analisi del ruolo della chinasi Mutata nell’Atassia Telangiectasia 

(ATM) nella morte cellulare programmata, 

nella neurodegenerazione e nel controllo 

della stabilità delle proteine (Daniela Barilà) 



Parole chiave: Atassia Telangiectasia, ATM; Apoptosi; p53; Recettore di 

morte Fas; Ubiquitinazione; Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA). 

Descrizione 

L’obiettivo dei nostri studi è definire i meccanismi molecolari con cui la 

serina/treonina chinasi ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) la cui assenza di 

funzione è associata allo sviluppo di una patologia genetica rara, l’Atassia 

Telangiectasia (AT), contribuisce al controllo della morte cellulare programmata. 

I pazienti AT manifestano precocemente atassia cerebellare, telangiectasia 

e difetti a carico del sistema immunitario che comprendono immunodeficienza 

ed elevata predisposizione allo sviluppo di linfomi e leucemie. ATM 

ha un ruolo fondamentale nella risposta a stress che generano danno al DNA 

414 2007


ed in particolare rotture a doppio filamento. Tali danni sono prodotti da 

radiazioni ionizzanti (IR), in seguito a forti stress ossidativi, da agenti radiomimetici 

tra cui molti chemioterapici, ma anche da eventi fisiologici come la 

ricombinazione VDJ delle immunoglobuline a carico delle cellule del sistema 

immunitario. In ogni caso, l’attivazione di ATM è necessaria per segnalare il 

danno ed attivare una risposta che prevede il blocco del ciclo cellulare e il 

riparo del DNA, oppure l’induzione della morte cellulare programmata. 

Entrambe le risposte sono controllate dall’attività chinasica di ATM che ha 

come substrati proteine importanti nel controllo del ciclo cellulare e dell’apoptosi. 

Da diversi anni il nostro laboratorio studia la risposta apoptotica indotta 

da attivazione del recettore di morte Fas, risposta che ha un ruolo importante 

nel sistema immunitario. Dal momento che il sistema immunitario è seriamente 

compromesso nei pazienti AT, il primo obiettivo che ci siamo posti è 

definire il possibile ruolo di ATM nell’apoptosi indotta da Fas. 

Inoltre, visto il coinvolgimento importante di ATM nel controllo della 

risposta apoptotica in risposta a stress e considerato che l’alterazione di questa 

risposta è spesso indicata come causa della degenerazione neuronale 

associata a diverse patologie neurodegenerative, ci proponiamo di indagare 

se ATM viene attivata e partecipa alla traduzione del segnale indotta in 

alcuni modelli sperimentali di tali patologie. In particolare in un modello 

murino di Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è stato recentemente descritto 

un’aberrante fosforilazione ed accumulo di uno dei substrati fondamentali di 

ATM, p53, un’importante modulatore del ciclo cellulare e dell’apoptosi. Pertanto 

verificheremo se in tale sistema è presente un’attivazione aberrante di 

ATM e in caso positivo, ne definiremo il contributo nella degenerazione dei 

motoneuroni. 


L’obiettivo della nostra ricerca è definire il ruolo di ATM nella morte cellulare 

programmata indotta da Fas, un programma apoptotico fondamentale 

nel sistema immunitario, seriamente compromesso nell’AT. Utilizzando linee 

linfoblastoidi derivate da pazienti AT o da individui sani di controllo abbiamo 

dimostrato che cellule AT sono fortemente resistenti alla morte indotta da 

Fas. Partendo dalle cellule AT abbiamo generato tre importanti linee cellulari: 

1) ricostituite per l’espressione di ATM AT-ATM-wt; 2) ricostituite per 

l’espressione di una forma di ATM cataliticamente inattiva, AT-ATM-Kin-; 3) 

transfettate con un vettore vuoto di controllo, AT-pcDNA3. Utilizzando queste 

linee abbiamo quindi confermato che l’attività chinasica di ATM sensibilizza 

le cellule alla morte indotta da Fas. 

Analizzando il profilo di espressione dei componenti centrali della via di 

trasduzione del segnale a valle di Fas, abbiamo dimostrato che tutte le nostre 

linee cellulari esprimono livelli comparabili del recettore Fas e di Caspasi-8, la 

caspasi iniziatrice assolutamente necessaria per l’esecuzione di questa risposta 

apoptotica. Sorprendentemente e nonostante i livelli di Caspasi -8 siano 

del tutto indipendenti dalla presenza e dall’attività di ATM, la sua attivazione è 

2007 415


fortemente inibita nelle cellule AT o in quelle ricostituite con ATM cataliticamente 

inattivo, suggerendo quindi che l’attività di ATM sia in grado di modulare 

l’attivazione di Caspasi-8. Il principale inibitore dell’attivazione di 

Caspasi-8 è FLIP, che ne impedisce l’attivazione competendo per il reclutamento 

al recettore Fas. Abbiamo dimostrato che livelli proteici di FLIP sono 

significativamente più elevati in cellule AT, coerentemente con la loro resistenza 

all’apoptosi indotta da Fas e con la ridotta attivazione di Caspasi-8. 

Inoltre l’attivazione di ATM da IR o da radiomimetici induce l’abbassamento 

dei livelli di FLIP. Alcune evidenze sperimentali suggeriscono che ATM possa 

modulare l’ubiquitinazione e quindi la stabilità proteica di FLIP. 

Questo studio dimostra quindi un coinvolgimento diretto di ATM nella 

risposta apoptotica trasdotta dal recettore Fas e suggerisce quindi un nuovo 

meccanismo alla base dell’immunodeficienza e dell’alta incidenza di linfomi e 

leucemie caratteristici dell’AT. 


• Analisi del ruolo del controllo ATM-dipendente dei livelli di FLIP nello 

sviluppo dei linfomi di Hodgkin. 

• Analisi del meccanismo che sottende alla regolazione dei livelli proteici 

di FLIP mediata da ATM. 

• Identificazione di altre proteine la cui ubiquitinazione e stabilità sono 

modulate da ATM. 

• Analisi dell’esistenza della modulazione ATM dipendente dei livelli di 

alcune proteine nel sistema nervoso. 

• Analisi dell’attività di ATM in un modello murino di SLA. 

C.2.5 –Alterazioni funzionali nella attività elettrica 

dei neuroni dopaminergici della sostanza nera pars compacta: 

ruolo delle afferenze sinaptiche estrinseche (Nicola Berretta) 



Parole chiave: Parkinson; Sostanza nera; Neurotrasmettitori. 

Descrizione 

I neuroni dopaminergici della Sostanza Nera pars compacta (SNc) svolgono 

un ruolo essenziale nel controllo motorio, tale per cui una loro 

degenerazione costituisce la causa principale dei disturbi motori associati a 

disfunzioni extrapiramidali come quelli tipici del Morbo di Parkinson. Le alterazioni 

funzionali dell’eccitabilità di questi neuroni si riflettono in modificazioni 

nell’entità e nella modalità di rilascio di dopamina (DA) nelle aree di 

proiezione, infatti è stato osservato che anche delle modificazioni nelle modalità 

di scarica dei neuroni dopaminergici possono influire sostanzialmente 

sulla quantità di DA rilasciata nel Nucleo Striato. Da ciò si evince quanto le 

416 2007


afferenze sinaptiche a questi neuroni possano giocare un ruolo determinante 

nel modificare le loro proprietà di scarica e dunque la loro funzionalità nell’ambito 

di tutto il sistema dei gangli della base. 

Tra le afferenze estrinseche, le principali sono di natura inibitoria 

GABAergica, provenienti soprattutto dallo Striato e dal Pallido, tuttavia esiste 

anche una consistente afferenza di tipo eccitatorio glutammatergico, soprattutto 

dal Nucleo Subtalamico e dal Nucleo Peduncolopontino. 

Molti studi sono stati condotti sull’azione postsinaptica di queste afferenze, 

ma poco è noto sull’azione che il GABA ed il glutammato svolgono a 

livello presinaptico. D’altra parte è presumibile ipotizzare che queste afferenze 

possano essere sottoposte ad una fine modulazione nella loro efficacia, e che 

sia proprio attraverso spostamenti nel bilanciamento tra eccitazione ed inibizione 

che i neuroni dopaminergici modifichino la loro risposta funzionale 

nelle diverse condizioni fisiologiche e patologiche. 

I meccanismi sottostanti la modulazione presinaptica di rilascio di trasmettitore 

sono da lungo tempo oggetto di studio ed appare chiaro come questa 

possa esplicarsi sia attraverso meccanismi di modificazione nella permeabilità 

dei canali Ca 2+ voltaggio-dipendenti presenti sui terminali sinaptici, la 

cui apertura presiede al rilascio delle vescicole sinaptiche, sia attraverso meccanismi 

indipendenti dall’ingresso di calcio, per azione diretta sull’apparato 

che presiede alla fusione delle vescicole alla membrana presinaptica. D’altra 

parte, comprendere con maggiore precisione quali siano i meccanismi che 

presiedono tale modulazione può risultare particolarmente importante qualora 

si vogliano definire target specifici per interventi farmacologici, volti a 

ristabilire un corretto bilanciamento del rapporto eccitazione-inibizione degli 

input ai neuroni dopaminergici. 


Nel corso di questo anno abbiamo rivolto la nostra attenzione allo studio 

dei meccanismi di modulazione presinaptica del rilascio sinaptico di GABA su 

cellule dopaminergiche della sostanza nera pars compacta (SNc), in seguito a 

stimolazione di recettori GABA B 

e metabotropici glutammatergici (mGluRs), 

con tecniche elettrofisiologiche su preparati slice di mesencefalo ventrale. La 

stimolazione di ambedue i tipi recettoriali con baclofen e con AP4 determina 

una riduzione nella probabilità di rilascio sinaptico di GABA, misurato come 

riduzione nella frequenza delle correnti postsinaptiche inibitorie spontanee 

(sIPSCs). Abbiamo poi analizzato le correnti sinaptiche spontanee in miniatura 

(mIPSCs), perfondendo il preparato con TTX e cadmio e abbiamo potuto 

verificare una differenza nell’azione dei due agonisti recettoriali. Se infatti la 

perfusione con baclofen era ancora in grado di ridurre la frequenza dei 

mIPSCs, l’AP4 risultava invece inefficace. 

Questi risultati suggeriscono dunque che, mentre la stimolazione dei 

recettori mGluRs di tipo III riduce la probabilità di rilascio di GABA agendo 

sui canali voltaggio dipendenti, attivati durante l’insorgenza dei potenziali 

d’azione presinaptici, la stimolazione dei recettori GABA B 

raggiunge lo stesso 

obiettivo di inibizione presinaptica agendo sulle vie metaboliche successive 

2007 417


all’ingresso di calcio nel terminale presinaptico, presumibilmente sulla machinery 

coinvolta nel rilascio vescicolare. 


Allo scopo di proseguire la nostra analisi dei meccanismi di inibizione 

presinaptica mediata dai recettori GABA B 

e mGluRs del gruppo III, verranno 

condotti studi volti a confermare la differente azione di questi tipi recettoriali, 

verificando in particolare l’ipotesi secondo cui i recettori GABA B 

agirebbero a 

livello dei meccanismi di rilascio vescicolare calcio-indipendente, mentre i 

recettori mGluRs-III su quello di tipo calcio-indipendente. 

A tal fine verificheremo la possibilità che l’agonista mGluRs AP4 (100 mM) 

sia in grado di deprimere il rilascio di GABA in presenza di TTX (1 mM), qualora 

sia presente nel mezzo di perfusione anche bario (1 mM). È infatti ipotizzabile 

che la depolarizzazione dei terminali associata alla presenza di questo 

catione permetta l’ingresso di calcio nel terminale, col risultato di ottenere un 

rilascio vescicolare dipendente dall’apertura di canali calcio voltaggio dipendenti 

(VDCCs), pur in presenza di TTX. 

In aggiunta, eseguiremo esperimenti in presenza di ionomicina (2 mM). 

Questa tossina promuove un rilascio vescicolare calcio-dipendente, pur senza 

attivare canali VDCCs. Verificheremo dunque l’azione dell’AP4 e dell’agonista 

dei GABA B 

baclofen (10 mM) sulle correnti sinaptiche GABAergiche evocate da 

questa tossina. Analogamente, ripeteremo gli stessi esperimenti in presenza di 

a-LTX (0.3 nM), peptide in grado di promuovere un rilascio vescicolare calcio-indipendente. 

Sulla base della nostra ipotesi è presumibile che l’AP4, 

agendo a livello dei canali VDCCs, sia inefficace in presenza di ionomicina e 

di a-LTX, mentre il baclofen, agendo a valle dell’ingresso di calcio, dovrebbe 

essere in grado di inibire il rilascio sinaptico di GABA in ambedue queste condizioni 

sperimentali. 

In aggiunta, verificheremo se questi due meccanismi di inibizione presinaptica 

si verifichino a livello degli stessi terminali GABAergici oppure esista 

una segregazione funzionale tra terminali sensibili all’AP4 ed al baclofen. 

Questo obiettivo potrà essere raggiunto mediante esperimenti di occlusione. 

C.2.6 –Ruolo delle Scaffolding Proteins e del recettore NMDA 

nella plasticità sinaptica corticostriatale in modelli sperimentali 

di malattie neurodegenerative (Paolo Calabresi) 



Parole chiave: Plasticità sinaptica striatale; Scaffolding proteins; Recettore 

NMDA. 

Descrizione 

Nelle sinapsi del sistema nervoso centrale i recettori NMDA sono raggruppati 

in una frazione subcellulare altamente organizzata, la Post Synaptic Density 

418 2007


(PSD), dinamicamente regolata grazie all’aggregazione dei recettori ionotropici 

glutammatergici con le proteine di adesione e gli elementi di trasduzione del 

segnale. È noto che la funzionalità del recettore NMDA è modulata da processi 

di fosforilazione e che la fosforilazione di subunità specifiche del recettore 

risulta modificata in condizioni patologiche. Le proprietà fisiologiche dei recettori 

NMDA sono determinate non solo dalla composizione delle loro subunità e 

dalla loro localizzazione cellulare, ma anche dall’interazione proteica che 

governa la cascata di eventi innescata dall’attivazione recettoriale. Tra queste, la 

CaMKII è direttamente legata alla regione c-terminale delle subunità NR2A e 2B 

del complesso recettoriale NMDA competendo, a livello della subunità NR2A, 

con il legame con PSD-95. Il complesso proteico postsinaptico associato al recettore 

NMDA rappresenta un elemento chiave nella patogenesi delle modificazioni 

sinaptiche a lungo termine e delle anormalità motorie in modelli sperimentali di 

molte malattie neurodegenerative tra cui il Morbo di Parkinson (PD). 

