Indice - Giornale Italiano di Medicina del Lavoro ed Ergonomia ...

G Ital Med Lav Erg 2006; 28:3, Suppl 91
www.gimle.fsm.it
PHOSPHATIDYLSERINE METABOLISM DURING CHROMIUM
(VI)-INDUCED APOPTOSIS IN HUMAN LYMPHOBLASTIC
CELLS
Key words: chromium VI, phosphatidylserine, apoptosis.
ABSTRACT. Hexavalent Chromium (Cr VI) compounds, which are
recognized human carcinogens, induce apoptosis with mechanisms that
have not been completely clarified.
Phosphatidylserine (PS) exposure toward the external surface of the
membrane is a well-established event of programmed cell death; in
addition, apoptotic stimuli modify PS metabolism in several cell types.
Cr (VI) induces apoptosis in a human lymphoblastic cell line (MOLT-4).
In this study we evaluated whether PS metabolism is modified during
Cr (VI)-induced apoptosis in MOLT-4 cells, measuring the
incorporation of [ 3 H]serine into PS and the conversion of newly
synthesised PS into metabolically related glycerophospholipids. The
apoptosis level and PS exposure were measured in parallel samples
using propidium iodide solution and annexin V binding, respectively.
Cell treatment with 200 µM Cr (VI) decreased the incorporation of
[ 3 H]serine into PS before DNA fragmentation and PS exposure. Newly
synthesized PS was decarboxylated to phosphatidylethanolamine (PE);
radioactive PE/ PS ratio was decreased 6 and 12 hours after Cr (VI)
treatment causing apoptosis.
In conclusion, this study demonstrates that Cr (VI) treatment increases
PS exposure and modifies PS metabolism in MOLT-4 cells. These events
appear correlated with Cr (VI)-induced apoptosis. These findings could
be relevant in elucidating the mechanism underlying Cr (VI)-induced
apoptosis in MOLT-4 cells.
INTRODUZIONE
Il cromo è un metallo di transizione la cui evidenza di cancerogenicità
è per la IARC “inadeguata per cromo metallico e composti del cromo
trivalente per l’uomo”, “sufficiente per i composti del cromo esavalente”quindi
classificati nel gruppo 1 (1). L’impiego del Cromo (Cr) è diffuso
in molti processi industriali. Numerosi studi hanno dimostrato che a
livello cellulare il Cr innesca processi ossidativi (2, 3) che danneggiano il
DNA inducendo l’arresto del ciclo cellulare, l’apoptosi o la trasformazione
neoplastica. Il meccanismo citotossico alla base di tali meccanismi
non è tuttavia completamente chiarito.
È generalmente accettato che le cellule apoptotiche espongono sulla
superficie cellulare la fosfatidilserina (PS), normalmente presente sul lato
citosolico della membrana, e che questo evento determini il loro riconoscimento
ed eliminazione da parte dei macrofagi. Il meccanismo molecolare
alla base dell’esposizione della PS non è ancora definito e potrebbe,
almeno in parte, dipendere dal tipo cellulare. In alcune cellule, stimoli
apoptotici causano aumento della sintesi di PS (4, 5, 6), che potrebbe contribuire
alla sua esposizione. Il fenomeno non può però essere generalizzato,
in quanto macrofagi indotti all’apoptosi da infezione con streptococco
di gruppo B (GBS) espongono la PS pur avendo una diminuita sintesi
del fosfolipide (7).
Le variazioni nella sintesi di PS sopra menzionate potrebbero avere
un ruolo rilevante nell’indirizzare la cellula verso la morte programmata,
in quanto è nota la capacità del fosfolipide di modulare l’attività di numerose
proteine implicate nella trasduzione dei segnali.
Cellule linfocitarie umane (MOLT-4) sono indotte all’apoptosi in
modo dose e tempo-dipendente dall’esposizione al Cr VI (8). In questo
studio, abbiamo verificato se il metabolismo della PS fosse modificato,
durante l’apoptosi indotta dal Cr VI, in cellule MOLT-4, misurando l’incorporazione
della [ 3 H]serina nella PS e la conversione della PS di nuova
sintesi nei fosfolipidi ad essa correlati. Esperimenti paralleli sono stati
condotti per verificare se anche in tale modello di apoptosi venisse esposta
la PS.
MATERIALI E METODI
Cellule MOLT-4 (ATCC N. CRL-1582) (5x10 5 cellule/pozzetto)
erano poste, in doppio, in 2 ml RPMI-1640 supplementato con 20% FBS,
glutamina (2 mM) e gentamicina (80 mg/l) (medium) e mantenute in atmosfera
al 5% di CO 2 a 37°C.
L’effetto del Cr VI sul metabolismo della PS è stato studiato incubando
le cellule per diversi tempi (1, 2, 4, 6, 12 ore) nel medium contenente
30 µCi L-[ 3 H(G)]serina (S.R. 25.8 mCi/mmol,; Perkin Elmer, Boston,
USA), in presenza o assenza di Cr VI, utilizzato a 2 concentrazioni
(9 e 200 µM). Al termine dell’incubazione, le cellule erano centrifugate a
200xg per 10 minuti ed era valutata la radioattività nella PS. L’estrazione
lipidica, la separazione dei fosfolipidi mediante cromatografia bidimensionale
su strato sottile e la misura della radioattività nella PS, nella fosfatidiletanolammina
(PE) e nella fosfatidilcolina (PC) erano condotte
come precedentemente riportato (7).
In cellule incubate nelle stesse condizioni ma in assenza di serina radioattiva
veniva valutata l’apoptosi, mediante metodo del propidio ioduro
(8), e l’esposizione della PS utilizzando il test per l’annessina V (Vybrant
Apoptosis Assay, Invitrogen).
RISULTATI
Il trattamento con 200 µM Cr VI causava una diminuzione della sintesi
di PS (Fig. 1A) che precedeva nel tempo l’esposizione di PS (Fig.
1B) e l’apoptosi. Quest’ultima era infatti trascurabile entro le 4 ore di trattamento
ed evidente (45%) dopo 6 h di trattamento. Tempi lunghi di incubazione
con Cr VI (12 ore) determinavano la necrosi cellulare.
Il trattamento con 9 µM Cr VI modificava leggermente i parametri
sopra riportati (a 6 e 12 ore di incubazione).
L’esposizione per 6 e 12 ore con 200 µM di Cr VI, riduceva la capacità
delle cellule di decarbossilare la PS neosintetizzata, valutata dal rapporto
tra la radioattività nella PE e quella nella PS, non modificata invece
da trattamenti per tempi o concentrazioni inferiori (9 µM).
Figura 1. Effetto del trattamento con Cr VI (200 µM) sull’incorporazione
di [ 3 H]serina nella PS (A) e sull’esposizione della PS (B) in cellule
MOLT-4. In A, cellule MOLT-4 erano incubate con [ 3 H]serina in
presenza o in assenza di Cr VI. La radioattività nella PS è espressa
come dpmx10 3 /5x10 5 cellule. In B è riportata l’esposizione della PS
in cellule incubate nelle stesse condizioni ma in assenza di [ 3 H]serina