Validazione di un algoritmo per la valutazione dei rischi da ...

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466 G Ital Med Lav Erg 2007; 29:3 www.gimle.fsm.it gli effetti cardiovascolari di tipo ischemico e aritmico, sia perché i più rilevanti dal punto di vista della mortalità correlata alle particelle ultrafini (2), sia perché tale effetto si esplica già nelle ore successive all’esposizione, come confermato anche da recentissimi dati sperimentali sull’uomo (3). È da ritenere pertanto che l’esposizione a particelle ultrafini determini precocemente una destabilizzazione della placca aterosclerotica in soggetti a rischio. Il meccanismo etiopatogenetico più plausibile per spiegare questo fatto dovrebbe consistere in un’alterazione del tono coronarico, mediata a sua volta da un’alterata regolazione del controllo autonomico del sistema cardiovascolare. Sebbene siano gia disponibili alcuni dati che suggeriscono una possibile relazione tra esposizione prolungata a SWCNT e accelerata aterosclerosi (4), non vi sono dati disponibili sulla interferenza dell’inalazione di SWCNT sulla regolazione autonomica cardiovascolare. Scopo del presente studio è pertanto quello di verificare in primo luogo la possibilità di utilizzare per la valutazione di tale possibile interferenza un modello sperimentale messo a punto nel nostro laboratorio e in secondo luogo di valutare i primi dati preliminari forniti da tale modello in ratti esposti e non esposti a SWCNT. MATERIALE E METODI Disegno dello studio Il protocollo prevede 3 somministrazioni (ad intervalli di 2 settimane) di SWCNT o di soluzione fisiologica tamponata per via intratracheale a ratti di laboratorio. Ciascuna somministrazione è preceduta e seguita, entro 24 ore dall’esposizione, da una valutazione di almeno 30 minuti della regolazione del sistema autonomico cardiovascolare. A 2 settimane di distanza dall’ultima somministrazione si esegue una nuova registrazione, a cui segue l’induzione sperimentale di infarto del miocardio. A una settimana dall’induzione dell’infarto si replica lo stesso protocollo utilizzato nella prima fase dello studio. Caratterizzazione dei nanotubi SWCNT (CarboLex AP-grade, 50- 70%, Aldrich, Steinheim-Germany) prodotti con la metodica dell’arco elettrico sono stati purificati con HNO 3 a temperatura ambiente e caratterizzati con spettroscopia Raman e microscopia elettronica a scansione. Il diametro dei nanotubi utilizzati nel presente studio è stato di 1.2-1.6 nm, la lunghezza di 2-5 µm e la superficie 300 m 2 /g. Protocollo sperimentale Lo studio è stato eseguito su ratti Wistar Kyoto di entrambi i sessi del peso medio di 400 gr trattati secondo i criteri dell’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Care International ed è stato approvato dalla stazione per la Tecnologia Animale dell’Università Tor Vergata e dal Ministero della Salute. In tutti i ratti è stato impiantato in aorta addominale un trasmettitore telemetrico secondo la seguente procedura: previa anestesia con Ketamina (Ketavet 50 ® 60 mg/kg i.p.) e Medetomidina (Domitor ® 0.3 mg/Kg i.p.) si è proceduto ad incisione lungo la linea mediana addominale, esponendo quindi l’aorta addominale; l’apice del catetere arterioso del trasmettitore telemetrico (TA11PA-C40, Data Sciences, St. Paul, MN) è stato quindi inserito in aorta addominale immediatamente al di sopra della biforcazione delle arterie iliache e ancorato in situ con una colla tissutale (Vetbond, 3M ® ). Il corpo del trasmettitore è stato ancorato alla parete addominale con punti di sutura lungo la linea di incisione, che è stata chiusa a questo punto della procedura. Successivamente, i ratti sono stati trattati con antibiotici (ceftriaxone) per 7 giorni, fino al completo recupero funzionale. Il sistema usato per la registrazione della pressione arteriosa consiste essenzialmente di 3 elementi: un trasmettitore per il monitoraggio della pressione arteriosa (TA11PAC40); un ricevitore(RPC-1); e un adattatore (R11CPA) con un monitor di pressione ambientale (APR-1), che produce segnali di uscita analoghi a quelli della pressione arteriosa. Il segnale di pressione arteriosa rilevato in telemetria viene trasformato in segnale digitale usando una I/O PC card (National Instrument 6024E, Austin, TX) a una frequenza di 2000 Hz, trasmesso allo schermo di un computer e analizzato mediante un