Luca Battistini - Fondazione Santa Lucia

VALUTAZIONE NEUROFISIOLOGICA
E IMMUNO-MOLECOLARE IN TOPI EAE
E IN PAZIENTI CON SM E DEFICIT COGNITIVI
Coordinatore scientifico di progetto
LUCA BATTISTINI
IRCCS S. Lucia
U.O. 1 – Luca Battistini
IRCCS S. Lucia
U.O. 3 – Francesco Cecconi
Università di Roma Tor Vergata – IRCCS S. Lucia
U.O. 5 – Paola Bossù
IRCCS S. Lucia
Finanziamento 2005 – Ministero della Salute “ Programmi speciali ”
Art. 12 bis, d.lgs. 229/99

Sezione III: Attività per progetti
UNITÀ OPERATIVE COINVOLTE
U.O. 1 – Unità di Neuroimmunologia (Fondazione Santa Lucia IRCCS, Roma) –
Luca Battistini
U.O. 2 – Unità di Neuroimmunologia (Fondazione San Raffaele del Monte
Tabor, Milano) – Gianvito Martino
U.O. 3 – Unità di Neuroembriologia Molecolare (Fondazione Santa Lucia
IRCCS, Roma) – Francesco Cecconi
U.O. 4 – Laboratorio di Neurofisiologia, Dipartimento di Neuroscienze (Università
di Roma Tor Vergata) – Diego Centonze
U.O. 5 – Unità di Neuropsicobiologia Sperimentale (Fondazione Santa Lucia
IRCCS, Roma) – Paola Bossù
MOTIVAZIONI E OBIETTIVO FINALE
Nel presente progetto ci proponiamo di individuare e validare markers biologici
e funzionali associati a deficit cognitivi in pazienti con Sclerosi Multipla
(SM) e in topi EAE. Lo studio clinico, neurofisiologico, immunologico e biomolecolare
su pazienti con SM fornirà un importante complemento allo studio
puramente sperimentale. Il progetto si articola quindi in due diversi momenti:
1. L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) verrà indotta in
topi C57BL/6 mediante immunizzazione con proteina oligodendrocitaria della
mielina (MOG). Gli animali saranno quindi sacrificati in diversi momenti
dopo l’immunizzazione, corrispondenti alle fasi di picco e cronicità della
malattia e saranno studiati parametri comportamentali, elettrofisiologici,
morfologici, biomolecolari ed immunologici.
2. Parallelamente alla valutazione della fase di malattia nei topi EAE si
procederà, nei laboratori coinvolti nello studio, alla valutazione cognitiva, biomolecolare
ed immunologica in pazienti affetti da Sclerosi Multipla con
disturbi cognitivi nelle varie fasi di malattia.
Criteri e indicatori per la verifica dei risultati finali
Il progress report relativo al progetto dovrebbe riassumere i risultati ottenuti
dalle Unità Operative coinvolte. I risultati dovrebbero essere valutati considerato
ciò che era stato proposto nel progetto originario. Il coordinatore ed i
responsabili scientifici delle Unità Operative dovrebbero specificare i seguenti
punti nel progress report: risultati finali ottenuti, pubblicazioni inerenti il progetto,
differenze concernenti ciò che era stato proposto spiegando, eventualmente,
perché gli obiettivi di ricerca non sono stati raggiunti.
OBIETTIVI INTERMEDI
Nel corso della prima fase del programma, ci proponiamo di:
• Caratterizzare i processi di morte cellulare tipici di apoptosi ed autofagia
in modelli animali di encefalomielite autoimmune sperimentale.
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Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
• Validare markers fenotipici o funzionali utili a identificare nuove sottopopolazioni
di linfociti T regolatori nei topi EAE.
• Studiare l’attività funzionale dei recettori NMDA del glutammato e la
frequenza e/o ampiezza delle correnti postsinaptiche eccitatorie spontanee
(sEPSCs) registrate nello striato dei topi con EAE.
• Identificare nell’ambito delle molecole correlate al sistema dell’interleuchina-18,
potenziali marcatori biologici e funzionali associati a deficit cognitivi
nel modello animale di Sclerosi Multipla, rappresentato dai topi EAE.
Criteri e indicatori per la verifica dei risultati intermedi
Per ciascuna Unità Operativa, gli indicatori più affidabili per la verifica dei
risultati intermedi consisteranno nella riproducibilità degli stessi e nell’eventuale
consistenza di tali dati con quelli esistenti nella letteratura e ottenuti in
altri laboratori. Di cruciale importanza sarà perciò la discussione, tramite
seminari, visite, e partecipazioni a convegni, con colleghi impegnati in attività
di ricerca simili, allo scopo di individuare precocemente eventuali discrepanze
nei risultati. Un ‘work in progress’ durante un incontro tra i responsabili di
tutte le U.O. alla fine dei primi 12 mesi sarà organizzato dal coordinatore per
verificare gli obiettivi proposti e ottimizzare le tecniche impiegate.
METODOLOGIA
Experimental Allergic Encephalomyelitis (EAE) in mice – Useremo due tipi
differenti di EAE. Indurremo EAE cronico progressiva in topi C57/BL6
mediante immunizzazione con 200µg/topo di MOG35-55 (Espikem, Firenze,
Italia). Gli antigeni saranno emulsionati 1:1 in adiuvante completo di Freund
(contenente IFA più 4 mg/ml Mycobacterium Tuberculosis; ceppo H37, Difco)
e 300 µl di temulsione finale saranno iniettati nei fianchi e alla base della
coda. Inietteremo tossina pertussica (500 ng per topo) il giorno dell’immunizzazione
e 48 ore dopo. EAE ricorrente remittente in topi SJL mediante due
immunizzazioni, a distanza di 7 giorni, con 300µg/topo di PLP139-151 (Espikem,
Firenze, Italia). Gli antigeni saranno emulsionati 1:1 in adiuvante completo
di Freund (contenente IFA più 4 mg/ml Mycobacterium Tuberculosis;
ceppo H37, Difco) e 100 µl di temulsione finale saranno iniettati nei fianchi.
Inietteremo tossina pertussica (500 ng per topo) il giorno della prima immunizzazione
e 24 ore dopo. Peso e punteggio clinico saranno valutati quotidianamente
(0 = sano, 1 = paresi coda, 2 = paresi arti posteriori, 3 = plegia arti
posteriori, 4 = tetraparalisi, 5 = moribondo).
Test comportamentali – (a) Radial maze: l’apparato consiste di otto braccia
che partono da una piattaforma ottagonale. I topi saranno posti al centro
e potranno raggiungere cibo messo al termine degli otto corridoi. Per
ogni trial, verranno registrati automaticamente il numero delle scelte, il
numero delle scelte corrette prima del primo errore, il numero degli errori,
gli errori di omissione, il tempo decisionale tra le scelte, la distanza percorsa.