Tra le “ scaffolding proteins ” i componenti della famiglia proteica delle 

MAGUK (membrane-associated guanylate kinase), come la SAP97 e la 

SAP102, sono stati coinvolti nei meccanismi molecolari che regolano il “ trafficking 

” e il “ clustering ” dei recettori ionotropici del glutammato (Glu) al 

compartimento postsinaptico. 

Sul terminale presinaptico la “ cytomatrix assembled at the active zone ” 

(CAZ) rappresenta il sito di rilascio del neurotrasmettitore ed è una zona altamente 

organizzata per il “ trafficking ” delle vescicole sinaptiche (SV). In questa 

zona “ Piccolo ” e “ Bassoon ” sono due proteine che svolgono un ruolo 

chiave nel trasporto delle SV nella zona attiva e nella loro fusione con la 

membrana sinaptica per il rilascio di glutammato dal terminale corticostriatale. 

Nessuno studio ha finora chiaramente dimostrato i meccanismi alla base 

dell’attività di questa e di altre SCAFFs nello striato, area di particolare interesse 

clinico in quanto sede dei più importanti fenomeni di plasticità sinaptica 

e costituita da popolazioni neuronali selettivamente vulnerabili alla neurodegenerazione. 

Uno studio più approfondito della trasmissione sinaptica 

striatale dal punto di vista elettrofisiologico sarebbe pertanto necessario per 

correlare i deficit cognitivi ad alterazioni neurofisiologiche ed investigare a 

fondo sui meccanismi alla base dei danni causati dai deficit trasmettitoriali 

dovuti alla mancata funzione delle SCAFFs. 


Recentemente, abbiamo iniziato lo studio in vitro delle proteine MAGUK 

che permettendo il trafficking e la stabilizzazione in membrana delle subunità 

del recettore NMDA possono avere un ruolo nell’alterazione della plasticità 

sinaptica bidirezionale dei neuroni spinosi striatali nel corso dello sviluppo 

delle discinesie indotte da trattamento cronico con L-DOPA in ratti emiparkinsoniani. 

Utilizzando rispettivamente i peptidi sintetici TAT2B e TAT2A 

siamo in grado di impedire l’accesso e la stabilizzazione nel complesso NMDA 

delle due subunità NR2B e NR2A. 

Mentre il trattamento cronico con L-DOPA è in grado di ripristinare un 

normale LTP in tutti gli animali parkinsoniani trattati (dys e non dys), gli ani- 

2007 419


mali discinetici che mostrano questa iperattività motoria non sono in grado di 

depotenziare la sinapsi ai livelli di controllo in seguito al protocollo di stimolazione 

a bassa frequenza (LFS), segno di una correlazione importante tra 

l’iperattività motoria e l’iperattivazione sinaptica del recettore NMDA e di 

un LTP non depotenziabile. Quindi, negli animali trattati cronicamente con L- 

DOPA (dys e non dys) abbiamo applicato dopo l’induzione dell’LTP rispettivamente 

il peptide TAT2A e TAT2B prima del protocollo di depotenziamento per 

studiare se la manipolazione artificiale delle subunità del recettore NMDA 

può replicare le alterazioni molecolari e comportamentali analizzate nei precedenti 

lavori descritti. 

È di notevole interesse che, così come in vivo il TAT2B era in grado di 

indurre movimenti discinetici in animali che non ne avevano ancora mostrati 

e livelli di NR2B simili a quelli misurati nei ratti discinetici, la sua applicazione 

in vitro prima della LFS nei neuroni registrati da animali non dys è in 

grado di bloccare l’induzione del normale depotenziamento. Al contrario, il 

TAT2A è in grado di indurre un normale depotenziamento nei neuroni spinosi 

registrati dai ratti dys che normalmente non mostrano questo fenomeno fisiologico 

di “ resettaggio ” della sinapsi. 

In conclusione, risulta evidente il ruolo fondamentale delle MAGUK nel 

corretto assemblaggio del recettore NMDA e che l’insorgenza delle discinesie 

sia correlata ad una modificazione della localizzazione delle subunità nel 

complesso recettoriale nel compartimento postsinaptico. 


• Analisi della plasticità sinaptica bidirezionale delle terminazioni corticostriatali 

dopo l’applicazione in vitro di specifici peptidi (TAT2A e 2B) ad 

azione disaccoppiante delle varie subunità del recettore NMDA. A tal fine, 

effettueremo registrazioni elettrofisiologiche intracellulari da fettine corticostriatali 

di ratti di controllo con TAT2A e TAT2B in grado di impedire alle 

“ scaffolding proteins ” di trasportare le diverse subunità del recettore NMDA 

al complesso recettoriale nella PSD. 

• Confronto tra l’effetto dei peptidi sintetici TAT sulla plasticità sinaptica 

dei neuroni spinosi striatali con l’azione di inibitori specifici delle subunità 

NR2A e 2B. 

• Sul terminale presinaptico la “ cytomatrix assembled at the active 

zone ” (CAZ) rappresenta il sito di rilascio del neurotrasmettitore ed è una 

zona altamente organizzata per il “ trafficking ” delle vescicole sinaptiche 

(SV). In questa zona “ Piccolo ” e “ Bassoon ” sono due proteine che svolgono 

un ruolo chiave nel trasporto delle SV nella zona attiva e nella loro fusione 

con la membrana sinaptica per il rilascio di glutammato dal terminale 

corticostriatale. Risultati preliminari ottenuti da test comportamentali ed elettrofisiologici 

indicano che la proteina Bassoon (BSN) ha ruoli differenti nella 

modulazione della plasticità sinaptica delle diverse popolazioni neuronali 

dello striato suggerendo una sua funzione regolatoria nell’organizzazione 

delle sinapsi glutammatergiche striatali. 

420 2007


• Studio del ruolo delle alterazioni nel rilascio delle vescicole sinaptiche 

dal terminale corticostriatale presinaptico in topi KO per “ Bassoon ” sulle 

proprietà elettrofisiologiche nei vari sottotipi neuronali presenti nello striato 

(spiny neurons e fast-spiking). In questi animali KO studieremo, inoltre, 

l’eventuale alterazione della plasticità sinaptica corticostriatale e del suo depotenziamento 

nei due differenti tipi neuronali striatali. 

C.2.7 – Studio delle alterazioni indotte dalle Cu,Zn 

superossido dismutasi mutanti 

associate alla sclerosi laterale amiotrofica 

di tipo familiare (Maria Teresa Carrì) 



Parole chiave: Sclerosi Laterale Amiotrofica; Superossido Dismutasi; Neurodegenerazione; 

Neuroinfiammazione. 

Altri Enti coinvolti: Università di Sassari. 

Descrizione 

Obiettivo del progetto è di indagare sulle modalità attraverso cui le mutazioni 

di superossido dismutasi (SOD1) tipiche di pazienti affetti da sclerosi laterale 

amiotrofica (SLA) causano la comparsa del fenotipo di danno motoneuronale 

nei pazienti. Recenti studi indicano che le SOD1 mutanti possono essere 

raggruppate almeno in due sottoclassi per quello che riguarda le loro proprietà 

chimico-fisiche [Valentine et al. (2005) Annu Rev Biochem 74: 563-593] e che i 

danni derivanti dall’aggregazione e/o dalla nuova funzione pro-ossidante di queste 

proteine siano mediati da un dialogo molecolare tra cellule neuronali e non 

neuronali. In particolare, la produzione di citochine neurotossiche da parte 

delle cellule microgliali ed astrocitarie sembra avere un forte ruolo patologico 

nella morte neuronale. Indicazioni in questo senso derivano dall’osservazione 

che l’attivazione di microglia e astrociti è una caratteristica di tutti i pazienti 

affetti da SLA. Inoltre, la produzione di TNF, IL-1, iNOS da parte delle cellule 

gliali aggrava l’effetto tossico dei mutanti della SOD1, in diversi modelli sperimentali 

di SLA. Questi fattori solubili fanno parte della risposta immunitaria 

innata e sono in gran parte sotto il controllo del fattore di trascrizione NF-kB. 

Con questo programma, ci proponiamo di studiare ulteriormente il dialogo 

molecolare tra cellule neuronali e non neuronali in un nuovo modello 

murino in cui la componente neuroinfiammatoria viene prevenuta mediante 

inibizione del fattore di trascrizione NF-kB mediante espressione della 

variante costitutiva dominante del suo inibitore IkBalfa. 

In particolare, in questi modelli si affronterà uno studio dell’induzione di 

fattori correlati con la morte cellulare per via mitocondrio-dipendente ed una 

dettagliata analisi dei segnali scambiati fra cellule neuronali e non neuronali. 

Lo studio sarà completato dall’esame delle proprietà biochimiche della 

frazione di proteina mutata localizzata all’interno del mitocondrio e dei meccanismi 

che ne inducono la compartimentalizzazione. 

2007 421



Obiettivo di questa ricerca è di indagare sulle modalità attraverso cui le 

mutazioni di superossido dismutasi (SOD1) tipiche di pazienti affetti da sclerosi 

laterale amiotrofica (SLA) causano la comparsa del fenotipo di danno 

motoneuronale nei pazienti. 

In particolare, la nostra attenzione si è focalizzata sulla analisi dei segnali 

scambiati fra cellule neuronali e non neuronali nel dialogo molecolare che 

sottende la patogenesi della SLA. 

Utilizzando un modello cellulare costituito dalla linea motoneuronale 

murina NSC34 trasfettata per l’espressione inducibile di diverse FALS-SOD1 

mutanti, abbiamo dimostrato che un trattamento che mima la situazione di 

neuroinfiammazione presente nella SLA (trattamento con citochine quali 

interferon gamma e tumor necrosis factor alfa) è in grado di indurre un 

aumento di accumulo delle proteine mutanti nel compartimento mitocondriale. 

Questo accumulo si riflette in un accresciuto deficit energetico che 

innesca processi di morte neuronale. 

Parallelamente, abbiamo prodotto due nuove linee di topi transgenici nei 

quali l’attivazione del fattore di trascrizione NF-kB è impedita dalla espressione 

costitutiva del suo inibitore IkBalfa selettivamente negli astrociti o nella microglia. 

Queste linee murine, che non presentano un chiaro fenotipo tossico e sono 

attualmente in corso di caratterizzazione, saranno disponibili per l’incrocio con 

topi transgenici che esprimono la SOD1 mutante G93A, allo scopo di valutare la 

rilevanza del processo neuroinfiammatorio nella patogenesi della SLA. 


• Analisi dei meccanismi che sottendono all’induzione di localizzazione 

mitocondriale delle SOD1 mutate in cellule neuronali trattate con citochine 

infiammatorie. 

• Caratterizzazione delle linee di topi transgenici in cui l’attivazione di 

NF-kB è inibita selettivamente negli astrociti o nella microglia mediante 

espressione costitutiva di IkBalfa. 

• Costruzione di due linee di topi doppio transgenici, che esprimono 

SOD1 mutata G93A ubiquitariamente e IkBalfa selettivamente negli astrociti 

o nella microglia. 

• Valutazione degli effetti della inibizione di processi infiammatori sulla 

sopravvivenza del modello murino di SLA. 

C.2.8 –Analisi dello stress e della morte cellulare nella malattia 

di Alzheimer in modelli animali e cellulari di nuova concezione 

(Francesco Cecconi) 



Parole chiave: Alzheimer; Apoptosi; Autofagia; Caspasi; Malattie Neurodegenerative; 

Transgenesi. 

422 2007


Descrizione 

I meccanismi alla base delle neurodegenerazioni sono ancora in gran 

parte sconosciuti. La disfunzione di specifiche regioni del cervello è dovuta 

all’inabilità delle cellule che costituiscono tali regioni. È ora noto che il quadro 

patologico di numerose malattie neurodegenerative è causato da morte 

cellulare inappropriata. Per questo motivo, la comprensione e l’identificazione 

dei mediatori molecolari della morte cellulare programmata nonchè la verifica 

dei loro ruoli nella regolazione della morte rappresentano un passaggio 

essenziale verso la cura di queste malattie. 

Obiettivo del progetto è utilizzare modelli animali e cellulari nei quali 

l’apoptosi o altri meccanismi di morte o sopravvivenza cellulare siano stati 

manipolati geneticamente allo scopo di osservarne, previo incrocio o confronto 

con modelli di neurodegenerazione, la capacità compensativa. 


1. Il morbo di Alzheimer (AD) è una malattia neurodegenerativa progressiva 

per la quale sono stati generati numerosi modelli sperimentali. Sia 

in pazienti che in modelli animali, è sempre più chiaro che la disfunzione 

neuronale ha luogo assai prima della deposizione delle placche amiloidi e 

della morte stessa dei neuroni. Il processo definito “ apoptosi ” è il percorso 

metabolico più studiato di morte cellulare. Molti dati confermano che le 

molecole dell’apoptosi sono associate al processamento del precursore amiloide 

APP ed alla morte ultima dei neuroni. Stiamo valutando la possibilità 

che un’attivazione precoce dell’apoptosi (alle sinapsi) possa indurre progressiva 

degenerazione sinaptica e progressiva perdita di connessione, una 

delle caratteristiche cliniche più significative della prima fase dell’AD, 

caratterizzata dall’assenza di demenza palese e denominata ‘leggero deficit 

cognitivo’. 

