Validazione di un algoritmo per la valutazione dei rischi da ...

More documents

Recommendations

Info

398 G Ital Med Lav Erg 2007; 29:3 www.gimle.fsm.it luppo della fibrosi polmonare che nella patogenesi del tumore del polmone. È noto che le specie ossidanti sono prodotte in risposta alla struttura della silice cristallina e in seguito alla fagocitosi delle particelle di silice da parte dei macrofagi. Come noto, i ROS possono indurre una vasta gamma di risposte cellulari, quali proliferazione, differenziamento, apoptosi, differenti in base al tipo di cellula ed al contesto cellulare in cui essa si trova, ed in funzione della quantità di ROS prodotti e della loro permanenza nella cellula (6,9). In generale, bassi livelli di ROS promuovono la sopravvivenza cellulare e la proliferazione, mentre alti livelli possono causare danni cellulari, quali perossidazione lipidica delle membrane, ed effetti genotossici che conducono alla morte della cellula per apoptosi. Numerose sono le vie di segnalazione coinvolte nella risposta cellulare indotta dai ROS, i quali possono attivare anche fattori di trascrizione che regolano la produzione di chemochine, citochine infiammatorie e fattori fibrogenici nei macrofagi. Importanti fattori trascrizionali, la cui attività è regolata dai ROS, sono p53, il cui ruolo nella protezione da danni genomici e nella regolazione dell’apoptosi sotto differenti condizioni di stress cellulare è da tempo ben nota (7), NF-kB (nuclear factor kB) e AP-1 (activator protein 1), essenziali per la crescita cellulare e il differenziamento (11). La quantità intracellulare dei ROS è generalmente controllata da sostanze antiossidanti ubiquitariamente espresse, come il glutatione. Quando la produzione dei ROS eccede la capacità antiossidante di tali sostanze, la cellula va incontro a “stress ossidativo” con gravi conseguenze per la sua vitalità. Lo stress ossidativo è anche responsabile della perossidazione lipidica delle membrane biologiche, responsabile, a sua volta, della produzione e dell’accumulo di alfa-chetoaldeidi (1), tra cui il metilgliossale (MG), fisiologico inibitore della proliferazione cellulare e forte induttore di apoptosi (3). Il sistema delle gliossalasi provvede alla rimozione del MG e costituisce la sua principale via di inattivazione. Tale sistema consiste di due enzimi, la gliossalasi I (GI) e la gliossalasi II (GII) che convertono il MG in D-lattato attraverso la formazione dell’intermedio lattoilglutatione (LSG), utilizzando il glutatione ridotto (GSH) come cofattore (13). In particolare, la GI catalizza la conversione dell’addotto formato tra MG e GSH in LSG, che, a sua volta, viene idrolizzato dalla GII in D-lattato con rigenerazione di GSH. È, infatti, noto il coinvolgimento del sistema delle gliossalasi nella difesa cellulare da stress ossidativo (2,4). In considerazione del ruolo delle gliossalasi nei processi di detossificazione da prodotti dello stress ossidativo e dell’attività nota della silice cristallina come forte induttore dello stesso, abbiamo studiato la modulazione dell’espressione genica del sistema delle gliossalasi in cellule epiteliali bronchiali (BEAS-2B) trattate con silice cristallina Min-U-Sil 5. MATERIALI E METODI Cellule epiteliali bronchiali umane BEAS-2B (ATCC N. CRL-9609) sono state coltivate in DMEM-F12 supplementato con 10% FBS, glutamina 2mM, Hepes e gentamicina 80mg/L e mantenute in atmosfera al 5% CO2 a 37°C. L’effetto della silice cristallina Min-U-Sil 5 sull’espressione genica del sistema delle gliossalasi, è stato studiato incubando le cellule a subconfluenza in fiasche da 75cm 2 con 50 µg/cm 2 di silice cristallina (8), per 2, 6, 12 e 24 ore. Min-U-Sil 5 è una polvere di silice cristallina contenente il 99% di alfa-quarzo con il 95% di particelle più piccole di 5 µm, ad elevato grado di purezza. La polvere è stata pesata, autoclavata a secco, sospesa in DMEM-F12 e opportunamente diluita per ottenere una concentrazione finale di 50 µg/cm 2 (16). Al termine del trattamento, il terreno è stato rimosso