La durata ideale dei trial deve essere stabilita. (b) Fear-conditioning:
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Sezione III: Attività per progetti
la camera di training ha quattro pareti opache e una griglia elettrificata. Il
training e il test di contesto verranno effettuati in questa camera. Il test
dello stimolo viene effettuato in una camera differente. Il rumore di background
deve essere inferiore a 55dB. Un altoparlante e una videocamera
miniaturizzata saranno sospesi sopra le camere. I topi saranno esposti alla
camera di conditioning per 10min per i due giorni precedenti il training. Ai
topi verrà quindi somministrato il fear-conditioning consistente in 1min di
adattamento, 3min di conditioning che iniziano con 15sec di presentazione
del suono con shock elettrico negli ultimi due sec (delay fear-conditioning)
o 15sec dopo la fine del suono (trace fear-conditioning). Il test di contesto
consiste di 2min senza tono, mentre il test di stimolo di un min senza stimolo
e 1min con stimolo. Durante ogni trial verranno registrati la frequenza
di freezing in continuo sia in manuale che con registrazione automatica. (c)
Conditioned taste aversion: topi saranno messi in deprivazione d’acqua somministrando
acqua due volte al giorno per mezz’ora. Nel giorno del condizionamento
avranno a disposizione una soluzione di saccarina al 5% per
mezz’ora alla fine della quale i topi riceveranno un’iniezione intraperitoneale
di LiCl (0.15M, 20ml/kg) per causare nausea. Dopo 48, 72, e 96 h, ai
topi viene presentata saccarina o acqua per testare l’evitamento i contenitori
contenenti i fluidi per misurare il consumo.
Test immunologici – Le cellule mononucleate del sangue periferico
(PBMC) verranno isolate dal sangue periferico dei pazienti affetti da Sclerosi
Multipla mediante centrifugazione su gradiente discontinuo di densità (Ficollhypaque),
seguendo procedure standard. Per ciascuna marcatura verranno
utilizzate 0.5×10 6 PBL, in un volume finale di 100 µl. Gli anticorpi monoclonali,
coniugati con i fluorocromi appropriati, verranno aggiunti sterilmente
alle concentrazioni ottimali predeterminate, e le cellule saranno incubate a
4 C per 10 minuti. Le cellule verranno quindi lavate due volte, risospese in
250 µl PBS con 0,5% FCS, e passate al citofluorimetro per l’analisi. Per
ogni campione verranno acquisiti 2x10 6 eventi per permettere una precisa
valutazione di ogni sottopopolazione linfocitaria. Per la caratterizzazione
delle cellule T effettrici regolatorie, verranno usati i seguenti reagenti: Pannello
linfocitario: CD3, CD4, CD25, CCR6 e CD49d. Pannello cellule effettrici:
CD3, CD4, CD8, CD27, CD45RA, CD62L, pannello cellule attivate: CD25,
CD56, CD69, CD154. L’analisi dei campioni verrà effettuata su citofluorimetro
FACSCanto (Becton Dickinson), su citofluorimetro CyAn (Dako) e su High
Speed Cell Sorter MoFlo (Dako), utilizzando il software Summit per l’acquisizione
dei dati e il software FlowJo per l’analisi e la compensazione multiparametrica.
Test biomolecolari –(a) Valutazione in situ su sezioni di tessuto nervoso
ex-vivo, mediante tecniche di analisi istopatologica, immunoistochimica, analisi
ultrastrutturale al microscopio elettronico ed eventualmente immunorivelazione
su sezioni ultrafini pre-incubate con l’anticorpo d’interesse, dei tratti
biomorfologici caratteristici delle cellule apoptotiche e dei canonici marcatori
molecolari di apoptosi (attività caspasica, livelli di espressione dell’apoptosoma,
sua localizzazione sub-cellulare e frammentazione del DNA). Su
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Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
estratti proteici da tessuto verrà inoltre analizzato il grado di attivazione delle
calpaine, il livello di espressione nel tempo delle proteine della risposta allo
shock termico (hsp70, hsp27) e delle superossido dismutasi, per valutare il
grado di stress cellulare in atto. Si valuteranno poi marcatori della progressione
del danno cellulare, ossia i cosiddetti marcatori sub-letali, quali la
localizzazione della catalasi perossisomiale ed il grado di fosforilazione della
proteina tau. Infine sarà analizzato il processo autofagico mediante il rilevamento
ultrastrutturale della presenza di vescicole autofagiche, lo studio della
lipidazione di LC3 e della sua traslocazione agli autofagosomi, la localizzazione
dei precursori autofagici Beclin-1 e Ambra-1. (b) Valutazione in situ su
cellule primarie e preparati freschi (tissue slices) derivati da regioni specifiche
del sistema nervoso di animali EAE mediante le tecniche sopradescritte ed a
tempi diversi di coltura a partire dall’espianto (ad esempio, l’attivazione delle
calpiane verrà valutata dopo 20 giorni d’incubazione). In questi sistemi
in vitro si potrà anche modulare la risposta apoptotica ed autofagica,
mediante induzione di entrambi i processi. Per il rilevamento dell’autofagia
sarà possibile applicare la tecnica della misurazione del grado di acidificazione
vescicolare previo trattamento con il colorante Arancio d’acridina e successiva
valutazione al citofluorimetro dello spettro di emissione.
Test neurofisiologici – La tecnica di registrazione elettrofisiologica da singolo
neurone impiegata sarà quella di “ whole-cell patch clamp recording ”.
TRASFERIBILITÀ DEI RISULTATI E DEI PRODOTTI
Il miglioramento delle conoscenze scientifiche sulla patogenesi dei
disturbi cognitivi associati alla Sclerosi Multipla resta un obiettivo essenziale
per lo sviluppo di interventi terapeutici atti ad arrestare, ed eventualmente far
regredire, l’evoluzione del processo patologico che ne è alla base. Lo scopo
ultimo della nostra ricerca è pertanto quello di individuare dei target molecolari
e cellulari per interventi terapeutici alternativi (o complementari) a quelli
esistenti.
La qualità dei risultati finali raggiunti potrà essere valutata sulla base
della coerenza dei risultati stessi e la correttezza sperimentale utilizzata nel
loro raggiungimento. Per risultati attinenti alla ricerca di base, quali quelli
del presente progetto, lo strumento principale e comunemente accettato
per la verifica della qualità dei risultati sperimentali è dato dal giudizio di
referees internazionali, a seguito di pubblicazioni scientifiche su riviste
nazionali ed internazionali, oltre che da resoconti avuti a seguito di partecipazioni
a congressi.
I sistemi modello allestiti nel presente progetto, inoltre, saranno disponibili
per la comunità scientifica per test pre-clinici di farmaci dopo la pubblicazione
dei risultati. Allo stesso modo, i marcatori recettoriali, postrecettoriali,
sinaptici, molecolari, comportamentali e immunologici messi in luce alla fine
del progetto saranno disponibili per testare ipotesi e per la messa a punto di
trattamenti terapeutici razionali per la cura delle malattie autoimmuni del
sistema nervoso centrale.