2. L’autofagia è un processo catabolico atto alla degradazione di proteine 

ed organelli in una grande varietà di organismi. Nei vertebrati, questo processo 

agisce come un meccanismo pro-morte in diverse condizioni fisiopatologiche, 

compresa la neurodegenerazione ed il cancro. Nonostante ciò, i ruoli 

dell’autofagia nella neurodegenerazione sono ancora oscuri. Abbiamo recentemente 

identificato Ambra-1 (molecola attivatrice dell’autofagia mediata da 

Beclin-1) come una nuova grande proteina che regola l’autofagia e gioca un 

ruolo cruciale nell’embriogenesi. Abbiamo infatti scoperto che Ambra-1 è un 

regolatore positivo del programma di autofagia dipendente da Beclin-1 

mediante esperimenti di interferenza dell’RNA e sovraespressione in vitro e, 

soprattutto, che l’inattivazione di Ambra-1 in embrioni di topo porta a difetti 

gravi della neurulazione, associati a disfunzione dell’autofagia, proliferazione 

sbilanciata, eccessiva morte cellulare ed accumulo di proteine ubiquitinate. 

Poiché quest’ultimo fenomeno è un segno distintivo dell’inattivazione condizionale 

dell’autofagia nel sistema nervoso adulto, che culmina in una grave 

forma di neurodegenerazione, ci proponiamo di studiare i ruoli svolti da 

Ambra-1 nel contesto dell’AD. 

2007 423



• Analisi dei meccanismi che sottendono al trasporto, alla sintesi, all’attivazione 

ed alla funzione dell’apoptosoma alle sinapsi in condizioni fisiologiche 

e nell’AD. 

• Costruzione di una linea murina nella quale il locus Ambra-1 sia inattivato 

in modo selettivo solo nei tessuti nervosi adulti. 

• Analisi dell’autofagia alle terminazioni sinaptiche nell’AD. 

• Studio dei meccanismi molecolari dell’autofagia connessi al network 

molecolare di Ambra-1 in condizioni fisiologiche e patologiche. 

C.2.9 – Strategie terapeutiche per la Corea di Huntington. 

Il ruolo di c-AMP-responsive element (CREB) 

(Francesca Romana Fusco) 



Parole chiave: HD; CREB; Therapy. 

Descrizione 

La comprensione dei meccanismi alla base della vulnerabilità o della 

resistenza dei neuroni striatali ai fenomeni neurodegenerativi della corea di 

Huntington (HD) è di importanza fondamentale per lo studio di strategie terapeutiche. 

Per tale motivo il nostro laboratorio si è in precedenza dedicato a studiare 

la presenza della proteina huntingtina nei principali sottotipi neuronali 

striatali del topo mutante R6/2, modello transgenico di HD. I nostri dati hanno 

confermato, anche nel topo mutante, una particolare ricchezza di huntingtina 

negli interneuroni colinergici, resistenti al danno eccitotossico. L’obiettivo successivo 

è stato quello di indagare la presenza di altre proteine che si sono dimostrate 

importanti nell’HD. La c- AMP-responsive-element (CREB) è una proteina 

regolatrice di varie funzioni cellulari, recentemente dimostrata essere 

coinvolta nei processi degenerativi dell’HD. Il nostro gruppo ha recentemente 

dimostrato una correlazione tra i livelli di CREB e le diverse sottopopolazioni 

neuronali striatali coinvolte nella degenerazione nell’HD (Giampà et al. 2006). 

Il progetto, che avrà durata triennale, sarà rivolto allo studio di strategie 

terapeutiche per l’HD che siano finalizzate all’aumento della CREB nei neuroni 

di proiezione che sono i primi a degenerare nella patologia. La prima parte del 

progetto mirerà allo studio dell’effetto di un inibitore della fosfodiesterasi 4, il 

Rolipram, sull’espressione a livello proteico della CREB nei neuroni di proiezione 

sia nel ratto normale che nel modello eccitotossico da lesione con acido 

quinolinico. Ratti wistar maschi verranno iniettati stereotassicamente con acido 

quinolinico 10mM in anestesia generale, dopo trattamento quotidiano con Rolipram 

a due differenti concentrazioni (0,15 mg/Kg; 1,15 mg/Kg) saranno perfusi 

a diversi time-points e fissati in paraformaldeide 4%. Verranno ottenute sezioni 

di encefalo dello spessore di 40 mm che saranno incubate con un cocktail di 

anticorpi primari diretti contro la CREB e contro la calbindina (CALB). Le 

424 2007


sezioni verranno in seguito incubate con una miscela di appropriati anticorpi 

secondari fluorescenti, montati su vetrini gelatinati e quindi esaminate con un 

microscopio ad epi-illuminazione in fluorescenza e con un microscopio confocale. 

I dati ottenuti ci permetteranno di verificare una possibile strategia terapeutica 

per l’HD rivolta ad intervenire sui livelli di CREB intrastriatale. 


Abbiamo dimostrato che l’inibitore della fosfodiesterasi-4 rolipram è in 

grado di ridurre l’area della lesione striatale eccitotossica e di aumentare 

l’attività della CREB nei neuroni superstiti. È quindi plausibile che l’effetto 

benefico del rolipram da noi dimostrato sia dovuto proprio ad un aumento 

dell’attività di CREB. 


Nel 2007 verrà sviluppata una colonia di topi transgenici ceppo R6/2 il cui 

genotipo verrà caratterizzato mediante PCR. Quando la colonia sarà stabilizzata 

gli animali mutati di 4 settimane verranno trattati con rolipram 1,15 mg/kg o veicolo 

quotidianamente fino al raggiungimento di 12 settimane di età. Gli animali 

verranno sacrificati mediante perfusione transcardiaca ed i loro cervelli verranno 

trattati secondo il nostro protocollo di routine per l’istologia. Le sezioni ottenute 

verranno incubate con anticorpo anti calbindina per evidenziare i neuroni di 

proiezione striatali; inoltre, l’area della lesione verrà misurata sulle sezioni immunoistochimiche 

e su quelle istologiche colorate con Nissl tramite il software in 

dotazione del nostro microscopio confocale Zeiss CSLM510. 

C.2.10 – Recettori metabotropici e ionotropici del glutammato: 

risposte neuronali e canali transienti (TRP) (Ezia Guatteo) 



Parole chiave: Canali TRP; Cellule dopaminergiche; Cellule non dopaminergiche 

mesencefaliche; L-BMAA; Gangli della base; Neurodegenerazione. 

Descrizione 

Durante quest’anno concentreremo la nostra ricerca sul coinvolgimento 

dei recettori ionotropici glutammatergici nella degenerazione dei neuroni 

dopaminergici. A tale riguardo, sia fattori genetici che epigenetici sono ritenuti 

essere responsabili della neurodegenerazione che caratterizza i sintomi 

della malattia di Parkinson (PD). Sebbene la ricerca biomedica abbia cominciato 

a delineare le alterazioni geniche responsabili di alcune forme di PD 

[Polymeropulos et al. (1997) Science 276: 20045-2047], il ruolo dei fattori 

ambientali non è ancora pienamente conosciuto. A tale riguardo, lo scopo 

della presente ricerca è quello di definire i meccanismi fisiopatologici che 

caratterizzano i neuroni dopaminergici quando sono esposti a sostanze presenti 

nell’ambiente aventi potenziale attività neurotossica [Betarbet et al. 

(2000) Nat Neurosci 3: 1301-1306]. 

2007 425


Obiettivi 

Ci proponiamo di eseguire uno studio elettrofisiologico, microfluorometrico 

e morfologico allo scopo di definire le proprietà delle cellule dopaminergiche 

di roditore della sostanza nera parte compatta quando esposte a tossine 

in quantità note e per tempi definiti. La tossina oggetto dello studio sarà la 

L-BMAA (beta-N-methylamino-L-alanine). La L-BMAA, presente nei semi 

della Cycas circinalis, palma di cui si cibano le popolazioni delle isole del 

Pacifico occidentale, stimolerebbe i recettori glutammatergici non-NMDA 

[Durlach et al. (1997) Magnes Res 10(4): 339-353]. La sua specifica tossicità 

per le cellule dopaminergiche ci induce a comprendere i meccanismi neuropatologici 

che essa genera. 

Si cercherà di capire se la cascata di eventi negativi indotta dalla tossina 

nelle cellule dopaminergiche utilizzi meccanismi patologici comuni a quelli 

utilizzati dall’agonista dei recettori metabotropici già studiata in passato nel 

nostro laboratorio. Un probabile evento unificante responsabile, almeno nelle 

fasi iniziali, del danno cellulare indotto dalle sostanze potrebbe essere un 

eccessivo e prolungato aumento dei livelli di calcio citoplasmatico [Brownson 

et al. (2002) J Ethnopharmacol 82(2-3): 159-167], che potrebbe occorrere sia 

per apertura di canali specifici voltaggio- e recettore-dipendenti, che per liberazione 

da stores citoplasmatici e mitocondriali. 

Le informazioni derivanti dal presente studio ci permetteranno di comprendere 

perché i neuroni dopaminergici siano più vulnerabili di altre cellule 

ad alcuni tipi di tossine ambientali ed eventualmente ci permetterà di disegnare 

specifiche strategie preventive e riparative. 


Nel corso dell’anno 2006 abbiamo studiato l’attivazione del recettore 

metabotropo glutammatergico di gruppo I (mGluR I) nei neuroni dopaminergici 

della substantia nigra mediante stimolazione elettrica delle fibre afferenti 

glutammatergiche, anziché mediante applicazione esogena di agonisti selettivi. 

Da studi precedenti era emerso che la sua attivazione produce una corrente 

cationica depolarizzante e un aumento di calcio citoplasmatico. Tale 

corrente è mediata da canali TRP (transient receptor proteins), mentre 

l’aumento di calcio associato è mediato dai canali SOCs (store-operated channels). 

Le due risposte (corrente depolarizzante e aumento di calcio nel citoplasma) 

sono indipendenti, come dimostrato da esperimenti in cui abbiamo 

svuotato gli store intracellulari di calcio o abbiamo bloccato il rilascio 

mediante antagonisti dei recettori IP3 e ryanodina ma la corrente rimaneva in 

entrambi i casi invariata. 

Da esperimenti di RT-PCR su citoplasma di singoli neuroni registrati 

elettrofisiologicamente, è emerso che la maggior parte dei neuroni dopaminergici 

esprimono gli mRNA per i sottotipi TRPC1 e 5; i TRPC3 4 e 6 sono 

espressi solo da alcune sottopopolazioni. Da un punto di vista elettrofisiologico, 

abbiamo visto che, in presenza di antagonisti di recettori glutammatergici 

e gabaergici, attivati dalla stimolazione elettrica (NMDA, AMPA, 

GABA-A e GABA-B, glicina) si evoca una corrente post-sinaptica eccitatoria 

426 2007


(EPSC) avente caratteristiche paragonabili a quelle della corrente attivata 

mediante applicazione esogena dell’agonista selettivo DHPG. In particolare, 

l’EPSC ha un potenziale di inversione intorno a –10 mV, è sensibile a bloccanti 

come SKF96365, acido flufenamico e rutenio rosso, tipici dei canali 

TRP. È inoltre bloccato dall’antagonista selettivo CPCCOEt, indicando che è 

mediato da mGluR I, analogamente alla corrente prodotta dall’agonista 

selettivo DHPG. 


Valutazione del danno eccitossico mediato da L-BMAA (beta-N-methylamino-L-alanine). 

È un aminoacido contenuto nei semi di una palma (Cycas circinalis 

L) di cui si nutrono gli abitanti delle isole del West Pacific tra cui Guam, che 

presentano un elevato rischio per una patologia neurodegenerativa devastante, 

ALS-PDC. Si pensa che provochi un danno eccitotossico ai neuroni mediato da 

un aumento della concentrazione citoplasmatica di calcio [Brownson et al. (2002) 

J Ethnopharmacol 82(2-3): 159], mimando l’effetto di un agonista dei recettori 

glutammatergici non-NMDA [Durlach et al. (1997) Magn Res 10(4): 339]. 

Noi andremo a misurare la concentrazione di calcio e le correnti di membrana 

nei neuroni dopaminergici durante trattamento acuto di fettine di 

mesencefalo con L-BMAA. Inoltre valuteremo il danno eccitotossico dopo 

trattamento prolungato (2, 4, 6 ore), e la funzionalità dei neuroni in risposta 

ai principali neurotrasmettitori. 

Tecniche utilizzate 

Elettrofisiologia – Utilizzeremo le procedure standard già descritte [Guatteo 

et al. (2000) J Neurosci 20(16): 6013; Guatteo et al. (2005) J Neurophysiol 

94(5): 3069-3080] per la preparazione delle fettine acute del mesencefalo di 

topo e ratto. Le registrazioni di patch-clamp sono effettuate su neuroni visualizzati 

mediante un sistema di contrasto differenziale interferenziale a infrarossi 

(IR-DIC), per mezzo di un obiettivo a immersione 40X e una telecamera 

(Hamamatsu, Japan). 

Microfluorimetria – Le misurazioni di [Na+] e [Ca2+] intracellulare verranno 

ottenute da neuroni caricati rispettivamente con SBFI o Fura-2 (0.25 

mM, Molecular Probes) aggiunti alla soluzione di riempimento dell’elettrodo 

di registrazione. La loro eccitazione si realizzerà attraverso luce UV emessa 

da un monocromatore (Till Photonics) a 340 e 380 nm. La luce emessa sarà 

monitorata con un filtro a 500 nm e captata da una camera CCD. 

C.2.11 – Ruolo della tossicità da glutammato in un modello sperimentale 

di Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) (Patrizia Longone) 



Parole chiave: Sclerosi Laterale Amiotrofica; Glutammato; Eccitotossicità. 

Altri Enti coinvolti: Consiglio Nazionale delle Ricerche. 

2007 427


Descrizione 

Il topo transgenico che overesprime la SOD1 umana mutata nella posizione 

93 (G93A) e che, intorno al quarto mese di età, presenta degenerazione 

dei motoneuroni superiori ed inferiori, è considerato attualmente un buon 

modello per lo studio della Sclerosi Laterale Amiotrofica [Gurney et al. (1994) 

Science 17(264): 1772-1775]. 

Sono sempre più numerose le descrizioni cliniche di pazienti SLA, che 

oltre alla principale degenerazione del sistema motorio, presentano anomalie 

nel sistema nervoso centrale accompagnate da vari disturbi cognitivi, e deficit 

fronto-temporale. 

Lo scopo del nostro progetto è di verificare se anomalie di tipo molecolare 

e/o cellulare dei neuroni della corteccia precedono o si sviluppano parallelamente 

alle anomalie dei neuroni spinali e al deficit motorio nel topo G93A. 