algoritmo basato su metodica di estrazione per rilevare e misurare le caratteristiche dei cicli di pressione arteriosa. Tale algoritmo è stato sviluppato nel nostro laboratorio sulla base di un software Lab View Platform. È stato misurato l’intervallo dei picchi pressori, che è stato a sua volta utilizzato per calcolare la frequenza cardiaca. Nei giorni di esperimento, gli animali venivano lasciati per almeno 30 minuti nel laboratorio per familiarizzare con l’ambiente. A questo punto venivano assegnati in mediante randomizzazione al gruppo SWCNT o al gruppo controllo. Tutte le registrazioni si sono svolte a ratto sveglio e libero di muoversi nella gabbia secondo il pattern usuale. Prima della procedura di instillazione, gli animali sono stati anestetizzati con il metodo già descritto e si è proceduto ad inserzione di cannula endotracheale, at- traverso la quale è stata somministrata una sospensione di 400 µl di SWCNT ad una concentrazione finale di 1mg/ml. Il giorno dell’induzione dell’infarto miocardico si provvede ad effettuare una registrazione base di 30 minuti della Pressione Arteriosa e della Frequenza Cardiaca, prima di qualsiasi intervento sul ratto. Dopo aver anestetizzato l’animale come prima descritto si procede all’intubazione tracheale con una piccola cannula e l’instaurazione della ventilazione artificiale. La procedura chirurgica vera e propria invece inizia con una toracotomia sinistra al livello del terzo spazio intercostale per esporre il cuore e, con l’ausilio del microscopio operatore, prosegue con l’apertura del pericardio e l’esposizione della coronaria sinistra. Quindi si provvede alla cauterizzazione dell’arteria coronaria discendente anteriore ad 1 mm circa dalla sua origine. Questa procedura produce un’area cianotica e lievemente rigonfia di miocardio ischemico (chiaramente demarcata da quello sano circostante) nel territorio di irrorazione della coronaria sinistra, distalmente all’occlusione. Dopo la cauterizzazione della coronaria il cuore viene riposizionato nel torace, il sottocute e la cute vengono suturati e l’aria nel torace rimossa con una siringa. Analisi delle sequenze i valori pressori battito per battito e l’intervallo R-R all’elettrocardiogramma, sono stati analizzati al computer secondo le modalità descritte, al fine di identificare sequenze spontanee di 3 o più battiti consecutivi in cui la pressione e l’intervallo R-R del quinto battito successivo (lag 5) si modificavano nello stesso senso (cioè ipertensione e bradicardia, sequenze baro-riflesse) o in modo opposto (cioè ipertensione e tachicardia, sequenze non baroriflesse). A ciascuna sequenza individuale è stata applicata una regressione lineare, analogamente alla tecnica Oxford, che usa iniezioni in bolo di farmaci vasoattivi. Sono state prese in considerazione solo le sequenze in cui r 2 era > 0.85, ed è stato calcolato il numero delle sequenze baro-riflesse e non baroriflesse. Altri parametri calcolati sono stati: lo slope medio individuale delle sequenze non baroriflesse, e l’engagement time. RISULTATI 7 ratti sono stati inclusi nel protocollo di studio. Tutti e 7 (4 casi sottoposti ad instillazione e 3 controlli) hanno eseguito una sola seduta di in- Figura 1. Numero di sequenze baroriflesse nei casi e nei controlli Figura 2. Percentuale di “engagement” baroriflesso nei casi e nei controlli
G Ital Med Lav Erg 2007; 29:3 467 www.gimle.fsm.it Figura 3. Slope baroriflesso nei casi e nei controlli Figura 4. Sequenze non baro-riflesse nei casi e nei controlli stillazione e tre valutazioni della regolazione autonomica (1 pre e 2 post), 3 dei 7 ratti hanno concluso l’intero protocollo pre-infarto, sono stati sottoposti ad infarto sperimentale,ed hanno eseguito la prima instillazione post-infarto e la prima valutazione autonomica post infarto. I dati riportati nel presente studio si riferiscono ai 7 ratti che hanno eseguito una valutazione pre e due valutazioni post-instillazione. I dati principali sono mostrati nelle figure 1-4. Tutti i parametri esaminati hanno mostrato una minore variabilità nei ratti sottoposti a instillazione dei SWCNT rispetto ai controlli instillati con soluzione salina tamponata. In particolare, la differenza è risultata statisticamente significativa per lo slope baro-riflesso valutato a 24 ore dall’instillazione (p
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