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Sezione III: Attività per progetti
BASE DI PARTENZA SCIENTIFICA
La Sclerosi Multipla è una patologia autoimmune del sistema nervoso
centrale (SNC), in cui l’attacco immunitario, mediato da linfociti autoreattivi,
è diretto contro antigeni mielinici. Il ruolo fondamentale dei linfociti T autoreattivi
nello sviluppo della lesione demielinizzante è documentato da diverse
evidenze: (a) l’encefalite autoimmune sperimentale (EAE), modello sperimentale
murino di SM, può essere indotta mediante il trasferimento passivo di
linfociti T specifici per antigeni mielinici; (b) la caratteristica istopatologica
fondamentale della SM è rappresentata dalla lesione demielinizzante, con un
infiltrato cellulare perivenulare che sottolinea il ruolo sostanziale dei linfociti
T nel determinare il processo infiammatorio che porta al danno alla guaina
mielinica.
Dati recenti suggeriscono che in corso di SM, insieme a fenomeni infiammatori
a carico della sostanza bianca, si verificano eventi patologici neurodegenerativi
che interessano primariamente la componente neuronale del SNC.
Benché non sia ancora chiaro in che modo un danno primitivamente autoimmune
rivolto contro la componente gliale possa dare il via a fenomeni di
degenerazione neuronale, recenti dati assegnano ai cosiddetti linfociti T regolatori
e ad altri fattori non noti un ruolo critico in tale processo. In linea con
questa ipotesi, è stato dimostrato che la attività di tali cellule viene modulata
da classici neurotrasmettitori, quali la dopamina, strettamente coinvolti nella
morte neuronale degenerativa e nei rimaneggiamenti plastici della trasmissione
sinaptica che hanno luogo durante fenomeni neurodegenerativi. È da
tener presente, inoltre, che l’eventuale contributo di altri fattori immunitari,
cellulari o umorali, nella patogenesi dei deficit cognitivi e del danno neurodegenerativo
in corso di SM è ancora largamente sconosciuto. Sono disponibili
pochissimi studi sui meccanismi di plasticità e rigenerazione attivi in corso di
sclerosi multipla e nel suo modello murino, l’EAE. Nella SM il decadimento
delle funzioni cognitive è un evento di frequente riscontro ma non sono
ancora note le basi patogenetiche di tale disfunzione. Circa la metà di tutti i
pazienti affetti da SM esibiscono dei deficit misurabili mediante test neuropsicologici.
La riduzione della capacità di apprendimento e delle funzioni mnesiche
e la riduzione della velocità di elaborazione delle informazioni sono
molto frequenti e spesso si associano a deficit delle abilità visuo-spaziale e
delle funzioni esecutive.
ARTICOLAZIONE
Il completamento delle nostre conoscenze sui deficit cognitivi associati
alle malattie demielinizzanti potrà essere raggiunto solo da un approccio
integrato e multidisciplinare allo studio del processo di danno funzionale e
strutturale neuronale, che valorizzi l’interazione tra metodiche e competenze
professionali complementari. Poiché i diversi determinanti cellulari e molecolari
nel danno neuronale associato a demielinizzazione hanno un peso estremamente
variabile nelle diverse fasi della sclerosi multipla, si comprende
come sia essenziale approcciarne lo studio con metodiche differenti in grado
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Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
di individuare e caratterizzare quei fattori che sono in primo piano nella fase
infiammatoria e degenerativa immunomediata. Le molteplici metodiche e
competenze professionali coinvolte nel presente progetto permetteranno di
osservare da varie angolazioni gli eventi cellulari, immunologici e biomolecolari
coinvolti nel processo di danno neuronale responsabile di deficit cognitivi
in patologie demielinizzanti, fornendo una visione completa dei meccanismi
patologici operanti.
L’obiettivo finale del progetto è quello di individuare e validare markers
biologici e funzionali associati a deficit cognitivi in pazienti con Sclerosi Multipla.
Per raggiungere tale obiettivo diversi aspetti del problema verranno studiati.
Metodiche di citometria a flusso, elettrofisiologia, biologia molecolare e
metodiche più classicamente immunologiche (ELISA, proliferazioni, assays di
migrazione e di adesione, etc.) verranno impiegati. Sia pazienti con SM sia
topi affetti dalla forma sperimentale di malattia (EAE) con deficit cognitivi e
non verranno impiegati per avere la possibilità di confermare anche in vivo in
topi con EAE ciò che verrà misurato ex-vivo nei pazienti. Il gruppo proponente
è qualificato per svolgere tale progetto, possiede competenze complementari
ed ha una lunga e documentata esperienza nella materia oggetto
dello studio. Il progetto si divide in 2 workpackages che di seguito sono
meglio dettagliati.
WP 1 – L’induzione della EAE dovrà avvenire in topi C57/bl6 femmine
(6-8 settimane) mediante immunizzazione con iniezione sottocutanea di 200
microgrammi di MOG35-55 (o peptide PLP 139-151 per il modello ricorrenteremittente)
in adiuvante di Freund (Difco, Detroit, MI, USA) supplementato
con 4 mg/ml di Micobacterium tuberculosis (ceppo H37Ra; Difco). I topi,
inoltre, riceveranno 500 ng di tossina pertussica ev (Sigma, St. Louis, MI,
USA) al momento dell’immunizzazione e 48 ore dopo.
Nei topi con EAE, le valutazioni comportamentali, immunologiche, biomolecolari
ed elettrofisiologiche verranno effettuate durante le fasi acuta e
cronica di malattia che seguono l’immunizzazione.
Studio comportamentale – Verranno messi a punto test comportamentali
in grado di valutare in topi affetti da EAE funzioni cognitive come la memoria
spaziale, la memoria associativa e la velocità di elaborazione. Ottimizzeremo
i protocolli per il radial maze, il fear-conditioning e il conditioning taste aversion
per topi affetti da EAE cronica o ricorrente remittente, adattandoli alle
loro abilità motorie. Useremo due modelli differenti di EAE, uno cronicoprogressivo
indotto in topi C57/BL6 mediante immunizzazione con MOG35-
55 e uno di EAE ricorrente-remittente indotto in topi SJL mediante immunizzazione
con PLP139-151. La memoria spaziale sarà valutata mediante radial
maze, la memoria associativa mediante fear-conditioning e il conditioning
taste aversion, mentre la velocità di elaborazione sarà indagata usando protocolli
ravvicinati o spaziati dei due test precedenti. Le abilità motorie saranno
valutate prima dei test cognitivi mediante footprint e rotarod.