Nella patogenesi della SLA il sistema di neurotrasmissione di tipo glutammatergico, 

ricopre un ruolo centrale. In un precedente lavoro abbiamo osservato 

un incremento dell’mRNA e della proteina per la subunità GluR1 del recettore 

AMPA, nell’area ippocampale dei topi G93A [Spalloni et al. (2006) Exp Neurol 

197: 505-514]. Inoltre, in un modello in vitro di colture primarie nuronali, 

abbiamo osservato, in seguito a tossicità con il kainato, una maggiore vulnerabilità 

dei motoneuroni G93A rispetto ai controlli, ma non si è osservata 

invece alcuna differenza nelle cellule corticali G93A rispetto al controllo 

[Spalloni et al. (2004) Neurobiol Dis 15: 340-350; Neuroreport (2004) 15(16): 

2477-2480]. 

Alla luce dei dati finora ottenuti, ci proponiamo di analizzare, in particolare 

nella corteccia motoria dei G93A, i livelli di espressione di proteine coinvolte 

nel pathway glutammatergico (ad es. le subunità dei recettori AMPA, dei 

recettori NMDA, la subunità mGluR5 dei recettori metabotropici) e di proteine 

implicate nel rilascio della vescicola sinaptica. 

Inoltre ci proponiamo di estendere gli studi di eccitotossicità, con 

l’utilizzo dell’agonista NMDA in colture di cellule corticali e di motoneuroni, 

di approfondire i possibili meccanismi molecolari della mortalità neuronale, 

ed infine il relativo ruolo svolto dalle cellule gliali. 


Il nostro obiettivo è stato quello di studiare nel modello di topo transgenico 

G93A, in una fase precedente la comparsa del fenotipo SLA (circa 75 

giorni di età), i livelli di espressione di marker proteici, in corteccia motoria, 

un’area considerata la seconda più colpita dopo il midollo spinale nella SLA. 

In particolare abbiamo analizzato i livelli di espressione delle subunità dei 

recettori glutammatergici ionotropici (NMDA, ed AMPA) e della subunità 

mGluR5 dei recettori metabotropici, in preparazioni di sinaptosomi e nella 

post-synaptic density (PSD) di corteccia motoria da G93A e controlli. 

Dallo studio è risultata, in particolare nella PSD, una sostanziale diminuzione 

della subunità NR2A del recettore NMDA, subunità fondamentale nella 

normale maturazione delle spine dendritiche. Siamo allora andati a vedere se, 

a questo diverso stadio di maturazione della corteccia motoria dei G93A, cor- 

428 2007


rispondessero anche differenti livelli di espressione di proteine fondamentali 

per il rilascio delle vescicole sinaptiche, quindi una anomalia nel release del 

glutammato. Tuttavia, proteine come SNAP-25, synaptophisin, synaptobrevinvamp 

non sembrano variare nei loro livelli di espressione. 

Parallelamente in esperimenti in vitro su colture di neuroni corticali, 

abbiamo testato la tossicità NMDA mediata, ed il ruolo dello zinco in questo 

pathway. È emerso un ruolo fondamentale dello zinco nella tossicità NMDA 

mediata, infatti i neuroni corticali G93A trattati con NMDA, dopo una preincubazione 

con zinco, sono drammaticamente più vulnerabili dei relativi controlli. 


• Studio morfologico delle spine dendritiche in corteccia motoria e 

midollo spinale nel modello G93A, in diversi stadi di sviluppo. 

• Studio dei livelli di espressione di proteine fondamentali nella formazione 

del citoscheletro in corteccia motoria di G93A. 

• Analisi del ruolo che le cellule gliali (astrociti e microglia) hanno nella 

eccitotossicità NMDA-mediata in colture di neuroni corticali G93A. 

• Studio di meccanismi intracellulari e molecolari coinvolti nella aumentata 

mortalità dei neuroni corticali G93A in seguito ad esposizione con zinco 

ed NMDA. 

C.2.12 – Modulazione della trasmissione GABAergica mediata 

dalle amine in traccia in neuroni dopaminergici 

del mesencefalo ventrale (Nicola Biagio Mercuri) 



Parole chiave: Dopamina; Amine in traccia; Mesencefalo; Morbo di Parkinson; 

Elettrofisiologia; Meccanismi presinaptici; GABA. 

Descrizione 

Le amine in traccia (TA) sono amine endogene presenti in dosi minime 

nel cervello dei mammiferi. Tra esse abbiamo: la tiramina (TYR), la b-fenilalanina 

(b-PEA), la triptamina e l’ottopamina. Negli ultimi anni un’attenzione 

crescente è stata rivolta alle TA, soprattutto in seguito alla scoperta di una 

famiglia di recettori accoppiati a proteine G, tra cui il TA1 ed il TA2, attivati 

selettivamente da TYR e b-PEA. Varie evidenze suggeriscono un legame tra il 

sistema dopaminergico mesencefalico e le TA: esse infatti sono sintetizzate 

probabilmente dai neuroni dopaminergici della sostanza nera pars compacta 

(SNc), inoltre un’alta espressione di mRNA per il TA1 è stata rilevata sia nella 

SNc che nella reticolata (SNr) della sostanza nera. Sotto l’aspetto clinico, deficit 

nella regolazione dei livelli delle TA sono stati associati a malattie psichiatriche 

come la schizofrenia e la depressione, ed un ruolo potenziale di queste 

amine è stato suggerito per i disordini di iperattività da deficit di attenzione, 

emicrania, Morbo di Parkinson, tossicodipendenze e disordini alimentari. 

2007 429


Il meccanismo d’azione delle TA per lungo tempo è stato considerato 

ristretto a quello di fattori anfetamino-simili, agenti dunque in grado di promuovere 

il rilascio di dopamina (DA), tuttavia sempre più sono le evidenze 

che suggeriscono un ruolo delle TA come neuromodulatori, che modificano 

l’attività di altri neurotrasmettitori. Nei neuroni dopaminergici della SNc, in 

particolare, il nostro laboratorio ha già in precedenza dimostrato che sia 

TYR che b-PEA sono in grado di ridurre l’inibizione mediata dalla stimolazione 

dei recettori GABAB, attraverso un meccanismo dipendente da proteine 

G. 

Dal momento che i recettori GABAB esercitano significative azioni anche 

a livello presinaptico, attraverso la nota inibizione del rilascio sia di GABA che 

di glutammato, risulta dunque interessante verificare se le TA siano in grado 

di modulare l’azione anche di questi recettori GABAB presinaptici. Questo 

permetterebbe di estendere la nostra comprensione del ruolo delle TA nel 

sistema nervoso centrale e di mettere in luce ulteriori target di azione dei loro 

recettori. 


Nel corso di questa prima fase del lavoro sperimentale è stato studiato il 

ruolo che le amine in traccia esercitano sui meccanismi inibitori GABA B 

dipendenti, in particolare su quelli che si esplicano a livello presinaptico. 

È stato prima di tutto necessario misurare il livello basale di tale effetto 

inibitorio, misurando le variazioni di frequenza delle correnti postsinaptiche 

inibitorie spontanee (sIPSCs). Il verificarsi di tali correnti è un effetto diretto, 

rilevato e misurato sul neurone postsinaptico, del rilascio di neurotrasmettitore 

da parte del terminale presinaptico; le eventuali variazioni dell’entità di 

tale rilascio inducono proporzionali e consensuali variazioni della frequenza e 

dell’ampiezza delle sIPSCs. 

Nei nostri esperimenti abbiamo osservato che l’applicazione di baclofen 

(1 mM) riduce significativamente la frequenza basale delle sIPSCs; tuttavia, 

se successivamente si aggiunge tiramina (100 mM), si osserva l’aumento 

della frequenza delle sIPSCs ad un valore prossimo a quello iniziale. Inoltre, 

alla sospensione della tiramina, la continuazione della perfusione con il solo 

baclofen riduce nuovamente la frequenza delle sIPSCs, in maniera statisticamente 

significativa. È interessante notare che l’applicazione della tiramina 

da sola non induce alcuna variazione della frequenza delle sIPSCs. Un 

effetto del tutto sovrapponibile si osserva per la b-fenilalanina (100 mM): 

anche questa riduce l’effetto inibitorio sulle sIPSCs indotto dal baclofen, 

senza tuttavia causare alcuna variazione quando applicata in assenza di 

baclofen. 

I risultati di questa fase del nostro studio estendono il ruolo delle amine 

in traccia, riconoscendole anche come modulatori delle variazioni, indotte da 

altre sostanze, del rilascio di neurotrasmettitore dal terminale presinaptico. 

Tale effetto è ascrivibile, come è stato dimostrato nel nostro laboratorio, ad un 

disaccoppiamento nella trasduzione del segnale tra recettore GABA B 

ed il suo 

effettore finale, il canale per il potassio accoppiato alle proteine G. 

430 2007



Nelle prossime fasi del nostro lavoro verranno studiate le modalità di passaggio 

transmembrana delle amine in traccia, per poter meglio definire a 

quale livello effettivamente queste interagiscono nei processi di trasduzione 

del segnale; verranno inoltre indagate le eventuali variazioni dell’omeostasi 

ionica intracellulare indotta dalle tracce amine. 

C.2.13 – Modulazione GABAergica e dopaminergica dell’eccitabilità 

dei neuroni dopaminergici in colture organotipiche 

di mesencefalo di topo (Nicola Biagio Mercuri) 



Parole chiave: Dopamina; Trace-amine; GIRK; IPSP. 

Descrizione 

Abbiamo precedentemente descritto l’effetto pre-sinaptico e post-sinaptico 

delle amine in traccia (TA) sul rilascio di GABA sui neuroni dopaminergici 

della substantia nigra pars compacta (SNc), in fettine acute di mesencefalo 

ventrale. Nel nostro laboratorio abbiamo recentemente messo a punto le colture 

organotipiche di mesencefalo. Tale sistema è rappresentato da uno-pochi 

strati di neuroni e cellule gliali che mantengono le connessioni tra loro e possono 

essere mantenute in vitro per diverse settimane. Esso presenta il grosso 

vantaggio di poter essere trattato farmacologicamente per diversi giorni 

prima di effettuare lo studio elettrofisiologico e microfluorometrico. È possibile 

ad esempio studiare l’effetto di farmaci neuroprotettivi verso insulti 

ischemici/anossici, oppure quello di farmaci neurotossici. Infine è possibile 

studiare l’effetto di diverse condizioni di coltura (la presenza del tessuto target) 

sullo sviluppo neuronale. 

Andremo a valutare gli effetti delle TA in questo nuovo sistema, applicate 

acutamente e per alcune ore prima delle registrazioni elettrofisiologiche per 

valutare un potenziale effetto tossico. 


Durante il 2006 la nostra Ricerca si è concentrata sullo studio degli effetti 

delle amine in traccia (TA) sul rilascio pre-sinaptico di GABA sui neuroni 

dopaminergici. Nonostante si tratti di amine endogene (la tiramina (TYR), la 

b-fenilalanina (b-PEA), la triptamina e l’ottopamina) presenti in dosi minime 

nel cervello dei mammiferi, negli ultimi anni le TA hanno riscosso un’attenzione 

crescente soprattutto in seguito alla scoperta di una famiglia di 

recettori accoppiati a proteine G, tra cui il TA1 ed il TA2, attivati selettivamente 

da TYR e b-PEA. Evidenze recenti hanno dimostrato un’alta espressione 

di mRNA per il TA1 sia nella sostanza nera compatta (SNc) che nella 

reticolata (SNr). In accordo con precedenti osservazioni, in quest’anno 

abbiamo trovato che l’agonista dei recettori GABA B 

baclofen (1 mM) riduce la 

2007 431


frequenza di correnti post-sinaptiche inibitorie spontanee (sIPSCs) da 16.5 ± 

1.1 a 12.4 ±0.6 Hz. Anche l’ampiezza degli sIPSCs è ridotta dal baclofen da 

29.1 ± 1.9 a 27.5 ± 1.7 pA, e ciò è probabilmente dovuto ad una riduzione del 

rilascio simultaneo di GABA da diverse aree. In presenza contemporanea di 

TYR (100 mM) e baclofen, la frequenza degli sIPSCs recupera parzialmente a 

14.5 ± 0.8 Hz indicando un effetto opposto della TYR sull’inibizione indotta 

da baclofen. In particolare, la TYR contrasta la riduzione della frequenza 

degli sIPSCs prodotta dal baclofen da 68.1 ± 2.8% a 85.4 ± 2.4% del controllo, 

in baclofen da solo e baclofen più TYR, rispettivamente. Analogamente, la b- 

PEA (100 mM), pur non modificando la frequenza basale degli sIPSCs, ha 

ridotto il grado di inibizione da parte del baclofen. 

In particolare la b-PEA contrasta la riduzione della frequenza degli 

sIPSCs operata dal baclofen da 65.7 ± 3.1% a 79.2 ± 1.9% del controllo, in 

baclofen da solo e baclofen più b-PEA, rispettivamente. Dato che nei neuroni 

dopaminergici le TA riducono le risposte post-sinaptiche indotte dai recettori 

GABA B 

interferendo con l’accoppiamento tra recettori GABA B 

e canali GIRK è 

anche possibile che esse riducano l’inibizione pre-sinaptica GABA B 

-mediata 

attraverso un meccanismo simile. 


Preliminarmente, valuteremo le proprietà elettrofisiologiche intrinseche 

dei neuroni dopaminergici nelle colture organotipiche. In particolare, la presenza 

di firing spontaneo regolare, la risposta inibitoria all’applicazione di 

dopamina esogena e all’attivazione di recettori GABAB verranno valutate in 

colture iniziate a diverse età dell’animale (P2-P10). Infatti, l’espressione dei 

recettori D2 e GABAB, nonché di canali ionici come GIRK2, KATP, Ih nei neuroni 

dopaminergici in coltura, dipende dal grado di maturazione del tessuto 

di partenza. Per valutare se le condizioni di coltura possano influenzare 

l’espressione di tali proteine prepareremo co-colture, in cui cioè oltre che al 

mesencefalo ventrale verrà messo in coltura anche il tessuto target, rappresentato 

dallo striato dorsale. 