e le cellule adese sono state sottoposte a lavaggi in tampone PBS. Il successivo isolamento dell’RNA cellulare totale è stato eseguito mediante metodica TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) (10). L’RNA totale è stato quindi utilizzato per la sintesi di cDNA mediante RevertAid TM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Hanover, MD) e random primers System (Invitrogen, Carlsbad, CA). L’espressione di GI e GII è stata valutata mediante Real-Time TaqMan PCR in LightCycler (MX3005P System, Stratagene, La Jolla, CA). La Tabella I riporta le sequenze di primer e sonde TaqMan utilizzate per la determinazione dei livelli di trascritto delle gliossalasi e della β-actina (il gene housekeeping utilizzato per la normalizzazione) e le condizioni sperimentali della metodica PCR. Le reazioni di amplificazione sono state eseguite in quadruplicato e l’espressione genica di GI e GII è stata riportata come variazione rispetto a controlli rappresentati da cellule mantenute nelle stesse condizioni sperimentali ma non esposte a silice cristallina. Per l’analisi comparativa dell’espressione genica, i dati sono stati ottenuti usando il metodo ∆∆C t (12). Inoltre, sugli stessi campioni sono stati valutati i livelli intracellulari di MG mediante HPLC secondo la metodica di Chaplen et al. parzialmente modificata (5). La significatività statistica delle differenze tra controlli e trattati è stata analizzata mediante analisi della varianza (ANOVA), con P < 0,05. RISULTATI L’esposizione a silice cristallina Min-U-Sil 5 induce una diminuzione significativa dell’espressione genica di GI in cellule bronchiali epiteliali umane BEAS 2B nelle prime ore di esposizione (2 e 6 ore). Un aumento dei livelli di trascritto di GI e GII si osserva invece dopo 12 ore di trattamento. L’esposizione a 24 ore evidenzia un ritorno dei livelli di espressione di GI alle condizioni pre-trattamento. L’espressione della GII dopo un iniziale decremento a 2 ore di trattamento, subisce un aumento significativo evidente per tutto il periodo di esposizione (Grafico 1A). I livelli intracellulari di MG mostrano un andamento fluttuante alle diverse ore di esposizione. In particolare, si osserva un aumento significativo dopo le 6 ore, un netto decremento dopo le 12 ore, mentre a 24 ore si rileva un ripristino dei livelli di MG che non differiscono significativamente da quelli osservati a 6 ore (Grafico 1B). DISCUSSIONE I risultati ottenuti evidenziano che l’esposizione a silice cristallina (Min-U-Sil 5) induce stress ossidativo in cellule bronchiali umane (BEAS- 2B) mediante modulazione dell’espressione del sistema delle gliossalasi e parallelo accumulo di MG. L’esposizione suddetta induce in generale una marcata produzione di MG, accompagnata, da un lato, da ridotti livelli di espressione genica di GI e, dall’altro, da aumentati livelli di GII. La ridotta espressione genica di GI è probabilmente il risultato di una diminuita disponibilità di GSH, cofattore essenziale per il funzionamento di tale enzi- Tabella I. Sequenze dei primer e sonde TaqMan utilizzate nell’analisi in PCR e condizioni sperimentali *Marcato con fluorocromo FAM; **Marcato con fluorocromo HEX; *** Marcato con fluorocromo TexasRed Figura 1. cellule bronchiali epiteliali umane BEAS 2B trattate con 50 µg/cm 2 di silice cristallina Min- U-Sil 5 a 2, 6, 12 e 24 ore. (A) variazione dell’espressione genica di gliossalasi I (GI) e gliossalasi II (GII); (B) variazione delle concentrazioni di metilgliossale (MG). * p< 0,05 rispetto al controllo