Studio elettrofisiologico – Mediante l’impiego di un vibratomo verranno
preparate delle fettine di tessuto cerebrale dei topi con EAE che presente-
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Sezione III: Attività per progetti
ranno o meno deficit cognitivi. Tali fettine comprenderanno il nucleo striato e
la corrispondente corteccia cerebrale. Da tali fettine, mantenute vitali grazie
ad un sistema di perfusione con liquido cerebrospinale artificiale ossigenato e
mantenuto a temperatura costante, verranno effettuate delle registrazioni
elettrofisiologiche da singolo neurone striatale. La tecnica utilizzata sarà
quella del “ whole-cell recording ” in modalità di “ voltage-clamp ”. I neuroni
striatali verranno individuati per le loro proprietà di membrana e morfologiche.
L’identificazione morfologica sarà possibile grazie all’impiego di una tecnica
di microscopia a raggi infrarossi che permetterà di distinguere i neuroni
di minore diametro cellulare (20-30 µm), tipico dei neuroni di proiezione, da
quelli di maggiori dimensioni (30-50 µm), tipico degli interneuroni.
Allo scopo di isolare farmacologicamente gli eventi sinaptici GABAergici
da quelli glutammatergici, tutte le nostre registrazioni verranno inizialmente
effettuate in presenza di CNQX ed MK-801 per bloccare sia i recettori AMPA
che NMDA del glutammato. Grazie ad un elettrodo di stimolazione bipolare
posto all’interno dello striato, stimoleremo le fibre GABAergiche e registreremo
in questo modo delle correnti postsinaptiche inibitorie evocate (eIPSCs)
nei neuroni registrati. Studieremo inoltre la frequenza e l’ampiezza delle correnti
postsinaptiche inibitorie spontanee (sIPSCs), registrate cioè senza
alcuna stimolazione. Così come visto per la trasmissione GABAergica, le eventuali
alterazioni sinaptiche presenti nei topi EAE con e senza deficit cognitivi
verranno valutate sia su correnti postsinaptiche eccitatorie evocate (eEPSCs)
che spontanee (sEPSCs).
Studio immunologico – Dagli animali sacrificati verrà prelevata la milza
per un parallelo studio immunologico.
Nel presente progetto intendiamo studiare le caratteristiche fenotipiche e
funzionali di sottopopolazioni linfocitarie in vivo, nei topi EAE con deficit
cognitivi e non. Studieremo la frequenza e distribuzione delle sottopopolazioni
linfocitarie T effettrici e T regolatorie e le loro caratteristiche di memoria
immunologica e di attivazione nei diversi gruppi di animali. Lo stato di
attivazione linfocitaria verrà poi valutato in relazione alle varie fasi di malattia
e alle eventuali alterazioni cognitive e neurofisiologiche.
Le cellule della milza vengono isolate mediante centrifugazione su gradiente
discontinuo di densità (Ficoll-hypaque). Brevemente, dopo centrifugazione
per 30 minuti a 660g, le cellule mononucleate sono raccolte dall’interfaccia
del gradiente e lavate tre volte in RPMI centrifugando nuovamente a
430g per 10 minuti ed infine sospese in RPMI 1640 supplementato con 10%
FCS, 2mM di L-glutammina e 10 U/ml di penicillina e streptomicina e utilizzate
per l’analisi citofluorimetrica.
Anticorpi specifici per CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD49d, CD62L,
CD69, CCR6, αβ TCR saranno acquistati da Becton-Dickinson. L’analisi
dei campioni verrà effettuata su citofluorimetro FACSCanto Becton Dickinson,
Cyan e su Sorter MoFlo (Dako). Per ogni campione verranno selezionati
15.000 linfociti in base a criteri di dimensione (FSC) e di granulosità
(SSC). I risultati saranno analizzati usando i software Summit (Cytomation)
e FloJo (TreeStar).
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Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
Verranno prelevati inoltre monociti e macrofagi isolati dalla milza e/o da
lavaggi peritoneali dagli animali sacrificati per lo studio dell’espressione della
citochina IL-18 e delle molecole ad essa correlate. In seguito a stimolazione in
vitro con molecole infiammatorie (es. LPS) i sovranatanti e le cellule stesse
verranno analizzati per valutare l’espressione di IL-18, IL-18 Binding Protein
e delle due catene recettoriali di IL-18, mediante PCR quantitativa (Real Time
PCR), saggi immunoenzimatici e citofluorimetrici. Allo scopo di verificare l’efficacia
del sistema IL-18 quale possibile marcatore di patologia nell’EAE i
risultati ottenuti da questa attività verranno comparati con i risultati derivati
dagli altri studi di questo stesso WP.
Studio biomolecolare – Verrà valutata l’insorgenza di tratti patologici
molecolari ed istologici in tessuti ex-vivo di origine corticale e sottocorticale e
cellule primarie corticali e sottocorticali derivate da topi con EAE nelle varie
fasi di malattia con deficit cognitivi e non. Ad una prima analisi si verificherà
la presenza di alterazioni morfologiche a livello dei processi neuritici. Dal
punto di vista molecolare verranno quindi verificati i seguenti parametri di
stress e morte cellulare:
– attivazione di calpaine dopo 20 giorni di incubazione;
– analisi dei tratti tipici dell’apoptosi (attivazione delle caspasi, livelli dell’apoptosoma
e frammentazione del DNA);
– incremento delle proteine di risposta allo shock termico hsp70 e hsp27
e decremento della proteina di risposta allo stress ossidativo MnSOD;
– iperfosforilazione di tau;
– localizzazione sub-cellulare della catalasi;
– formazione di autofagolisosomi in risposta a deprivazione di nutrienti
(mediante immunoistochimica per le proteine traslocanti Beclin1 e LC3 e
analisi morfologica ultrastrutturale per EM).
WP 2 – Selezione, reclutamento pazienti e test cognitivi – Per il secondo
obiettivo dello studio, arruoleremo 60 pazienti con SM afferenti al Centro per
la Diagnosi e Cura della SM dell’Università di Tor Vergata diretto dal Dr. Centonze.
In tali pazienti intendiamo effettuare un’analisi dettagliata della eventuale
relazione esistente tra attività clinico-radiologica di malattia, presenza o
assenza di deficit cognitivi e marcatori immunologici correlati. Tali pazienti
saranno valutati clinicamente (Expanded Disability Status Scale (EDSS) ogni
3 mesi), radiologicamente (Risonanza Magnetica Cerebrale con e senza gadolinio
ogni 12 mesi). Saranno effettuati prelievi ematici per le valutazioni
immunofenotipiche delle cellule linfocitarie in pazienti nelle varie fasi di
malattia con e senza deficit cognitivi. La durata complessiva dello studio sarà
di 24 mesi.
Criteri d’inclusione:
– Pazienti con SM definita secondo i criteri di Mc Donalds.
– Età: 18-50 anni.
– Durata di malattia: 2-20 anni.
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Sezione III: Attività per progetti
– EDSS: 0-6.
– Anamnesi negativa per patologie neoplastiche.
– Consenso informato.