C.2.14 – Caratterizzazione di “ marcatori di danno ” in modelli 

sperimentali neurodegenerativi e di danno assonale 

(Marco Molinari) 



Parole chiave: Marcatori di danno; Stress ossidativo e nitrosativo; Danno 

assonale; Sistemi nitrergici e purinergici; Citocromo-c; Neurotossicità; Trimetil-stagno; 

Neurogenesi; Trasportatori del glutammato; Relina. 

Descrizione 

Obiettivo del progetto è lo studio di alcune molecole coinvolte nei meccanismi 

legati alla morte cellulare in modelli sperimentali di neurodegenera- 

432 2007


zione. Tali molecole vengono definite genericamente “ marcatori di danno ” 

perché vengono indotte o si attivano dopo danno cellulare. Nel nostro laboratorio 

sono stati pianificati degli esperimenti che si propongono di andare a 

studiare alcune proteine coinvolte nello stress ossidativo e nitrosativo, nella 

risposta cellulare al danno, e nella disfunzione dei circuiti neurali. Questi 

esperimenti sono stati organizzati in quattro progetti principali con un grado 

di avanzamento differente a seconda dell’esperimento. 

Nel primo esperimento si valuterà l’induzione di marcatori di danno in 

un modello di danno assonale. Molte osservazioni sperimentali pongono lo 

stress ossidativo e nitrosativo come uno dei passaggi essenziali nei meccanismi 

legati alla morte cellulare in diversi tipi di insulti acuti come 

l’ischemia e il trauma, mentre esistono solo poche osservazioni riguardanti 

le patologie neurodegenerative. Il modello sperimentale da noi usato è 

quello del danno assonale, ottenuto attraverso una emicerebellectomia e 

che consente di seguire per tempi molto lunghi la progressione degli eventi 

degenerativi nelle stazioni precerebellari pontine ed olivari. I nostri obiettivi 

sono di andare a caratterizzare il fenotipo cellulare e la co-espressione, 

l’andamento temporale e la distribuzione anatomica del rilascio di citocromo-c, 

l’attivazione di caspasi, l’induzione dell’enzima NOS e dei recettori 

purinergici (sistemi nitrergici e purinergici). Nel secondo esperimento si 

valuterà l’espressione di marcatori di danno in un modello di neurotossicità 

basato sulla somministrazione di trimetil-stagno (TMT). La caratteristica 

peculiare di questo modello è la degenerazione selettiva delle cellule 

nell’ippocampo e di alcune aree limbiche corticali e subcorticali. I nostri 

obiettivi sono volti alla definizione della curva temporale di induzione di 

marcatori di danno ed alle possibili relazioni tra neurogenesi ed induzione 

dei sistemi nitrergici e purinergici. Nel terzo esperimento si valuterà 

l’espressione e la distribuzione in condizioni di base di marcatori fisiologici 

e di danno nel sistema orexinergico. Nel quarto esperimento si valuterà la 

connettività, la citoarchitettonica del cervelletto del topo Reeler attraverso 

l’utilizzo di marcatori anatomici e citologici. Il nostro obiettivo è di acquisire 

informazioni sui meccanismi istodismorfici prodotti dalla mutazione 

della proteina reelin. 


Primo esperimento – Studio sull’induzione di marcatori di danno dopo 

assotomia. Sono stati prodotti una serie di dati nel nostro laboratorio che 

dimostrano come il sistema nitrergico e purinergico risultino attivati dopo 

lesione in neuroni e glia. In particolare, in un modello di assotomia del centrale 

sono state osservate attivazioni dell’enzima NOS e delle subunità P2X1 e 

P2X2 ristrette alle popolazioni neuronali i cui assoni erano stati danneggiati 

dalla lesione. Tali attivazioni coincidevano spazialmente e temporalmente 

suggerendo la presenza di un’interazione tra i due sistemi nella risposta neuronale 

al danno assonale. Il significato di questa interazione non è ancora 

stato chiarito, e sono stati suggeriti sia effetti neuroprotettivi che degenerativi 

[Florenzano et al., in preparation]. 

2007 433


Secondo esperimento – Studio sull’induzione di marcatori di danno in un 

modello di neurotossiticità. Abbiamo utilizzato un modello di lesione sperimentale 

neurotossica sviluppato in collaborazione con l’Istituto di Anatomia 

della Università Cattolica. In questo modello viene ottenuta una lesione neurochimica 

selettiva in alcune aree attraverso la somministrazione di “ trimethyltin 

” (trimetil stagno) che induce citotossicità ed un conseguente stato 

epilettico. Abbiamo messo a punto la valutazione del danno citotossico attraverso 

l’analisi della morte neuronale nell’area ippocampale ed abbiamo incominciato 

ad analizzare l’espressione di alcuni marcatori di danno come 

l’enzima NOS ed i recettori purinergici nell’area di danno neuronale. 

Terzo esperimento – Studio sull’espressione e la distribuzione in condizioni 

di base di marcatori fisiologici e di danno nel sistema orexinergico. È stato 

svolto uno studio, con metodiche di immunoistochimica ed ibridizzazione in 

situ, nel quale abbiamo osservato la presenza della subunità P2X2, e solo 

quella, su tutti i neuroni orexinergici presenti nell’area dell’ipotalamo laterale. 

La presenza della subunità P2X2 presenta un particolare interesse, in quanto 

essa ha dimostrato di essere un fattore di attivazione della risposta cellulare in 

diversi paradigmi di lesione. 

Quarto esperimento – Studio sull’espressione dei trasportatori del glutammato 

nel cervelletto dei topi Reeler. Nel topo Reeler omozigote adulto abbiamo 

osservato modificazioni connettivali e citoarchitettoniche. Per la connettività 

abbiamo valutato i trasportatori del glutammato. L’immuoreattività per VGlut1 

si presentava conservata rispetto al topo wild type, mentre l’immuoreattività 

per VGlut2 si presentava profondamente alterata. La presenza di contatti glutammatergici 

VGluT2 positivi eterotopici e dismorfici indica una grave disorganizzazione 

della connettività cerebellare estrinseca. Per la citoarchitettonica 

abbiamo valutato sia gli elementi neuronali che gliali. Gli elementi gliali, gli 

astrociti, si presentavano con una distribuzione profondamente alterata con 

aree di astrocitosi diffusa ed aspecifica che suggeriva la presenza di uno stato 

infiammatorio cronico. 

– Amadio S, Tramini G, Martorana A, Viscomi MT, Sancesario G, Bernardi G, 

Volonté C (2006) Neuroscience 141(3): 1171-1180. 

– Florenzano F, Viscomi MT, Cavaliere F, Volonté C, Molinari M (2006) Advance Exp 

Med Biol 557: 77-100. 

– Florenzano F, Viscomi MT, Mercaldo V, Longone P, Bernardi G, Bagni C, Molinari 

M and Carrive P (2006) J Comp Neurol 498(1): 58-67. 

– Marinelli S, Di Marzo V, Florenzano F, Viscomi MT, Fezza F, van der Stelt M, Bernardi 

G, Molinari M, Maccarrone M and Mercuri NB (2007) Neuropsychopharmacol 

32: 298-308. 

– Martorana A, Giampà C, DeMarch Z, Viscomi MT, Patassini S, Sancesario G, Bernardi 

G, Fusco FR (2006) Europ J Neurosci 24(3): 732-738. 


• Analisi dell’induzione dei marcatori di danno nella glia e relazioni tra 

attivazione gliale e danno neuronale. Modulazione dei marcatori di danno in 

434 2007


seguito a trattamenti neuroprotettivi con glucocorticoide (metilprednisolone 

sodio succinato, solu-medrol) ed una tetraciclina (minociclina) dopo assotomia 

del centrale (emicerebellectomia). 

• Dopo lesione neurotossica indotta da somministrazione di trimetil stagno, 

andremo a verificare i rapporti spaziali e temporali nell’induzione dell’enzima 

NOS ed i recettori purinergici nell’ippocampo. 

• Sarà approfondita l’analisi degli aspetti dismorfici ed aberranti nella connettività 

e citoarchitettonica del topo Reeler omozigote adulto. Per acquisire 

una maggiore comprensione delle dismorfie osservate nel topo Reeler adulto, lo 

studio verrà effettuato anche nel periodo post-natale. 

C.2.15 – Alterazioni patologiche della plasticità sinaptica nello striato 

come modello di patologie neurodegenerative (Antonio Pisani) 



Parole chiave: Malattia di Parkinson; Striato; DJ-1; Pink1; Parkin; Plasticità 

sinaptica; Elettrofisiologia. 

Descrizione 

Lo striato è una struttura cerebrale coinvolta nell’apprendimento e nella 

memoria motoria. Alterazioni della funzionalità striatale sono alla base di 

patologie neurodegenerative come la malattia di Parkinson. La forma più diffusa 

della malattia di Parkinson è sporadica ed è caratterizzata dall’esordio in 

età avanzata. Sono però note anche rare forme genetiche a trasmissione autosomica 

recessiva, che sono caratterizzate da mutazioni nei geni DJ-1, Pink1, 

Parkin e si caratterizzano per l’esordio giovanile. 

Poiché si ritiene che i fenomeni di plasticità sinaptica a lungo termine a 

carico dei neuroni di proiezione dello striato (potenziamento e depressione) 

costituiscano il meccanismo cellulare sottostante l’apprendimento e la memoria 

motoria, abbiamo ipotizzato che alterazioni nell’espressione di plasticità 

striatale possano sottendere la sintomatologia della malattia di Parkinson, 

caratterizzata dall’insorgenza di disordini del movimento. A sostegno di questa 

ipotesi, in un modello animale ben caratterizzato della forma sporadica di 

malattia di Parkinson avevamo osservato che i neuroni striatali avevano perso 

la capacità di esprimere entrambe le forme di plasticità sinaptica. Durante il 

primo anno della ricerca, per verificare se alterazioni della plasticità sinaptica 

striatale costituiscano una caratteristica fisiopatologica comune anche alle 

forme genetiche di malattia di Parkinson, abbiamo esteso queste osservazioni 

ad un modello di topi con la delezione del gene Pink1. 


Nel primo anno di ricerca sono state analizzate le caratteristiche elettrofisiologiche 

intrinseche di neuroni striatali, in due modelli genetici di malattia 

di Parkinson, i topi knock-out per il gene Pink1 o Parkin. Sono state utilizzate 

2007 435


tecniche di registrazione intracellulare e di patch clamp. In particolare sono 

stati studiati neuroni principali spinosi, interneuroni colinergici (LA) e interneuroni 

Fast Spiking (FS). Le proprietà intrinseche di membrana di ogni tipo 

cellulare non sono risultate alterate rispetto ai topi wild-type di controllo. La 

caratterizzazione elettrofisiologica degli interneuroni Fast Spiking è stata integrata 

con uno studio morfologico di microscopia elettronica realizzato in collaborazione 

con il prof. Yoland Smith della Emory University Atlanta USA. 

Successivamente sono state studiate le risposte sinaptiche delle sopraddette 

classi neuronali striatali, di cui sono state valutate ampiezza, durata e caratteristiche 

farmacologiche. Benché le proprietà sinaptiche siano risultate paragonabili 

a quelle di controllo, i neuroni spinosi striatali dei topi Pink1-/- 

hanno mostrato alterazioni in entrambe le forme di plasticità, non essendo 

infatti in grado di esprimere né LTP né LTD. 

– Bonsi P, Sciamanna G, Mitrano DA, Cuomo D, Bernardi G, Platania P, Smith Y, 

Pisani A (in press) Functional and ultrastructural analysis of group I mGluR in 

striatal fast-spiking interneurons. Eur J Neurosci. 


Durante il secondo anno di attività verrà approfondito lo studio farmacologico 

della plasticità sinaptica in neuroni spinosi striatali nel modello genetico 

dei topi knock-out per il gene Pink1. In particolare, verrà studiata, con 

tecniche intracellulari convenzionali, la capacità di molecole ad azione dopamino-agonista 

di tipo D1 e/o D2 di ripristinare una normale plasticità sinaptica 

nei topi Pink1-/-, la cui espressione, dai dati ottenuti durante il primo 

anno di ricerca, è risultata severamente compromessa. In un precedente studio 

condotto su di un differente modello genetico di Parkinson (DJ-1), 

abbiamo infatti osservato che il quinpirolo (agonista del recettore di tipo D2 

della dopamina) è in grado di ripristinare l’LTD, che in questi neuroni risultava 

essere assente [Goldberg, Pisani et al. (2005) Neuron 45: 489-496]. 

In seguito, entrambi i fenomeni di plasticità sinaptica, LTP e LTD, verranno 

studiati anche nell’altro modello genetico di malattia di Parkinson, i 

topi knock-out per il gene Parkin. In particolare, verranno studiati neuroni 

principali spinosi dello striato per confrontare le osservazioni con i dati ottenuti 

dal modello dei topi Pink1-/- precedentemente analizzato. Il riscontro di 

eventuali alterazioni della plasticità sinaptica tra topi Parkin-/- e animali di 

controllo non portatori di mutazione costituirà la base per un successivo studio 

più prettamente farmacologico della plasticità sinaptica. Farmaci specifici, 

quali agonisti ed antagonisti dopaminergici e glutammatergici, verranno 

utilizzati per caratterizzare in dettaglio la natura delle alterazioni riscontrate 

al fine di tentare di ripristinare una normale funzionalità sinaptica. 

Infine, verranno valutate, utilizzando tecniche di patch-clamp, le correnti 

postsinaptiche spontanee, sia di tipo GABAergico inibitorio (IPSC), sia di tipo 

glutammatergico eccitatorio (EPSC). Il confronto di parametri quali ampiezza 

e frequenza degli eventi registrati dai topi transgenici o dai rispettivi controlli 

fornirà ulteriori indicazioni sulla natura delle eventuali alterazioni della 

trasmissione sinaptica. 

436 2007


C.2.16 – Alterazioni di Fosfodiesterasi specifiche nei neuroni striatali 

in un modello di parkinsonismo sperimentale nel ratto 

(Giuseppe Sancesario) 



Parole chiave: Morbo di Parkinson; L-DOPA; Fosfodiesterasi. 

Altri Enti coinvolti: Università dell’Aquila. 