G Ital Med Lav Erg 2007; 29:3 399 www.gimle.fsm.it ma, in quanto contemporaneamente impiegato anche da altri sistemi cellulari antiossidanti glutatione-dipendenti. Inoltre, fattori di trascrizione come AP-1 o NF-kB (7), attivati dai prodotti dello stress ossidativo, potrebbero direttamente inibire l’espressione di GI. L’aumento dei livelli di trascritto di GII, invece, è probabilmente dovuto alla necessità per la cellula di produrre un fattore proteico in grado di evitare o ridurre il danno genomico conseguente allo stress ossidativo e che regoli l’apoptosi, con funzioni simili a quelle dell’oncoproteina p53. Tale ipotesi trova conferma in quanto, recentemente, Chen et al. hanno dimostrato che GII possiede un attività p53-simile (14, 15). Infine, gli incrementi osservati nei livelli di MG, substrato delle gliossalasi, sono probabilmente da attribuire ad una ridotta funzionalità del sistema stesso e ad un’eccessiva produzione di MG, entrambe indotte dall’elevato stress ossidativo determinato dalla silice cristallina. L’andamento dell’espressione delle gliossalasi, così come le variazioni nei livelli intracellulari di MG a seguito della esposizione a silice, suggeriscono un adattamento cellulare allo stress ossidativo indotto dal trattamento medesimo. Tali osservazioni confermano l’ipotesi che l’esposizione di cellule bronchiali epiteliali a silice cristallina Min-U-Sil 5 induce alti livelli di stress ossidativo responsabile della modulazione dell’espressione genica di GI e GII. Pertanto, il livello di espressione di tali geni, potrebbe essere considerato indicatore di danno cellulare da esposizione a silice. BIBLIOGRAFIA 1) Abordo E.A., Minhas H.S., Thornalley P.J. Accumulation of alphaoxoaldehydes during oxidative stress: a role in cytotoxicity. Biochem Pharmacol; 58:641-48, 1999. 2) Amicarelli F., Colafarina S., Cattani F., Cimini A., Di Ilio C., Ceru M.P., Miranda M. Scavenging system efficiency is crucial for cell resistance to Ros-mediated methylglyoxal injury. Free Rad Biol Med; 35(8): 856-871, 2003. 3) Ayoub F.M., Allen R.E., Thornalley P.J. Inhibition of proliferation of human leukaemia 60 cells by methylglyoxal in vitro. Leuk Res; 17(5):397-401, 1993. 4) Bonfigli A., Colafarina S., Falone S., Di Giulio C., Di Ilio C., Amicarelli F. High levels of antioxidant enzymatic defence assure good protection against hypoxic stress in spontaneously diabetic rats. Int J Biochem Cell Biol; 38:2196-2208, 2006. 5) Chaplen F.W.R., Fahl W.E., Cameron D.C. Method for determination of free intracellular and extracellular methylglyoxal in animal cells grown in culture. Anal Biochem; 238:171-178, 1996. 6) Finkel T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol; 15:247-54, 2003. 7) Gomez-Lazaro M., Fernandez-Gomez F.J., Jordan J. P53: twenty five years understanding the mechanism of genome protection. J Physiol Biochem; 60 (4):287-307, 2004. 8) Lin W., Huang Y., Zhou X.D., Ma Y. In vitro toxicity of silica nanoparticles in human lung cancer cells. Toxicol Appl Pharmacol; 217(3):252-9, 2006. 9) Martingale J.L., Holbrook N.J. Cellular response to oxidative stress: signaling for suicide and survival. J Cell Physiol; 92:1-15, 2002. 10) Rulli A., Antognelli C., Prezzi E., Baldacchini F., Piva F., Giovannini E., Talesa V. A possible regulatory role of 17b-estradiol and tamoxifen on glyoxalase I and glyoxalase II genes expression in MCF7 and BT20 human breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat; 96(2):187-96, 2006. 11) Sun Y., Oberley L.W. Redox regulation of transcriptional activators. Free Radic Biol Med; 21:335-48,1996. 12) The Perkin-Elmer Corporation.User Bulletin No 2. ABI Prism 7700 Sequence Detection System. 1997. P/N 4303859 Rev A Stock No 777802-001. 13) Thornalley P.J. The glyoxalase system: new developments towards functional characterization of a metabolic pathway fundamental to biological life. Biochem J; 269(1):1-11, 1990. 14) Yan W., Chen X. GPX2, a direct target of p63, inhibits oxidative stress-induced apoptosis in a p53-dependent manner. J Biol Chem; 281(12):7856-7862, 2006. 15) Yang X., Chen X. Glyoxalase II, a detoxifying enzyme of glycolysis byproduct methylglyoxal and a target of p63 and p73, is a pro-survival factor of the p53 family. J Biol Chem; 281: 36:26702-26713, 2006. 