Criteri d’esclusione:
– Pazienti che abbiano di recente cambiato regime terapeutico (p.es. iniziato
interferone da meno di 3 mesi) o effettuato terapia corticosteroidea
da meno di 60 giorni.
– Pazienti partecipanti ad altri trials sperimentali.
– Donne in stato di gravidanza, durante allattamento o che desiderino
una gravidanza.
– Gravi patologie psichiatriche.
– Abuso di alcool e sostanze stupefacenti.
– Gravi malattie sistemiche (con particolare riferimento ad endocrinopatie
e malattie metaboliche).
– Traumi cranici con sequelae.
– Depressione valutata mediante scala di Beck.
– Gravi menomazioni e disabilità che possano interferire con l’esecuzione
dei test.
Tutti i pazienti, al momento dell’arruolamento, verranno sottoposti ad
una valutazione neurologica tramite l’EDSS (Expanded Disability Status
Scale). La valutazione della disabilità mediante EDSS verrà ripetuta ogni 6
mesi. La performance cognitiva e la RM verranno invece effettuate a cadenza
annuale. Tutti i pazienti al momento dell’arruolamento verranno sottoposti ad
una valutazione delle funzioni cognitive che verrà eseguita ogni anno per
2 anni. Tutti i pazienti verranno sottoposti ai test 2 volte per una completa
definizione delle capacità neuropsicologiche. I pazienti verranno sottoposti a
batteria di Rao e lo Stroop test per le funzioni esecutive. Per la valutazione
cognitiva verrà utilizzata la batteria di Rao (usando le versioni alternative per
evitare l’effetto learning). Gli esami verranno suddivisi in due blocchi: il primo
blocco corrisponde all’esame clinico ed alla somministrazione degli strumenti
di autovalutazione; il secondo blocco corrisponde alla somministrazione della
scala di Hamilton ed alla valutazione cognitiva.
Studio immunologico – Caratterizzazione immunofenotipica e funzionale
dei linfociti Treg. Per definire con precisione le sottopopolazioni delle cellule
regolatorie verrà utilizzata la citofluorimetria policromatica. I linfociti Treg
verranno grossolanamente identificati mediante marcatura con CD3, CD4, e
CD25, e le diverse sottopopolazioni verranno identificate mediante l’uso di
anticorpi monoclonali specifici per altri marker (vedi sotto). All’interno della
popolazione di linfociti T CD4+, sulla base dell’espressione del CD25 possono
essere identificate tre popolazioni distinte di cellule: CD25 high , CD25 low , e
CD25 neg , ed è stato suggerito che la capacità soppressoria risieda principalmente
nella popolazione di linfociti CD25 high , che è anche caratterizzata da
mancanza di proliferazione in seguito a stimolazione in vitro senza l’aggiunta
di IL-2. Dunque, le diverse popolazioni di CD4+CD25 high CD4+CD25 low , e
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Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
CD4+CD25 neg possono essere sortate, e in effetti le cellule CD4+CD25 high sono in
grado di inibire la proliferazione di cellule stimolate con anti-CD3; al contrario,
le cellule CD4+CD25 low proliferano vigorosamente insieme alle cellule “ responder
”, confermando che si tratta di una popolazione di cellule attivate prive di
abilità soppressorie. Come previsto, le cellule CD25 neg , che sono costituite principalmente
da cellule naive non effettrici, non inibiscono la proliferazione.
L’espressione di recettori per le chemochine, e di marcatori della memoria
immunologica verrà analizzata in combinazione con marcatori
caratteristici delle cellule Treg (CD3, CD4, CD25), permettendo così l’identificazione
delle diverse sottopopolazioni Treg. Mediante citofluorimetria
policromatica verranno analizzati fino a 7 parametri su ogni singola cellula,
ottenendo così un “ ritratto ” preciso delle sottopopolazioni linfocitarie. Le
cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) verranno isolate dal
sangue periferico dei pazienti affetti da Sclerosi Multipla mediante centrifugazione
su gradiente discontinuo di densità (Ficoll-hypaque), seguendo procedure
standard. Per ciascuna marcatura verranno utilizzate 0.5x10 6 PBL,
in un volume finale di 100 µl. Gli anticorpi monoclonali, coniugati con i
fluorocromi appropriati, verranno aggiunti sterilmente alle concentrazioni
ottimali predeterminate, e le cellule saranno incubate a 4 C per 10 minuti.
Le cellule verranno quindi lavate due volte, risospese in 250 µl PBS con
0,5% FCS, e passate al citofluorimetro per l’analisi. Per ogni campione verranno
acquisiti 2 × 10 6 eventi per permettere una precisa valutazione di ogni
sottopopolazione linfocitaria.
Per la caratterizzazione delle cellule T effettrici regolatorie, verranno usati
i seguenti reagenti: Pannello linfocitario: CD3, CD4, CD25, CCR6 e CD49d.
Pannello cellule effettrici: CD3, CD4, CD8, CD27, CD45RA, CD62L. Pannello
cellule attivate: CD25, CD56, CD69, CD154.
L’analisi dei campioni verrà effettuata su citofluorimetro FACSCanto
(Becton Dickinson), su citofluorimetro CyAn (Dako) e su High Speed Cell Sorter
MoFlo (Dako), utilizzando il software Summit per l’acquisizione dei dati e
il software FlowJo per l’analisi e la compensazione multiparametrica.
Valuteremo inoltre l’espressione di IL-18 e delle molecole ad essa correlate
(IL-18 BP, IL-18Rα, IL-18Rβ) nel siero e nei PBMC isolati da pazienti con
MS con deficit cognitivi e non. Mediante analisi immunoenzimatica saranno
valutati i livelli circolanti di IL-18 e del suo antagonista IL-18BP. Inoltre, con
le cellule ottenute dagli stessi individui saranno effettuate delle stimolazioni
in vitro e l’espressione di IL-18, IL-18 Binding Protein e delle due catene recettoriali
di IL-18, verrà valutata mediante PCR quantitativa (Real Time PCR),
saggi immunoenzimatici e citofluorimetrici. Allo scopo di verificare l’efficacia
del sistema IL-18 quale possibile marcatore di patologia nell’MS i risultati
ottenuti da questa attività verranno comparati con i risultati derivati dagli
altri studi di questo stesso WP.
Studio biomolecolare dei processi di morte cellulare nel sistema immune
– Alcuni sistemi ligando-recettore della famiglia dei recettori di morte,
quali il sistema TNF od il sistema CD95/Fas, orchestrano in modo efficace la
risoluzione dell’infiammazione ed il controllo delle reazioni immuni definendo
2006 789

Sezione III: Attività per progetti
popolazioni uniche di cellule T regolatorie (Treg), modulandone l’apoptosi ed
influenzando la risposta dell’ospite alle infezioni. Inoltre, alcuni sottotipi Treg
mostrano citotossicità dipendente dal pathway della perforina e del granzima
B, rivolta contro cellule bersaglio autologhe, quali cellule T attivate CD4+ e
CD8+, monociti CD14+ e cellule dendritiche mature ed immature. Entrambi i
pathways coinvolti sinora nel controllo della risposta immune sono pathways
estrinseci di morte cellulare, ovvero dipendenti da segnali esogeni.