Descrizione 

La dopamina ricopre un ruolo importante nella modulazione della attività 

sinaptica nello striato: la sua azione sui recettori dopaminergici D1 e D2 

nei neuroni striatali determina rispettivamente l’attivazione o la inibizione 

della adenil ciclasi, regolando in modo opposto la sintesi del secondo messaggero 

AMP ciclico (cAMP). Un gran numero di processi biologici sono infatti 

regolati dai livelli intracellulari dei secondi messaggeri (cAMP) e GMP ciclico 

(cGMP), la cui azione è interrotta dall’intervento di fosfodiesterasi (PDE) specifiche. 

Pur non esistendo al momento alcuna documentazione sull’attività 

delle PDE nella malattia di Parkinson [Kakkar et al. (1999) Cell Mol Life Sci 

55: 1164–1186], numerosi indizi sperimentali suggeriscono che in tale patologia 

si verificano alterazioni della modulazione della sintesi nonché del catabolismo 

dei nucleotidi ciclici [Hossain and Weiner (1993) J Pharmacol Exp Ther 

267: 1105-1111; Kotter (1994) Prog Neurobiol 44:163-196; Sancesario et al. 

(2004) Eur J Neurosci 20: 989-1000]. In particolare, recentemente, è stato 

dimostrato, in un modello sperimentale di Parkinson nel ratto, che la lesione 

della via dopaminergica con 6-idrossidopamina (6-OHDA) determina nello 

striato profonde ed opposte modificazioni dei livelli di cAMP e cGMP come 

conseguenza di una ridotta espressione della nNOS [Sancesario et al. (2004) 

Eur J Neurosci 20: 989-1000]. 

Dal momento che l’NO agisce da secondo messaggero nella trasmissione 

glutammatergica, è stato suggerito che la ridotta espressione striatale della 

nNOS e di conseguenza la ridotta sintesi di NO, dopo 6-OHDA, possa rappresentare 

un meccanismo compensatorio che va a controbilanciare una trasmissione 

glutammatergica corticostriatale drammaticamente aumentata dopo la 

lesione con 6-OHDA [Calabresi et al. (1993) Brain 116: 433-452]. Riveste particolare 

interesse l’osservazione che, nello striato deafferentato, non solo si 

determina un’alterazione della via dopamina-cAMP, paradossalmente in 

eccesso, ma anche un’alterazione in difetto della via ossido nitrico-cGMP 

[Sancesario et al. (2004) Eur J Neurosci 20: 989-1000]. 


Noi abbiamo recentemente dimostrato in un modello murino di Parkinson 

sperimentale che la lesione della via dopaminergica determina nello 

striato e nel globo pallido profonde ed opposte modificazioni dei livelli di 

cAMP e cGMP, con un inaspettato aumento del primo ed una riduzione del 

2007 437


secondo; abbiamo inoltre chiarito che nello striato e nel globo pallido queste 

modificazioni sono dipendenti non solo dalla primaria compromissione della 

trasmissione dopaminergica, ma anche da un’alterata espressione ed attività 

di specifiche fosfodiesterasi (PDE), gli enzimi che, deciclizzando il cAMP ed il 

cGMP, ne regolano i livelli intracellulari. Abbiamo verificato come un inibitore 

selettivo (zaprinast) delle fosfodiesterasi PDE5 e PDE1B possa aggravare 

nel ratto con una lesione della sostanza nera la difficoltà ad apprendere una 

risposta differita ad uno stimolo condizionato. 

Abbiamo infine verificato come in questo modello l’uso cronico della terapia 

con L-DOPA possa modificare i livelli di cAMP e il cGMP e come i livelli di questi 

possano essere profondamente diversi negli animali che presentano discinesie da 

L-DOPA. Non è tuttavia al momento chiaro se gli alterati livelli dei secondi messaggeri 

negli animali che sviluppano discinesie da L-DOPA possano essere dipendenti 

da modificazioni del “ rate ” della sintesi o del loro catabolismo. 


Scopo del nostro progetto è quello di chiarire i meccanismi della alterata 

regolazione di cAMP e cGMP nello striato dopo deafferentazione dopaminergica 

in condizioni basali, dopo trattamento con L-DOPA e dopo trattamento 

con inibitori selettivi delle fosfodiesterasi. A tal fine condurremo: 

• Studio immunocitochimico nel ratto e nell’uomo della localizzazione 

cellulare delle differenti isoforme di PDE specifiche dei gangli della base e 

delle relative variazioni dopo deafferen-tazione nigrostriatale. 

• Studio biochimico delle variazioni della attività, della espressione e 

degli mRNA delle differenti isoforme di PDE specifiche dei gangli della base 

dopo deafferentazione nigrostriatale nel ratto, nel cervello umano di controllo 

e nel paziente affetto da Morbo di Parkinson. 

C.2.17 – Analisi della regolazione post-trascrizionale della espressione 

genica nel differenziamento neuronale (Claudio Sette) 



Parole chiave: Metabolismo degli mRNA; Differenziamento; Sam68. 

Altri Enti coinvolti: Università di Roma Tor Vergata 

Descrizione 

La regolazione post-trascrizionale della espressione genica assume una 

rilevanza particolare in sistemi cellulari complessi quali i neuroni. Queste 

cellule presentano un pattern di splicing alternativo peculiare di geni 

espressi anche in altri tipi cellulari. Inoltre, la trascrizione e la traduzione di 

mRNA possono diventare spazialmente separate nei neuroni, e gli mRNA 

sono trasportati da proteine specifiche lungo i dendriti e gli assoni per 

essere tradotti in proteine nella periferia della cellula. L’importanza della 

regolazione post-trascrizionale della espressione genica nei neuroni è con- 

438 2007


fermata dagli elevati livelli di espressione di proteine leganti gli mRNA nel 

cervello e dalle patologie indotte da mutazioni in alcuni dei geni codificanti 

per esse. Il nostro laboratorio si occupa della proteina di legame all’RNA 

chiamata Sam68. Essa è fortemente espressa nei neuroni ed è stato dimostrato 

che Sam68 viene indotta durante il differenziamento di cellule staminali 

neuronali in neuroni maturi. Recentemente è stato anche dimostrato 

che Sam68 è espressa nei neuroni ippocampali della corteccia e che la depolarizzazione 

di questi neuroni induce la sua traslocazione in granuli dendritici 

suggerendo un ruolo regolatorio di questa proteina nel metabolismo di 

specifici mRNA. 

Esperimenti condotti in altri sistemi cellulari hanno dimostrato che 

Sam68 partecipa a diversi aspetti del metabolismo cellulare degli mRNA, 

quali lo splicing, l’esporto ed il rilascio citoplasmatico di mRNA ed il controllo 

traduzionale. È stato proposto che Sam68 funzioni da sistema di ricezione dei 

segnali di trasduzione di stimoli esterni alla cellula e modulando l’utilizzo di 

RNA bersaglio. Infatti questa proteina è modificata post-traduzionalmente da 

eventi di fosforilazione, metilazione ed acetilazione che ne modulano la capacità 

di legame degli RNA. 

Il nostro laboratorio ha inoltre recentemente dimostrato che Sam68 associa 

con i polisomi ingaggiati nella traduzione in risposta a segnali di progressione 

del ciclo cellulare, suggerendo un ruolo di controllo traduzionale per 

questa proteina. Abbiamo anche identificato alcuni degli mRNA legati da 

Sam68 e tra questi abbiamo osservato alcuni per proteine fondamentali per lo 

sviluppo neuronale quali Bcl-x, Neogenina, Mash1 e Tipin (Timeless interacting 

protein). 

In questo progetto ci proponiamo di studiare la regolazione di questi 

mRNA da parte di Sam68 in neuroni normali o sottoposti a stress degenerativo. 


Abbiamo caratterizzato la regolazione post-trascrizionale di uno dei bersagli 

di Sam68: Bcl-x. Esperimenti di silenziamento genico e di espressione 

transiente di forme di Sam68 mutate hanno dimostrato che questa proteina 

modula la scelta dei siti di splicing alternativo di Bcl-x. In particolare, un 

aumento di espressione di Sam68 induce l’espressione della forma Bcl-x(s), ad 

attività pro-apoptotica. L’azione di Sam68 su Bcl-x correla con la capacità 

della proteina di indurre apoptosi in cellule trasfettate in modo transiente. 

L’attività di Sam68 richiede la sua associazione con hnRNP A1 ed è contrastata 

dallo splicing factor ASF/SF2. Inoltre, abbiamo dimostrato che la tirosin 

chinasi Fyn reverte l’azione di Sam68, trasformandola da pro-apoptotica a 

anti-apoptotica. L’effetto di Fyn è mediato dalla fosforilazione di Sam68 su 

residui di tirosina localizzati all’estremità C-terminale della proteina. La fosforilazione 

influenza anche la localizzazione sub-nucleare di sam68 ed interferisce 

con la sua capacità di associare con hnRNP A1. 

Visto il coinvolgimento di Bcl-x nello sviluppo embrionale del sistema 

nervoso centrale, i nostri studi mettono in luce una possibile azione di Sam68 

sulla genesi delle isoforme necessarie alla sopravvivenza dei neuroni. 

2007 439


Per verificare questa ipotesi, abbiamo messo appunto condizioni colturali 

per ottenere un efficiente differenziamento delle cellule staminali embrionali 

(ES) in neuroni. Al momento, stiamo effettuando esperimenti di silenziamento 

per RNA interference di Sam68 al fine di valutare il ruolo di questa 

proteina in tale differenziamento. In particolare, seguiremo l’espressione dei 

bersagli molecolari di sam68 descritti sopra. In questo anno abbiamo anche 

descritto il ruolo di Sam68 sulla sopravvivenza cellulare delle cellule LNCaP, 

un tumore di prostata di derivazione neuroendocrina. 


• Lo studio del ruolo di Sam68 nel differenziamento neuronale delle cellule 

ES. 

• La caratterizzazione dei bersagli molecolari di sam68 coinvolti in questo 

processo. 

• L’approfondimento del meccanismo di azione di Sam68 sui bersagli 

molecolari identificati. 

C.2.18 – Attualità della trasmissione neurotensinergica nel modello 

di parkinsonismo da 6-OHDA: immunochimica 

ed elettrofisiologia in vivo tra animali denervati 

e denervati con discinesie (Alessandro Stefani) 



Parole chiave: Neuropeptidi; Elettrofisiologia; Immunochimica; Parkinson 

sperimentale; Globo pallido. 

Altri Enti coinvolti: Università di Roma Tor Vergata. 

Descrizione 

Non disponiamo di informazioni sufficienti sul ruolo endogeno dei neuropeptidi 

nei gangli della base di mammifero. Poco chiare sono le risultanze 

relative a neurotensina (NT) e Sostanza P (SP) benché le loro interazioni con 

le amine biogene siano state suggerite da tempo dalla farmacologia clinica. 

Il territorio oggetto di questa ricerca corrente attiene all’approfondimento 

degli effetti neurofisiologici di tali peptidi nel globo pallido (o pallido 

esterno) di ratto adulto. Esamineremo l’azione esercitata da NT e SP su correnti 

calciche ad alta soglia (in prevalenza da neuroni dissociati con metodo 

enzimatico). Una modulazione delle stesse dovrebbe apportare significative 

modifiche al pattern di scarica dei neuroni esaminati, con riflessi plausibili 

sulla cascata di fosforilazioni intracellulari e sull’attività di release a valle. La 

ricerca viene integrata con indagini immuno-istochimiche, tese a convalidare 

la presenza dei recettori specifici per NT (in particolare il sottotipo NTS1, 

sensibile a SR48692 e SR142948), e la loro distribuzione sia in termini di 

regionalizzazione (predominanza nei settori laterodorsali del GP) che di colocalizzazione 

(con parvalbumina e/o CHAT). 

440 2007



Abbiamo approfondito l’azione del tricapeptide neurotensina (NT) nel 

globo pallido (GP) di ratto. NT, come è noto, viene considerata una sorta di 

“ neurolettico endogeno ” per l’interferenza con la trasmissione dopaminergica. 

La gran parte delle evidenze sin qui accumulate depone per una prevalente 

azione esplicata attraverso i neuroni principali dello striato (e non del 

GP). Peraltro, precedenti risultati del nostro gruppo [1] avevano suggerito che i 

recettori per NT di cosiddetto tipo 1 (NTS1, non sensibili all’antiistaminico 

levocabastina) sono distribuiti ed in misura abbondante su almeno 1/3 dei 

neuroni GP [1] . Alla radice del nostro studio, dunque, stavano diversi quesiti 

aperti: 

– Esiste una azione fisiologica di NT sulle conduttanze calciche del GP [2] 

e non solo nello striato? 

– È verosimile che NT eserciti effetti postsinaptici su neuroni acutamente 

dissociati ? 

Il progetto ha permesso di porre in evidenza i seguenti aspetti [3] : 

– NT inibisce le correnti calciche ad alta soglia. 

– L’azione è farmacologicamente specifica (significativamente più potente 

il frammento attivo, c.d. 8-13 e viene efficacemente antagonizzata da antagonisti 

NTS1 SR48692 e SR142948, a dosi 1-10 micromolare). 

– L’effetto è relativamente voltaggio-indipendente, rapidamente reversibile, 

senza desensitizzazione e richiede il coinvolgimento di G proteine (impedito 

dalla pre-incubazione con la NEM). 

– La conduttanza modulata da NT è conotossina GVIA sensibile, ergo 

una classica corrente di tipo N. 

Un capitolo a parte è quello relativo alla determinazione di quali neuroni 

del neuropilo GP siano sensibili a NT. L’inibizione del calcio voltaggiodipendente 

è rilevato in circa il 56% delle registrazioni, prevalendo su neuroni 

a fenotipo “ piccolo-medio ” (tipo I, 1). Sebbene non inequivocabilmente ascrivibili 

ai Parvalbumino-negativi, tali cellule sono prive di correnti calciche a 

bassa soglia e, condividono, con NT, la responsività al baclofen [3] . 

Il dato funzionale saliente dunque è quello di una sottopopolazione di cellule 

GP, abbondanti nella regione più limitrofa allo striato, peculiarmente sensibili 

alla trasmissione NT e GABA-B (benché non additive), entrambe assicurando 

un tono inibitorio endogeno al calcio postsinaptico. I riflessi di tali dati 

(in che misura modifichino l’eccitabilità cellulare ed il release di GABA e glutammato) 

vanno valutati in modelli a circuitistica conservata, come registrazioni 

elettrofisiologiche in vivo. 