16) Zhong B., Zhong W., Ong T. Detection of mineral-dust-induced DNA damage in two mammalian cell lines using the alkalin single cell gel/comet assay. Mut Res; 393:181-187, 1997. SESSIONE RISCHIO BIOLOGICO COM-01 RUOLO DEI TEST DI SCREENING NELLA DIAGNOSI INDIRETTA DI TUBERCOLOSI NEGLI OPERATORI SANITARI: LA MANTOUX E IL NUOVO TEST ELISA SU SANGUE M.R. Vinci1 , C. Russo2 , S. Zaffina3 , C. di Felice3 , D. Menichella2 , A. Pietroiusti4 1 Istituto di Medicina del Lavoro - Università Cattolica del Sacro Cuore, 2 UO Microbiologia Ospedale “Bambino Gesù” Roma, 3 Servizio di Protezione e Prevenzione Ospedale “Bambino Gesù” Roma, 4 Istituto di Medicina del Lavoro - Università degli studi Tor Vergata. Corrispondenza: M.R. Vinci mr.vinci@libero.it RIASSUNTO. L’infezione tubercolare ha assunto, negli ultimi anni, aspetti di vera e propria emergenza. Il fallimento del tentativo di eradicazione della tubercolosi (O.M.S. Millennium Global Plan) ha portato alla revisione della strategia di controllo mondiale finalizzato al contenimento della malattia tubercolare (The Global Plan to Stop TB 2006-2015). Di fronte a questo scenario si comprende ancora di più l’importanza di mettere a punto metodi sempre più sensibili e specifici nell’individuare, il più precocemente possibile, i casi infetti. A tutt’oggi, il test di screening d’elezione per la valutazione dell’infezione tubercolare è il test dell’intradermoreazione (IDR) alla PPD secondo Mantoux. Recentemente sono stati introdotti nuovi test per lo screening della popolazione che si basano sulla valutazione dell’immunità cellulo-mediata verso antigeni specifici; questi test (QFT-G) sono privi dei limiti propri della IDR secondo Mantoux, più adatti all’utilizzo come test seriali e quindi sicuramente più utili, a nostro avviso, nei programmi di screening dell’infezione tubercolare in paese a bassa incidenza, come l’Italia. Parole chiave: Infezione tubercolare, Test di screening tubercolari, Test QuantiFERON - G ROLE OF SCREENING TESTS FOR INDIRECT DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS IN HEALTH CARE WORKERS: MANTOUX AND THE NEW TESTS ON BLOOD ELISA ABSTRACT. The Tuberculosis infection in recent years has become always more a threat. The failure in the attempt to stop it (O.M.S. Millennium Global Plan) brought to the revision of the world control strategy to at least contain this disease (The Global Plan to Stop TB 2006-2015). Due to these severe facts it is even more important now to elaborate more sensitive and specific methods to find out, as fast as possible, the infected cases. As of today, the main TB infection screening test is the Skin PPD test (Mantoux). Recently new tests for the population screening are in use; these tests are based on the evaluation of immunity cell-mediated. They (QFT-G) do not have the typical limits of the Skin Test and they are more suitable as serial tests and therefore more useful, according to us, in the screening programs of the TB infection in low prevalence countries, like Italy. Key words: Tubercular infection, Tubercular screening test, QuantiFERON - G test INTRODUZIONE E OBIETTIVI DELLO STUDIO L’infezione tubercolare ha assunto, negli ultimi anni, aspetti di vera e propria emergenza. Il fallimento del tentativo di eradicazione della tubercolosi (OMS Millenium Global plan) (1) ha portato alla revisione della strategia di controllo mondiale finalizzato al contenimento della malattia.tubercolare (The Global Plan to Stop TB 2006-2015). Di fronte a questo scenario si comprende ancora di più l’importanza di mettere a punto metodi sempre più sensibili e specifici nell’individuare, il più precocemente possibile, i casi infetti. A tutt’oggi, il test di screening d’elezione per la valutazione dell’infezione tubercolare è il test dell’intradermoreazione (IDR) alla PPD secondo Mantoux. Recentemente sono stati introdotti nuovi test per lo
Page 1 and 2: G Ital Med Lav Erg 2007; 29:3 367 w
Page 31: G Ital Med Lav Erg 2007; 29:3 397 w
Page 83 and 84:
G Ital Med Lav Erg 2007; 29:3 449 w
Page 85 and 86:
Page 87 and 88:
Page 89 and 90:
Page 91 and 92:
Page 93 and 94:
Page 95 and 96:
Page 97 and 98:
Page 99 and 100:
Page 101:
show all

Validazione di un algoritmo per la valutazione dei rischi da ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?