Poco o nulla si sa del controllo della morte cellulare nell’autoimmunità
esercitato dalla via intrinseca all’apoptosi, cioè quella regolata dal mitocondrio
e dal complesso multimolecolare definito apoptosoma. questo è composto
dalla proteasi caspasi 9 e dalla molecola adattatrice Apaf1. Poiché tale
pathway è definito come amplificatorio del pathway dei recettori di morte
nel sistema immune durante il suo sviluppo, è di importanza fondamentale
studiare e valutare il ruolo svolto dalle molecole del pathway intrinseco di
morte nella sopravvivenza di singole popolazioni di Treg nei pazienti appartenenti
ai gruppi sopra descritti. A questo scopo verranno saggiate in queste
popolazioni cellulari in vitro ed in situ i livelli di espressione di mRNA e
proteina dei geni chiave dei pathway estrinseci ed estrinseci di morte (Fas,
FasL, TNF, TNFR, TRAIL, APAF1, CASP9, CASP7, CASP3, CASP12). Dal
punto di vista funzionale si valuteranno le capacità di tali cellule di rilasciare
il citocromo c dal mitocondrio in risposta a stimoli di morte
mediante frazionamento cellulare e successivo immunoblot e mediante analisi
per microscopia confocale.
A questo scopo verranno usati anche test di attività in vitro e tecniche di
immunoistochimica.
OUTPUT
0-6 mesi – Nei primi mesi della ricerca verranno messi a punto i modelli
animali delle malattie degenerative oggetto del presente progetto, così come
l’allestimento delle co-colture cellulari e l’addestramento comportamentale
degli animali di laboratorio. Inizierà inoltre la raccolta dei dati preliminari
dello studio da parte di ogni singola Unità Operativa.
6-24 mesi – Analisi statistica dei dati ottenuti e preparazione di manoscritti
per eventuale pubblicazione.
0-24 mesi – Verranno organizzati incontri periodici tra le diverse Unità
Operative. Tali incontri saranno facilitati dalla favorevole disposizione logistica
dei vari laboratori di ricerca, così come dalla esistenza di consolidati
rapporti di collaborazione tra alcuni dei gruppi coinvolti. Grazie a tali periodici
incontri, ciascun gruppo avrà un costante aggiornamento sull’andamento
della ricerca degli altri laboratori, traendone utili input per lo svolgimento del
proprio lavoro. Verranno inoltre organizzati degli incontri e seminari con altri
scienziati nazionali ed internazionali per la discussione dei dati.
0-24 mesi – Partecipazione alla formazione di dottorandi di ricerca e
medici specializzandi in neurologia.
790 2006

Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
12-24 mesi – I risultati ottenuti nel corso dello svolgimento del presente
progetto verranno pubblicati su riviste scientifiche nazionali ed internazionali,
per cui potranno essere messi a disposizione della intera comunità scientifica
internazionale. In aggiunta a pubblicazioni internazionali, i dati ottenuti
da questo progetto verranno presentati a congressi nazionali ed internazionali
e quindi discussi con scienziati attivamente impegnati nella ricerca clinica e
di base riguardante le patologie autoimmuni del sistema nervoso centrale. In
questo modo solleciteremo lo sviluppo di idee e lo scambio di informazioni
utili per il progresso della ricerca in tale settore delle neuroscienze.
Si allega il programma dettagliato delle Unità Operative 1, 3 e 5 che
fanno capo alla Fondazione Santa Lucia IRCCS.
2006 791

Sezione III: Attività per progetti
U.O. 1 – Unità di Neuroimmunologia
Luca Battistini
OBIETTIVO FINALE DEL CONTRIBUTO
Identificazione di Markers fenotipici o funzionali utili a identificare
nuove sottopopolazioni di linfociti T regolatori nei topi EAE e nei pazienti
affetti da Sclerosi Multipla con disturbi cognitivi.
Criteri e indicatori per la verifica dei risultati finali
Pubblicazioni scientifiche su riviste internazionali.
OBIETTIVI INTERMEDI
Validazione delle tecniche di “ sorting ” ad alta velocità e di analisi fenotipica
a 7 colori mediante citofluorimetria per gli obiettivi prefissati.
Criteri e indicatori per la verifica dei risultati intermedi
Pubblicazioni scientifiche su riviste internazionali. Alla fine della prima
fase del progetto il responsabile dell’U.O. dovrebbe scrivere un riassunto dei
risultati ottenuti, descrivendo le priorità sperimentali nei successivi 12 mesi
per portare a termine gli obiettivi proposti.
METODOLOGIA
L’espressione di recettori per le chemochine e di marcatori della memoria
immunologica verrà analizzata in combinazione con marcatori caratteristici
delle cellule Treg (CD3, CD4, CD25), permettendo così l’identificazione delle
diverse sottopopolazioni Treg. Mediante citofluorimetria policromatica verranno
analizzati fino a 9 parametri su ogni singola cellula, ottenendo così un
“ ritratto ” preciso delle sottopopolazioni linfocitarie.
Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) verranno isolate
dal sangue periferico dei pazienti affetti da Sclerosi Multipla mediante centrifugazione
su gradiente discontinuo di densità (Ficoll-hypaque), seguendo procedure
standard. Per ciascuna marcatura verranno utilizzate 0.5 × 10 6 PBL, in
un volume finale di 100 µl. Gli anticorpi monoclonali, coniugati con i fluorocromi
appropriati, verranno aggiunti sterilmente alle concentrazioni ottimali
predeterminate, e le cellule saranno incubate a 4 C per 10 minuti. Le cellule
verranno quindi lavate due volte, risospese in 250 µl PBS con 0,5% FCS, e
passate al citofluorimetro per l’analisi. Per ogni campione verranno acquisiti
2 × 10 6 eventi per permettere una precisa valutazione di ogni sottopopolazione
linfocitaria.
792 2006

Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
Per la caratterizzazione delle cellule T effettrici regolatorie, verranno usati
i seguenti reagenti: Pannello linfocitario: CD3, CD4, CD25, CCR6 e CD49d.
Pannello cellule effettrici: CD3, CD4, CD8, CD27, CD45RA, CD62L. Pannello
cellule attivate: CD25, CD56, CD69, CD154.
L’analisi dei campioni verrà effettuata su citofluorimetro FACSCanto
(Becton Dickinson), su citofluorimetro CyAn (Dako) e su High Speed Cell Sorter
MoFlo (Dako), utilizzando il software Summit per l’acquisizione dei dati e
il software FlowJo per l’analisi e la compensazione multiparametrica.
