Validazione di un algoritmo per la valutazione dei rischi da ...

398 G Ital Med Lav Erg 2007; 29:3
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luppo della fibrosi polmonare che nella patogenesi del tumore del polmone.
È noto che le specie ossidanti sono prodotte in risposta alla struttura della silice
cristallina e in seguito alla fagocitosi delle particelle di silice da parte dei
macrofagi. Come noto, i ROS possono indurre una vasta gamma di risposte
cellulari, quali proliferazione, differenziamento, apoptosi, differenti in base al
tipo di cellula ed al contesto cellulare in cui essa si trova, ed in funzione della
quantità di ROS prodotti e della loro permanenza nella cellula (6,9). In generale,
bassi livelli di ROS promuovono la sopravvivenza cellulare e la proliferazione,
mentre alti livelli possono causare danni cellulari, quali perossidazione
lipidica delle membrane, ed effetti genotossici che conducono alla morte
della cellula per apoptosi. Numerose sono le vie di segnalazione coinvolte
nella risposta cellulare indotta dai ROS, i quali possono attivare anche fattori
di trascrizione che regolano la produzione di chemochine, citochine infiammatorie
e fattori fibrogenici nei macrofagi. Importanti fattori trascrizionali, la
cui attività è regolata dai ROS, sono p53, il cui ruolo nella protezione da danni
genomici e nella regolazione dell’apoptosi sotto differenti condizioni di
stress cellulare è da tempo ben nota (7), NF-kB (nuclear factor kB) e AP-1
(activator protein 1), essenziali per la crescita cellulare e il differenziamento
(11). La quantità intracellulare dei ROS è generalmente controllata da sostanze
antiossidanti ubiquitariamente espresse, come il glutatione. Quando la produzione
dei ROS eccede la capacità antiossidante di tali sostanze, la cellula va
incontro a “stress ossidativo” con gravi conseguenze per la sua vitalità. Lo
stress ossidativo è anche responsabile della perossidazione lipidica delle
membrane biologiche, responsabile, a sua volta, della produzione e dell’accumulo
di alfa-chetoaldeidi (1), tra cui il metilgliossale (MG), fisiologico inibitore
della proliferazione cellulare e forte induttore di apoptosi (3). Il sistema
delle gliossalasi provvede alla rimozione del MG e costituisce la sua principale
via di inattivazione. Tale sistema consiste di due enzimi, la gliossalasi I
(GI) e la gliossalasi II (GII) che convertono il MG in D-lattato attraverso la
formazione dell’intermedio lattoilglutatione (LSG), utilizzando il glutatione
ridotto (GSH) come cofattore (13). In particolare, la GI catalizza la conversione
dell’addotto formato tra MG e GSH in LSG, che, a sua volta, viene idrolizzato
dalla GII in D-lattato con rigenerazione di GSH. È, infatti, noto il coinvolgimento
del sistema delle gliossalasi nella difesa cellulare da stress ossidativo
(2,4). In considerazione del ruolo delle gliossalasi nei processi di detossificazione
da prodotti dello stress ossidativo e dell’attività nota della silice
cristallina come forte induttore dello stesso, abbiamo studiato la modulazione
dell’espressione genica del sistema delle gliossalasi in cellule epiteliali
bronchiali (BEAS-2B) trattate con silice cristallina Min-U-Sil 5.
MATERIALI E METODI
Cellule epiteliali bronchiali umane
BEAS-2B (ATCC N. CRL-9609) sono
state coltivate in DMEM-F12 supplementato
con 10% FBS, glutamina 2mM, Hepes
e gentamicina 80mg/L e mantenute in
atmosfera al 5% CO2 a 37°C. L’effetto
della silice cristallina Min-U-Sil 5 sull’espressione
genica del sistema delle gliossalasi,
è stato studiato incubando le cellule
a subconfluenza in fiasche da 75cm 2
con 50 µg/cm 2 di silice cristallina (8), per
2, 6, 12 e 24 ore. Min-U-Sil 5 è una polvere
di silice cristallina contenente il 99%
di alfa-quarzo con il 95% di particelle più
piccole di 5 µm, ad elevato grado di purezza.