1. Martorana A, Fusco FR, D’Angelo V, Sancesario G, Bernardi G (2003) Exp Neurol 

183(2): 311-319. 

2. Hainsworth AH, Randall AD, Stefani A (2006) Methods Mol Biol 312: 161-179. 

3. Martorana A, Martella G, D’Angelo V, Fusco FR, Spadoni F, Bernardi G, Stefani A 

(2006) Synapse 60(5): 371-383. 

2007 441



Gli sviluppi futuri della ricerca sono incentrati su diverse direttive: 

• In che misura la descritta modulazione si traduce in una tangibile 

modificazione del firing di GP registrato con tecniche elettrofisiologiche 

extracellulari in vivo. In altri termini, chiariremo se NT influenzi l’eccitabilità 

spontanea dei neuroni GP verrà indagato con applicazioni per via iontoforetica 

diretta (in GP) e mediata (in striato). L’aspetto più qualificante del progetto 

consta nel fatto che confronteremo tali effetti a registrazioni svolte in un 

modello sperimentale di parkinsonismo (lesione da 6-idrossidopamina). 

• Si aggiunga, a tale riguardo, che la verifica degli effetti NT-mediati sarà 

praticata non solo su naive vs. lesionati ma anche su lesionati vs. roditori che 

(a seguito di priming e trattamento con L-DOPA) abbiano manifestato (o 

meno) movimenti involontari. In sostanza otterremo una stima credibile di 

quanto NT influenzi il “ behavior ” fisiologico dopamino-dipendente nell’asse 

striato-pallidale (porzione della cosiddetta via indiretta del modello circuitistico 

dei gangli della base). 

• L’altra linea guida del progetto corrente attiene alla pathway endogena 

dell’ossido nitrico (NO) e all’ipotesi che gli effetti di NT interagiscono con la 

cascata NO-GC. 

C.2.19 – Investigazioni di Proteomica e Metabonomica nelle sindromi 

neurodegenerative (Andrea Urbani, Giorgio Federici) 



Parole chiave: Alzheimer; Sclerosi Multipla; Malattie Neurodegenerative; 

Proteomica; Metabonomica. 

Altri Enti coinvolti: Università di Roma Tor Vergata; Università di Chieti 

G. D’Annunzio. 

Descrizione 

La Proteomica è una disciplina che permette una analisi induttiva, olistica, 

dei polipeptidi presenti in un campione biologico. Questa unisce le separazioni 

di polipeptidi, analisi di spettrometria di massa ed inferenza dei dati ottenuti su 

banche dati genomiche e/o di proteine. L’analisi del profilo metabolico viene 

anch’essa svolta mediante una indagine aperta accoppiando sistemi liquido cromatografici 

accoppiati a spettrometri di massa operanti in alta risoluzione con 

analisi statistiche multivariate al fine di ricostruire gruppi (cluster) di metaboliti 

specifici di una determinata condizione. 

Il nostro scopo è quello della valutazione dei profili di espressione differenziale 

di proteine e metaboliti al fine di dissezionare il ruolo biochimico 

di un definito pattern molecolare nell’ambito di specifiche sindromi neurodegenerative. 

Queste indagini potranno portare alla identificazione di marcatori 

molecolari di diagnosi e/o prognosi oltre a poter fornire delle informazioni 

442 2007


sull’identificazione di nuovi potenziali bersagli molecolari di trattamento. 

Le patologie del sistema nervoso centrale che verranno considerate all’interno 

di questo programma sono la Sclerosi multipla ed la demenza di Alzheimer in 

quanto rappresentative di due patologie neurodegenerative assolutamente 

non correlate tra loro. Per il programma sulla Sclerosi multipla verranno 

comparati campioni di CSF e plasma di pazienti affetti da SM con differenti 

gruppi clinici affetti da patologie autoimmuni periferiche (Guillain-Barré, 

Artrite reumatoide, etc.). Per il programma sul morbo di Alzheimer verranno 

realizzate delle indagini differenziali con altri gruppi clinici di demenze quali: 

demenze a corpi di Lewi, frontotemporale e vascolare. Una validazione funzionale 

dei meccanismi molecolari messi in luce mediante questa tecnologia 

verrà realizzata sia attraverso lo studio di modelli cellulari in vitro ed ex-vivo 

da modelli animali disponibili all’interno del CERC: modello di topo transgenico 

APPsw per il morbo di Alzheimer, modello di topo con encefalite allergica 

acuta per la sclerosi multipla. 


Le tecnologie allo stato dell’arte di spettrometria di massa sono il nostro 

punto di forza nello sviluppare indagini multivariate di biochimica clinica sia 

nello studio del Proteoma che del profilo Metabolico. In particolare ci siamo 

concentrati nello studio di campioni clinici (plasma, CSF) di pazienti. 

L’investigazione del liquor cerebro spinale (CSF) e del plasma dei pazienti 

arruolati è stata inizialmente sviluppata mediante spettrometria di massa 

MALDI-TOF-MS lineare. Queste indagini danno la possibilità di sviluppare 

dei saggi veloci e riproducibili di “ protein profiling ”. Questa tecnica permette 

lo screening di polypeptidi di basso peso molecolare, 800-20000 Da, potendo 

facilmente campionare un alto numero di soggetti e di condizioni di arricchimento. 

Tali indagini sono in corso presso i nostri laboratori con risultati che 

mettono in luce una risoluzione di massa superiore a 1500 FWHM a 15000 

AMU ed una accuratezza di massa di +/- 1 AMU dopo calibrazione interna 

basata sulle catene dell’emoglobina. 

I segnali con una segregazione significativa (p


• Analisi mulivariata di “ protein profiling ” dei gruppi clinici. A questa 

seguirà una prima indagine di Metabonomica. Indagini di 2DE PAGE del 

repertorio proteico del CSF in gruppi clinici selezionati sulla base dei dati raccolti 

precedentemente. 

• Completamento dell’acquisizione della casistica necessaria al progetto 

sulle demenze ed analisi mutivariata di “ protein profiling ” di CSF e siero. 

• Sviluppo di un modello cellulare in vitro bassato su linee umane di neuroblastoma 

SH-5YSY per valutare l’effetto molecolare di farmaci in grado di 

alterare i meccanismi di degradazione proteica. 

– Angelucci A, Valentini A, Millimaggi D, Gravina GL, Miano R, Dolo V, Vicentini C, 

Bologna M, Federici G, Bernardini S (2006) Anticancer Drugs 17(10): 1141-1150. 

– Bernardini S, Nuccetelli M, Noguera NI, Bellincampi L, Lunghi P, Bonati A, 

Mann K, Miller WH Jr, Federici G, Lo Coco F (2006) Ann Hematol 85(10): 

681-687. 

– Biroccio A, Del Boccio P, Panella M, Bernardini S, Di Ilio C, Gambi D, Stanzione P, 

Sacchetta P, Bernardi G, Martorana A, Federici G, Stefani A, Urbani A (2006) Proteomics 

6(7): 2305-2313. 

– Bonomini M, Pavone B, Sirolli V, Del Buono F, Di Cesare M, Del Boccio P, Amoroso 

L, Di Ilio C, Sacchetta P, Federici G, Urbani A (2006) J Proteom Res 5(10): 

2666-2674. 

– Del Boccio P, Pieragostino D, Lugaresi A, Di Ioia M, Pavone B, Travaglini D, 

D’Aguanno S, Bernardini S, Sacchetta P, Federici G, Di Ilio C, Gambi D, Urbani A 

(2006) Ann Neurol Sep 27 [Epub ahead of print]. 

– Del Boccio P, Urbani A (2005) Annali ISS 41(4): 479-482. Review. 

– Candiano G, Musante L, Bruschi M, Petretto A, Santucci L, Del Boccio P, Pavone 

B, Perfumo F, Urbani A, Scolari F, Ghiggeri GM (2006) J Am Soc Nephrol 

17(11): 3139-3148. 

– Greco M, Chiriaco F, Del Boccio P, Tagliaferro L, Acierno R, Menegazzi P, Pinca E, 

Pignatelli F, Storelli C, Federici G, Urbani A, Maffia M (2006) Proteomics 6(19): 

5350-5361. 

– Musante L, Bruschi M, Candiano G, Petretto A, Dimasi N, Del Boccio P, Urbani A, 

Rialdi G, Ghiggeri GM (2006) Biochem Biophys Res Commun 349(2): 668-673. 

– Spalletta G, Bernardini S, Bellincampi L, Federici G, Trequattrini A, Caltagirone C 

(2006) Eur J Neurol 13(2): 176-182. 

– Valentini A, Pucci D, Crispini A, Federici G, Bernardini S (2006) Chem Biol Interact 

161(3): 241-250. 

C.2.20 – Patologie neurodegenerative e recettori purinergici 

(Cinzia Volonté) 



Parole chiave: Recettori P2 metabotropici; Interazioni recettoriali; Oligomerizzazione; 

Struttura quaternaria. 

Altri Enti coinvolti: Consiglio Nazionale delle Ricerche. 

444 2007

Descrizione 


I recettori purinergici P2 per i nucleotidi extracellulari sono ampiamente distribuiti 

nel sistema nervoso centrale e periferico. La famiglia dei recettori P2 si 

divide in due sottofamiglie: recettori ionotropici ad attivazione veloce, P2X, dei 

quali sono stati finora identificati sette diverse subunità (P2X 1-7 

), e recettori metabotropici 

accoppiati alle proteine G, P2Y, dei quali sono state clonate otto subunità 

fra loro differenti (P2Y 1-2,4,6,11-14 

). Pur essendo distinti in struttura primaria-terziaria, 

ulteriori eterogeneità fra tali recettori si manifestano anche a livello di 

struttura quaternaria. Mentre è stato ampiamente dimostrato che le subunità dei 

recettori P2X si associano tra loro per formare complessi omo- ed etero-oligomerici 

con struttura quaternaria di tipo trimerico, ben poco è ancora noto, invece, 

dell’architettura dei recettori metabotropici P2Y. 

Sebbene i modelli classici indichino che i recettori accoppiati a proteine G 

(GPCR) siano espressi solo come monomeri, studi recenti hanno invece dimostrato 

che anche i GPCR esistono sotto forma di complessi dimerici e multimerici 

di tipo omo- od etero-merico. In tal senso, è stato provato che il recettore P2Y 1 

forma dei dimeri con i recettori A1 ed A2A per l’adenosina, e che la regolazione di 

tali complessi sia sotto il controllo degli agonisti specifici di entrambe le famiglie 

di proteine. È stato inoltre dimostrato che la subunità P2Y 4 

si associa al recettore 

del glutammato NMDAR1 ed al recettore a bassa affinità per l’NGF, p75. Nel loro 

insieme, questi dati inducono quindi ad ipotizzare che i recettori P2Y posseggano 

delle sequenze specifiche che permetterebbero loro di associarsi a formare dei 

complessi oligomerici anche all’interno della stessa famiglia P2Y. 

Nel presente programma di ricerca si intende pertanto studiare la potenziale 

interazione delle diverse subunità della famiglia dei recettori P2Y a formare complessi 

recettoriali di ordine superiore. 


Nell’ambito dell’attività di ricerca, abbiamo analizzato la distribuzione in 

particolare del recettore metabotropico P2Y12 nel sistema nervoso centrale 

di ratto, per mezzo di reazioni immunoenzimatiche, tecniche immunoistologiche 

e di western blotting, analisi al microscopio elettronico. Abbiamo localizzato 

il recettore P2Y12 esclusivamente negli oligodendrociti di corteccia 

cerebrale e nuclei subcorticali (striato e substantia nigra), non colocalizzando 

tale recettore con il generico marker neuronale NeuN ed NFL, con lo 

specifico marker neuronale calbindina per lo striato, tiroxina idrossilasi per 

la substantia nigra, con il marcatore microgliale IB4 e quello astrocitario 

GFAP. Abbiamo invece osservato colocalizzazione tra il recettore P2Y12 e 

l’MBP, che riconosce i corpi cellulari degli oligodendrociti e gli avvolgimenti 

mielinici, ed il RIP, che individua solo i corpi degli oligodendrociti ed i loro 

processi multipli che terminano in prossimità degli avvolgimenti mielinici, 

ma non la mielina stessa nella porzione distale degli assoni. 

Ad elevato ingrandimento, abbiamo notato fibre P2Y12-MBP positive 

contenenti strutture segmentali costituite da brevi tratti d’interruzione della 

mielina, che sono rispettivamente regioni internodali della fibra e nodi di 

Ranvier. Inoltre, abbiamo osservato piccole strutture P2Y12-MBP positive 

2007 445


con corti processi radiali, che assomigliano a corpi cellulari di oligodendrociti 

adiacenti a corpi neuronali. Inoltre, è stata confermata la presenza del 

recettore P2Y12 negli oligodendrociti, anche mediante microscopia elettronica 

e Western blotting. L’identificazione del recettore P2Y12 esclusivamente 

negli oligodendrociti farebbe quindi supporre ad un ruolo specifico di tale 

recettore nei meccanismi di comunicazione e contatto glia-neurone delle 

aree cerebrali descritte. 


Poiché il recettore P2Y4 ed il recettore P2Y6 costituiscono l’unico sistema 

ad ora conosciuto di trasmissione esclusivamente pirimidinergica, essendo 

entrambe le subunità sia attivate dall’UTP e dall’UDP, sia coespresse negli 

stessi tipi cellulari dove mediano funzioni sovrapponibili pur differendo nelle 

cinetiche di attivazione, il principale obiettivo del presente programma di 

ricerca sarà quello di confrontare la struttura quaternaria del recettore P2Y4 

con quella del recettore P2Y6, per verificare se anche quest’ultimo sia in grado 

di formare omo-complessi. Inoltre, analizzeremo il ruolo funzionale delle 

diverse forme di aggregazione di ciascuna proteina, confrontando l’eventuale 

ridistribuzione della forma monomerica rispetto ai complessi oligomerici, sia 

in seguito ad attivazione del recettore da parte dell’agonista specifico UTP, sia 

in compartimenti di membrana specifici, quali le terminazioni sinaptiche del 

sistema nervoso centrale. Infine, poiché le interazioni tra GPCR possono 

essere di tipo omo-dimerico o etero-dimerico, a seconda che derivino da un 

unico tipo di recettore o da subunità diverse, valuteremo l’esistenza di complessi 

etero-oligomerici costituiti dalle subunità P2Y4 e P2Y6. 