2006 793

Sezione III: Attività per progetti
U.O. 3 – Laboratorio di Neuroembriologia Molecolare
Francesco Cecconi
OBIETTIVO FINALE DEL CONTRIBUTO
Il contributo di questa U.O. al programma consiste nella dettagliata analisi
biomolecolare della morte cellulare in modelli animali di encefalomielite
autoimmune sperimentale (EAE) ed in popolazioni di cellule Treg di pazienti
affetti da sclerosi multipla (MS) con/senza deficit cognitivo, con particolare
attenzione ai marcatori di apoptosi (in primo luogo caspasi attive ed apoptosoma)
ed autofagia (regolazione della formazione di autofagosomi ed autofagolisosomi).
Si ritiene che il deficit cognitivo possa trovare riscontro in un
processo di perdita neuronale nelle condizioni sopra descritte.
Criteri e indicatori per la verifica dei risultati finali
Il gruppo di ricerca pubblica su riviste scientifiche internazionali di
elevato profilo ed impact factor e conseguentemente è noto in campo internazionale
nell’ambito dello studio biomolecolare della morte cellulare. Conseguentemente,
si prevede un impatto dei risultati conseguiti sotto forma di
presentazioni a congressi nazionali ed internazionali e pubblicazioni su riviste
internazionali con fattore d’impatto.
OBIETTIVI INTERMEDI PREVISTI
Nel corso della prima fase del programma, questa U.O. si propone di
caratterizzare i processi di morte cellulare tipici di apoptosi ed autofagia in
modelli animali di encefalomielite autoimmune sperimentale. Oggetto cellulare
della ricerca saranno neuroni e cellule gliali nelle aree interessate. Si propone
anche la messa a punto di colture cellulari primarie a partire dai modelli
animali in questione per la manipolazione delle molecole coinvolte in tale
processo. In dettaglio, sarà verificata la presenza di marcatori molecolari ed
istopatologici in tessuti ex-vivo ed in cellule primarie di origine corticale e
subcorticale da animali EAE a diversi stadi della malattia ed in presenza o
assenza di deficit cognitivo. In prima istanza si verificherà la presenza di anomalie
morfologiche a carico dei neuriti. In seguito verranno studiati i marcatori
di stress e morte cellulare dal punto di vista biochimico e molecolare.
Criteri e indicatori per la verifica dei risultati intermedi
Dopo il primo anno di attività, lo stato di avanzamento del progetto sarà verificato
in un incontro tra le unità, nell’ambito del quale saranno presentati i dati
sperimentali ottenuti. Tali dati saranno quantificabili come numero di abstracts
da sottomettere a Congressi, eventuali manoscritti in preparazione o già inviati
per la pubblicazione, applicazioni per brevetti. L’eventuale messa a punto di protocolli
sperimentali innovativi sarà analogamente verificata in tale ambito.
794 2006

Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
METODOLOGIA
Nell’ambito della prima fase del programma, verranno utilizzate le
seguenti metodologie per l’analisi dei modelli animali EAE a vari stadi di progressione
della malattia, e associata a relativi controlli non trattati.
1. Valutazione in situ su sezioni di tessuto nervoso ex-vivo, mediante tecniche
di analisi istopatologica, immunoistochimica, analisi ultrastrutturale al
microscopio elettronico ed eventualmente immunorivelazione su sezioni
ultrafini pre-incubate con l’anticorpo d’interesse, dei tratti biomorfologici
caratteristici delle cellule apoptotiche e dei canonici marcatori molecolari di
apoptosi (attività caspasica, livelli di espressione dell’apoptosoma, sua localizzazione
sub-cellulare e frammentazione del DNA). Su estratti proteici da tessuto
verrà inoltre analizzato il grado di attivazione delle calpaine, il livello di
espressione nel tempo delle proteine della risposta allo shock termico (hsp70,
hsp27) e delle superossido dismutasi, per valutare il grado di stress cellulare
in atto. Si valuteranno poi marcatori della progressione del danno cellulare,
ossia i cosiddetti marcatori sub-letali, quali la localizzazione della catalasi
perossisomiale ed il grado di fosforilazione della proteina tau. Infine sarà analizzato
il processo autofagico mediante il rilevamento ultrastrutturale della
presenza di vescicole autofagiche, lo studio della lipidazione di LC3 e della
sua traslocazione agli autofagosomi, la localizzazione dei precursori autofagici
Beclin-1 e Ambra-1.
2. Valutazione in situ su cellule primarie e preparati freschi (tissue slices)
derivate da regioni specifiche del sistema nervoso di animali EAE mediante le
tecniche sopradescritte ed a tempi diversi di coltura a partire dall’espianto (ad
esempio, l’attivazione delle calpiane verrà valutata dopo 20 giorni d’incubazione).
In questi sistemi in vitro si potrà anche modulare la risposta apoptotica
ed autogafica, mediante induzione di entrambi i processi. Per il rilevamento
dell’autofagia sarà possibile applicare la tecnica della misurazione del grado di
acidificazione vescicolare previo trattamento con il colorante Arancio d’acridina
e successiva valutazione al citofluorimetro dello spettro di emissione.
Nella seconda fase del programma, si utilizzeranno diverse metodologie
per l’analisi dei processi di morte cellulare in diverse popolazioni di cellule
Treg di pazienti affetti da MS in presenza o assenza di deficit cognitivo. In
particolare, verranno testati in sospensioni cellulari in situ mediante tecniche
di microscopia confocale ed in vitro, su estratti derivati, i livelli di mRNA e
proteine codificati da geni chiave dei percorsi metabolici (pathways) intrinseci
ed estrinseci dell’apoptosi, quali Fas, FasL, TNF, TNFR, TRAIL, APAF1,
CASP9, CASP7, CASP3, CASP12. Verrà anche valutata la capacità di tali cellule
di attivare il pathway mitocondriale dell’apoptosi, mediante la rilevazione
dell’avvenuto rilascio del citocromo c dal mitocondrio, un marcatore dell’attivazione
dell’apoptosoma, in seguito ad esperimenti di frazionamento subcellulare
e successivi esperimenti di immunoblotting. Seguiranno approcci
biochimici e fluorimetrici per l’analisi dell’attivazione delle caspasi in tali
popolazioni cellulari ed in modo differenziale fra gruppi di pazienti selezionati
dalle altre U.O.
2006 795

Sezione III: Attività per progetti
U.O. 5 – Laboratorio di Neuropsicobiologia Sperimentale
Paola Bossù
OBIETTIVO FINALE DEL CONTRIBUTO
La citochina interleuchina (IL)-18, molecola pro-infiammatoria implicata
nella regolazione della risposta immune sia di tipo innato che acquisito, è
stata recentemente proposta quale elemento chiave di alcuni processi neurodegenerativi.