La polvere è stata pesata, autoclavata
a secco, sospesa in DMEM-F12 e opportunamente
diluita per ottenere una concentrazione
finale di 50 µg/cm 2 (16). Al
termine del trattamento, il terreno è stato
rimosso e le cellule adese sono state sottoposte
a lavaggi in tampone PBS. Il successivo
isolamento dell’RNA cellulare totale
è stato eseguito mediante metodica
TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) (10).
L’RNA totale è stato quindi utilizzato per
la sintesi di cDNA mediante RevertAid TM
H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit
(Fermentas, Hanover, MD) e random primers
System (Invitrogen, Carlsbad, CA).
L’espressione di GI e GII è stata valutata
mediante Real-Time TaqMan PCR in LightCycler (MX3005P System,
Stratagene, La Jolla, CA). La Tabella I riporta le sequenze di primer e sonde
TaqMan utilizzate per la determinazione dei livelli di trascritto delle
gliossalasi e della β-actina (il gene housekeeping utilizzato per la normalizzazione)
e le condizioni sperimentali della metodica PCR.
Le reazioni di amplificazione sono state eseguite in quadruplicato e
l’espressione genica di GI e GII è stata riportata come variazione rispetto a
controlli rappresentati da cellule mantenute nelle stesse condizioni sperimentali
ma non esposte a silice cristallina. Per l’analisi comparativa dell’espressione
genica, i dati sono stati ottenuti usando il metodo ∆∆C t (12).
Inoltre, sugli stessi campioni sono stati valutati i livelli intracellulari di MG
mediante HPLC secondo la metodica di Chaplen et al. parzialmente modificata
(5). La significatività statistica delle differenze tra controlli e trattati
è stata analizzata mediante analisi della varianza (ANOVA), con P < 0,05.
RISULTATI
L’esposizione a silice cristallina Min-U-Sil 5 induce una diminuzione
significativa dell’espressione genica di GI in cellule bronchiali epiteliali
umane BEAS 2B nelle prime ore di esposizione (2 e 6 ore). Un aumento
dei livelli di trascritto di GI e GII si osserva invece dopo 12 ore di
trattamento. L’esposizione a 24 ore evidenzia un ritorno dei livelli di
espressione di GI alle condizioni pre-trattamento. L’espressione della GII
dopo un iniziale decremento a 2 ore di trattamento, subisce un aumento
significativo evidente per tutto il periodo di esposizione (Grafico 1A). I
livelli intracellulari di MG mostrano un andamento fluttuante alle diverse
ore di esposizione. In particolare, si osserva un aumento significativo
dopo le 6 ore, un netto decremento dopo le 12 ore, mentre a 24 ore si rileva
un ripristino dei livelli di MG che non differiscono significativamente
da quelli osservati a 6 ore (Grafico 1B).
DISCUSSIONE
I risultati ottenuti evidenziano che l’esposizione a silice cristallina
(Min-U-Sil 5) induce stress ossidativo in cellule bronchiali umane (BEAS-
2B) mediante modulazione dell’espressione del sistema delle gliossalasi e
parallelo accumulo di MG. L’esposizione suddetta induce in generale una
marcata produzione di MG, accompagnata, da un lato, da ridotti livelli di
espressione genica di GI e, dall’altro, da aumentati livelli di GII. La ridotta
espressione genica di GI è probabilmente il risultato di una diminuita disponibilità
di GSH, cofattore essenziale per il funzionamento di tale enzi-
Tabella I. Sequenze dei primer e sonde TaqMan utilizzate nell’analisi
in PCR e condizioni sperimentali
*Marcato con fluorocromo FAM; **Marcato con fluorocromo HEX; *** Marcato con fluorocromo TexasRed
Figura 1. cellule bronchiali epiteliali umane BEAS 2B trattate con 50 µg/cm 2 di silice cristallina Min-
U-Sil 5 a 2, 6, 12 e 24 ore. (A) variazione dell’espressione genica di gliossalasi I (GI) e gliossalasi
II (GII); (B) variazione delle concentrazioni di metilgliossale (MG). * p< 0,05 rispetto al controllo