In conclusione, il nostro studio ci permetterà di definire le differenze 

nella struttura quaternaria dei recettori pirimidinergici P2Y4 e P2Y6 e di individuare 

una possibile funzione delle diverse forme di aggregazione di ciascun 

recettore. 

446 2007


C.3 –STUDIO MULTIDISCIPLINARE DELL’IMMUNOPATOGENESI 

DELLA SCLEROSI MULTIPLA 

C.3.1 –Studio delle caratteristiche fenotipiche e funzionali 

dei linfociti T regolatori nella Sclerosi Multipla 

(Luca Battistini) 



Parole chiave: Sclerosi Multipla; Linfociti T regolatori; Autoimmunità; Terapia 

cellulare. 

Altri Enti coinvolti: Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine (MDC), 

Berlino 

Descrizione 

La Sclerosi Multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica caratterizzata 

da infiltrazione linfocitaria e infiammazione della sostanza bianca 

del sistema nervoso centrale. Numerose evidenze cliniche e sperimentali 

suggeriscono che linfociti T specifici per antigeni della mielina siano coinvolti 

nella patogenesi della malattia. Benché i linfociti T autoreattivi siano 

presenti anche nei soggetti sani, nei pazienti con malattie autoimmuni tali 

cellule si attivano con facilità maggiore rispetto alle cellule ottenute da soggetti 

sani. Tale alterata reattività potrebbe riflettere una ridotta funzionalità 

dei linfociti Treg. Nel prossimo futuro ci proponiamo di studiare le capacità 

di soppressione e di migrazione della sottopopolazione di cellule T regolatorie 

CD25 High isolate da individui sani e da pazienti affetti da Sclerosi 

Multipla. Verranno utilizzate sofisticate tecniche che permettono la misurazione 

della presenza, della distribuzione, e dell’attività immunologica delle 

T regolatorie in pazienti affetti da Sclerosi Multipla con la forma relapsingremitting. 

Verranno inoltre monitorati i markers sopramenzionati al fine di 

valutare la possibilità di associazione di un determinato fenotipo con l’attività 

di malattia. 

L’alterazione funzionale dei linfociti Treg nei pazienti con malattia 

autoimmune suggerisce immediatamente che la terapia con tali cellule 

potrebbe rappresentare un mezzo per ristabilire l’equilibrio immunologico 

dell’individuo, in cui le cellule autoreattive non sono più “ controllate ” dal 

sistema immunitario. Come premessa per le applicazioni in clinica, le cellule 

identificate nelle fasi precedenti del progetto verranno coltivate e iniettate nei 

topi in cui sia stata indotta l’encefalite. Gli effetti sui sintomi neurologici verranno 

valutati seguendo criteri convalidati. Nell’ultima fase di questo progetto 

ci proponiamo di disegnare un protocollo sperimentale per la terapia cellulare 

dei pazienti affetti da Sclerosi Multipla, mediante trattamento con cellule 

regolatorie autologhe purificate e attivate in vitro. 

2007 447



È stata definita la sottopopolazione di cellule T regolatorie più efficace 

nel sopprimere la risposta immunitaria. Tale sottopopolazione è caratterizzata 

da bassi livelli di espressione dell’integrina VLA-4, fondamentale per 

l’interazione con le cellule dell’endotelio vascolare durante la migrazione 

all’interno dei tessuti. Questo dato ha diverse implicazioni: da un lato contribuisce 

a spiegare l’efficacia del trattamento terapeutico con Tysabri, un 

anticorpo monoclonale diretto contro la VLA-4 che, somministrato ai 

pazienti con Sclerosi Multipla, ha dimostrato un’efficacia quasi doppia 

rispetto ai farmaci attualmente in uso; dall’altro ha evidenziato che le cellule 

T regolatorie sono gli unici linfociti T CD4+ ad utilizzare un distinto repertorio 

di molecole di adesione per la transmigrazione nei tessuti infiammati. 

Nell’ultimo periodo abbiamo ottenuto dati preliminari che dimostrano 

l’importanza dei recettori purinergici, dell’ATP e dei suoi metaboliti (quali 

l’adenosina) nel meccanismo di immunosoppressione mediato dalle cellule 

T regolatorie. Questi ultimi dati hanno aperto la strada a un nuovo emozionante 

panorama di ricerca. 

Il sistema nervoso ed il sistema immunitario costituiscono reti complesse 

di cellule in comunicazione tra loro. Il termine di sinapsi immunologica, 

preso a prestito dalle neuroscienze, definisce la zona di interazione e di comunicazione 

tra due cellule del sistema immunitario. Come avviene nelle sinapsi 

nervose, anche nelle sinapsi immunologiche vengono rilasciati mediatori 

solubili, e tra questi (oltre alle citochine e chemochine) è possibile che 

abbiano un ruolo di primo piano l’ATP e i suoi metaboliti. I nostri primi dati 

mostrano che a livello dei linfociti sono presenti depositi di ATP, che possono 

venire rilasciati in seguito a stimolazione, ed è noto che tutti i linfociti 

esprimono recettori purinergici, che li rende quindi sensibili all’azione dei 

nucleotidi. La presenza poi di ectoenzimi che rapidamente metabolizzano i 

nucleotidi rilasciati nello spazio extracellulare conferisce un ulteriore livello 

di regolazione del signalling innescato da queste molecole. 

La nostra ipotesi è che la soppressione immunologica mediata dai linfociti 

T regolatori, le uniche cellule ad esprimere l’ectoenzima CD39 associato 

ad elevati depositi intracellulari di ATP, sia collegato al rilascio e alla regolazione 

della concentrazione extracellulare di nucleotidi. Lo studio di questi 

meccanismi, oltre ad aprire nuove frontiere di ricerca, è un passo fondamentale 

verso l’utilizzo delle cellule T regolatorie nella pratica clinica. 


Le attività previste includono: 

• lo studio della risposta immunitaria nei pazienti affetti da Sclerosi Multipla; 

• la caratterizzazione fenotipica e funzionale dei linfociti T autoreattivi 

isolati dal sangue periferico dei pazienti nelle varie fasi di malattia; 

• l’identificazione di markers immunologici di malattia mediante citofluorimetria. 

448 2007


C.3.2 –Studio dell’attività neuronale e sinaptica in topi 

con encefalite allergica sperimentale, modello animale 

di sclerosi multipla (Diego Centonze) 



Parole chiave: Sclerosi Multipla; EAE; Plasticità Sinaptica; Elettrofisiologia. 

Altri Enti coinvolti: Ospedale San Raffaele, Milano; Università di Teramo. 

Descrizione 

In questa nuova fase della ricerca indagheremo le alterazioni del sistema 

endocannabinoide in corso di sclerosi multipla e sclerosi multipla sperimentale. 

Il sistema endocannabinoide potrebbe essere coinvolto tanto nel danno 

infiammatorio che in quello neurodegenerativo in corso di SM. Esistono 

infatti consistenti evidenze a supporto del ruolo benefico della stimolazione 

dei recettori per i cannabinoidi in tale condizione patologica. Non è stato tuttavia 

mai indagato se il sistema endogeno dei cannabinoidi (endocannabinoidi) 

si trova a essere alterato nei pazienti con SM e nei topi con SM sperimentale. 

Le alterazioni della trasmissione sinaptica da noi descritte nei topi 

con EAE potrebbero essere secondarie a un rimaneggiamento del sistema 

endocannabinoide cerebrale. 


Le nostre registrazioni hanno evidenziato un’abnorme sensibilità neuronale 

alla stimolazione dei recettori NMDA nei topi EAE, in cui la frequenza 

delle correnti spontanee glutammato-mediate e l’ampiezza dei potenziali postsinaptici 

eccitatori si sono rivelate essere significativamente ridotte in presenza 

di antagonisti dei recettori NMDA. Al contrario, nei topi di controllo la 

riduzione è stata minima e non statisticamente significativa. La stimolazione 

ad elevata frequenza delle terminazioni glutammatergiche corticostriatali ha 

determinato nello striato di topi di controllo una depressione a lungo termine 

(LTD) dell’efficacia sinaptica. Tale forma fisiologica di plasticità sinaptica era 

assente nei topi EAE, e poteva essere ripristinata unicamente in seguito al 

blocco farmacologico dei recettori NMDA. 

Lo studio della trasmissione sinaptica inibitoria ha rivelato una drammatica 

riduzione della frequenza media delle correnti spontanee post-sinaptiche 

GABA-mediate nei topi con EAE, modificazione che si manifesta molto precocemente 

e si mantiene almeno fino a 90 giorni dopo l’immunizzazione. 


• Misurazione dei livelli di endocannabinoidi nel sangue periferico e nel 

liquor di pazienti con SM. 

• Misurazione dei livelli di endocannabinoidi nel cervello di topi con SM 

sperimentale. 

2007 449


• Correlazione di tali livelli con la presenza del danno degenerativo e 

infiammatorio evidenziato alla RM dell’encefalo. 

• Misurazioni delle attività di sintesi, trasporto e degradazione dei principali 

endocannabinoidi nei linfociti di pazienti con SM e nel cervello dei topi 

con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). 

• Misurazione degli effetti elettrofisiologici delle stimolazione dei recettori 

per gli endocannabinoidi nel cervello di topi con EAE. 

C.3.3 – Studi di epidemiologia molecolare, caratterizzazione 

genotipo-fenotipo ed identificazione di nuovi loci 

e geni malattia nelle malattie neurologiche (Antonio Orlacchio) 



Parole chiave: Neurogenetica; Malattie neurologiche; Analisi di linkage; Analisi 

mutazionale; Genotipo-Fenotipo; Epidemiologia molecolare. 

Descrizione 

L’attività di ricerca del Laboratorio di Neurogenetica, CERC-IRCCS 

S. Lucia, Roma verte su studi di genetica molecolare effettuati su malattie 

neurologiche. L’attività di ricerca è indirizzata a studi di “ linkage ” genetico, 

ad analisi “ mutazionali ” geniche, a studi di correlazione genotipo/fenotipo, 

a studi di genetica di popolazioni e a svariati altri studi di 

ricerca genetica di base ed applicata. Annualmente, vengono studiate un 

ampio numero di famiglie con ricorrenza di malattie neurogenetiche. La 

raccolta di queste famiglie, la definizione della regione critica tramite studi 

di linkage quando la localizzazione del gene sia nota, o in caso contrario, la 

mappatura su larga scala estesa a tutto il genoma ed infine l’identificazione 

del gene malattia tramite l’approccio posizionale del gene candidato o tramite 

analisi dei geni candidati rappresentano gli scopi principali della 

nostra ricerca. 

Risultati acquisiti 

Tra i risultati raggiunti ricordiamo: 

a) l’identificazione di un nuovo locus genetico per una variante di paraparesi 

spastica ereditaria a tramissione autosomica dominante, la Silver 

Syndrome; 

b) l’identificazione di un nuovo locus genetico per una nuova forma di 

paraparesi spastica ereditaria a tramissione autosomica dominante (SPG29); 

c) la riduzione della regione critica in cui si dovrebbe trovare il gene causativo 

della forma SPG12 di Paraparesi Spastica Ereditaria sul cromosoma 

19q. Le analisi hanno permesso di restringere moltissimo la zona in cui si 

dovrebbe trovare il gene, tra i punti D19S416 e D19S220, avvicinando così il 

momento della sua completa identificazione; 

450 2007


d) la scoperta, secondo uno studio dell’aplotipo, di una nuova mutazione 

fondatore del gene Spastina causativa di Paraparesi Spastica Ereditaria Autosomica 

Dominante nella popolazione Scozzese; 

e) la costituzione di una Banca di DNA e cellule la cui funzione è di raccogliere 

e conservare, a scopo di ricerca genetica, DNA e cellule prelevati da 

individui affetti o da portatori sani di malattie neurologiche e dai loro familiari. 

Dal 2000, data della sua istituzione, sono stati accumulati nella Banca 

più di 5000 campioni di DNA e sono state allestite approssimativamente 2500 

linee cellulari. Le procedure relative al funzionamento della Banca sono 

conformi ad un protocollo approvato dal Comitato di Bioetica della Fondazione 

Santa Lucia ed in linea con le norme etiche raccomandate dalla Federazione 

Mondiale di Neurologia; 

f) la possibilità di fornire diagnosi genetica per le seguenti patologie: 

Demenza di Alzheimer, Demenza Fronto-Temporale, Sclerosi Laterale Amiotrofica, 

Paraparesi Spastica Ereditaria, Morbo di Parkinson, Neuroacantocitosi, 

Roussy-Levy Syndrome, Atassia con aprassia oculomotoria 2 (AOA2). 


• Ampliamento del database clinico istituito il primo anno con la caratterizzazione 

fenotipica dei casi familiari e sporadici; acquisizione di ulteriori 

campioni di DNA e linee cellulari da pazienti con malattie neurologiche a 

carattere ereditario. 

• Acquisizione di dati di epidemiologia molecolare aggiuntivi a quelli del 

primo anno per le malattie neurogenetiche più comuni mediante la messa a 

punto e l’integrazione di protocolli di screening mutazionale ad elevata efficienza 

e con potenzialità di automazione per i geni noti. 

• Determinazione della frequenza di mutazioni in geni di norma e non di 

norma associati con fenotipo Paraparesi Spastica Ereditaria, Demenza di 

Alzheimer, Demenza Fronto-Temporale, Sclerosi Laterale Amiotrofica, Morbo 

di Parkinson, Neuroacantocitosi, Roussy-Levy Syndrome, Atassia con aprassia 

oculomotoria 2 (AOA2). 

• Identificazione di nuovi loci malattia: analisi di linkage in famiglie 

nucleari informative, selezione di pool di famiglie che condividono peculiarità 

fenotipiche. 

2007 451

23-Linea C-neuroscie.. - Fondazione Santa Lucia

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