Diversi studi hanno suggerito l’implicazione di IL-18 tanto nel
modello murino della encefalomielite autoimmune EAE, quanto nella sclerosi
multipla. Parallelamente, in un recente studio, proprio il nostro gruppo di
ricerca ha evidenziato l’esistenza di un’associazione significativa tra un polimorfismo
del promotore di IL-18 e un incrementato deterioramento delle funzioni
cognitive dei pazienti con demenza di Alzheimer, oltre a una correlazione
significativa tra produzione aumentata di IL-18 nei PBMC di questi
pazienti e peggioramento del deficit cognitivo, suggerendo una possibile
implicazione di IL-18 nell’insorgenza di demenza. Partendo dal concetto che
meccanismi comuni di amplificazione neurodegenerativa immuno-mediati
possano essere coinvolti nei processi di deficit cognitivo, il presente studio si
basa sull’ipotesi che la citochina IL-18 possa essere utilizzata come marcatore
di demenza anche nella Sclerosi Multipla.
Lo specifico contributo dei questa U.O. sarà pertanto quello di studiare il
sistema IL-18 nel modello murino di EAE e nei pazienti con Sclerosi Multipla,
allo scopo di identificare possibili implicazioni di questa citochina nei meccanismi
neurodegenerativi delle patologie demielinizzanti autoimmunitarie, per
l’identificazione di potenziali marcatori biologici e funzionali associati a deficit
cognitivi.
Criteri e indicatori per la verifica dei risultati finali raggiunti
Riscontro di una deregolazione a carico del sistema dell’interleuchina-18
in pazienti con Sclerosi Multipla e decadimento delle funzioni cognitive.
Successiva conferma dell’esistenza di un’associazione tra espressione
di IL-18 e/o eventuali molecole ad essa correlate e i parametri del deficit
cognitivo rilevati in pazienti con Sclerosi Multipla.
OBIETTIVI INTERMEDI PREVISTI
Identificazione, nell’ambito delle molecole correlate al sistema dell’interleuchina-18,
di potenziali marcatori biologici e funzionali associati a deficit
cognitivi nel modello animale di Sclerosi Multipla, rappresentato dai topi EAE.
Criteri e indicatori per la verifica dei risultati intermedi raggiunti
Riscontro di una deregolazione a carico del sistema dell’interleuchina-18
in topi con EAE con disturbi cognitivo-comportamentali.
796 2006

Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
Successiva conferma dell’esistenza di associazione tra espressione di IL-
18 e/o eventuali molecole ad essa correlate e parametri di deficit cognitivo
rilevati in topi con EAE.
METODOLOGIA
Per lo studio dell’espressione di IL-18 e delle molecole ad essa correlate
nei topi EAE, verranno prelevati dagli animali monociti e macrofagi isolati
dalla milza e/o da lavaggi peritoneali. Più in dettaglio, dai topi EAE sacrificati
in diversi momenti dopo l’immunizzazione, verranno prelevate sterilmente e
disperse le milze mediante disgregazione meccanica. Le sospensioni cellulari
ottenute, dopo lisi dei globuli rossi, verranno lavate in RPMI, contate in
trypan blue ed incubate in terreno completo a +37°C, 5% CO 2
, in assenza o in
presenza di molecole infiammatorie (es. LPS). I sovranatanti di coltura e gli
splenociti verranno rispettivamente analizzati per valutare l’espressione di
IL-18 e IL-18 Binding Protein (IL-18BP) mediante saggi immunoenzimatici
commerciali (MBL e R&D Systems), oppure mediante l’analisi in Real-Time
PCR volta a valutare l’espressione genica della citochina. Verranno inoltre
analizzate tramite citofluorimetria a flusso le due catene recettoriali di IL-18
(IL-18Rα e IL-18Rβ) in associazione all’espressione dei principali marcatori
molecolari caratteristici delle popolazioni cellulari presenti nella milza
(es. CD3, CD4, CD8, CD19, CD94, CD14).
In alternativa, verranno utilizzati i macrofagi peritoneali, ottenuti in
seguito a lavaggio con PBS della cavità peritoneale. I macrofagi ottenuti verranno
messi in coltura in terreno completo in presenza di opportuni stimoli
infiammatori (es. LPS). Anche in questo caso verranno analizzati i livelli di
IL-18, IL-18BP sia in termini di concentrazione proteica nei sovranatanti di
coltura, tramite saggi immunoenzimatici, sia mediante analisi dei livelli di
espressione genica con Real-Time PCR. I macrofagi peritoneali saranno inoltre
analizzati tramite citofluorimetria a flusso per verificare l’espressione di
IL-18Rα e IL-18Rβ in associazione all’espressione dei principali marcatori
molecolari di questa popolazione cellulare murina (es. CD14, CD11b, CD11c,
CD16, CD32, CD64, MHC-I e MHC-II). Allo scopo di verificare l’efficacia del
sistema IL-18 quale possibile marcatore di patologia nell’EAE, in particolare
in associazione al deficit cognitivo, i risultati ottenuti da questa attività verranno
comparati con i risultati derivati dagli altri studi di questo stesso WP1.
Parallelamente, nel WP2 sarà valutata l’espressione dell’IL-18 e delle
molecole ad essa correlate (IL-18BP, IL-18Rα, IL-18Rβ) nel siero e
nei PBMC isolati da pazienti con MS con deficit cognitivi e dei relativi soggetti
di controllo. A tale scopo il sangue proveniente dai pazienti verrà
raccolto per mezzo di provette contenenti un attivatore della coagulazione per
preparare il siero che, aliquotato e conservato a -80°C, sarà utilizzato per
analizzare tramite saggi immunoenzimatici la quantità circolante di IL-18 e di
IL-18BP.
Parallelamente, dallo stesso prelievo, il sangue sarà raccolto anche in provette
contenenti EDTA, quindi in seguito a passaggio su gradiente di densità,
verranno recuperate le cellule mononucleate. Queste cellule saranno stimolate
2006 797

Sezione III: Attività per progetti
a vari tempi con differenti dosi di LPS, allo scopo di verificare l’attivazione
genica di IL-18 e IL-18BP, mediante analisi con Real-Time PCR, oppure la
produzione, tramite saggi ELISA, delle proteine IL-18 e IL-18BP presenti nel
sovranatante di coltura. Per quanto riguarda le cellule provenienti dal sangue
periferico e stimolate con LPS, verrà anche effettuata l’analisi citofluorimetrica
dei marcatori molecolari delle principali popolazioni cellulari (es. CD3,
CD4, CD8, CD19, CD94, CD14, CD11b, CD11c, CD16, CD32, CD64, MHC-I e
MHC-II) in associazione all’espressione delle catene recettoriali di IL-18
(IL-18Rα e IL-18Rβ). Per finire, i livelli proteici e di espressione genica di
IL-18 e di IL-18BP verranno messi in relazione ai parametri clinici relativi ai
disturbi cognitivi dei pazienti con MS.
798 2006