Validazione di un algoritmo per la valutazione dei rischi da ...

466 G Ital Med Lav Erg 2007; 29:3
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gli effetti cardiovascolari di tipo ischemico e aritmico, sia perché i più rilevanti
dal punto di vista della mortalità correlata alle particelle ultrafini
(2), sia perché tale effetto si esplica già nelle ore successive all’esposizione,
come confermato anche da recentissimi dati sperimentali sull’uomo
(3). È da ritenere pertanto che l’esposizione a particelle ultrafini determini
precocemente una destabilizzazione della placca aterosclerotica
in soggetti a rischio. Il meccanismo etiopatogenetico più plausibile per
spiegare questo fatto dovrebbe consistere in un’alterazione del tono coronarico,
mediata a sua volta da un’alterata regolazione del controllo autonomico
del sistema cardiovascolare. Sebbene siano gia disponibili alcuni
dati che suggeriscono una possibile relazione tra esposizione prolungata
a SWCNT e accelerata aterosclerosi (4), non vi sono dati disponibili
sulla interferenza dell’inalazione di SWCNT sulla regolazione autonomica
cardiovascolare. Scopo del presente studio è pertanto quello di
verificare in primo luogo la possibilità di utilizzare per la valutazione di
tale possibile interferenza un modello sperimentale messo a punto nel nostro
laboratorio e in secondo luogo di valutare i primi dati preliminari forniti
da tale modello in ratti esposti e non esposti a SWCNT.
MATERIALE E METODI
Disegno dello studio Il protocollo prevede 3 somministrazioni (ad intervalli
di 2 settimane) di SWCNT o di soluzione fisiologica tamponata
per via intratracheale a ratti di laboratorio. Ciascuna somministrazione è
preceduta e seguita, entro 24 ore dall’esposizione, da una valutazione di
almeno 30 minuti della regolazione del sistema autonomico cardiovascolare.
A 2 settimane di distanza dall’ultima somministrazione si esegue una
nuova registrazione, a cui segue l’induzione sperimentale di infarto del
miocardio. A una settimana dall’induzione dell’infarto si replica lo stesso
protocollo utilizzato nella prima fase dello studio.
Caratterizzazione dei nanotubi SWCNT (CarboLex AP-grade, 50-
70%, Aldrich, Steinheim-Germany) prodotti con la metodica dell’arco
elettrico sono stati purificati con HNO 3 a temperatura ambiente e caratterizzati
con spettroscopia Raman e microscopia elettronica a scansione. Il
diametro dei nanotubi utilizzati nel presente studio è stato di 1.2-1.6 nm,
la lunghezza di 2-5 µm e la superficie 300 m 2 /g.
Protocollo sperimentale Lo studio è stato eseguito su ratti Wistar
Kyoto di entrambi i sessi del peso medio di 400 gr trattati secondo i criteri
dell’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Care
International ed è stato approvato dalla stazione per la Tecnologia Animale
dell’Università Tor Vergata e dal Ministero della Salute. In tutti i ratti
è stato impiantato in aorta addominale un trasmettitore telemetrico secondo
la seguente procedura: previa anestesia con Ketamina (Ketavet
50 ® 60 mg/kg i.p.) e Medetomidina (Domitor ® 0.3 mg/Kg i.p.) si è proceduto
ad incisione lungo la linea mediana addominale, esponendo quindi
l’aorta addominale; l’apice del catetere arterioso del trasmettitore telemetrico
(TA11PA-C40, Data Sciences, St. Paul, MN) è stato quindi inserito
in aorta addominale immediatamente al di sopra della biforcazione
delle arterie iliache e ancorato in situ con una colla tissutale (Vetbond,
3M ® ). Il corpo del trasmettitore è stato ancorato alla parete addominale
con punti di sutura lungo la linea di incisione, che è stata chiusa a questo
punto della procedura. Successivamente, i ratti sono stati trattati con antibiotici
(ceftriaxone) per 7 giorni, fino al completo recupero funzionale.
Il sistema usato per la registrazione della pressione arteriosa consiste essenzialmente
di 3 elementi: un trasmettitore per il monitoraggio della
pressione arteriosa (TA11PAC40); un ricevitore(RPC-1); e un adattatore
(R11CPA) con un monitor di pressione ambientale (APR-1), che produce
segnali di uscita analoghi a quelli della pressione arteriosa. Il segnale di
pressione arteriosa rilevato in telemetria viene trasformato in segnale digitale
usando una I/O PC card (National Instrument 6024E, Austin, TX)
a una frequenza di 2000 Hz, trasmesso allo schermo di un computer e
analizzato mediante un algoritmo basato su metodica di estrazione per rilevare
e misurare le caratteristiche dei cicli di pressione arteriosa. Tale algoritmo
è stato sviluppato nel nostro laboratorio sulla base di un software
Lab View Platform. È stato misurato l’intervallo dei picchi pressori,
che è stato a sua volta utilizzato per calcolare la frequenza cardiaca. Nei
giorni di esperimento, gli animali venivano lasciati per almeno 30 minuti
nel laboratorio per familiarizzare con l’ambiente. A questo punto venivano
assegnati in mediante randomizzazione al gruppo SWCNT o al
gruppo controllo. Tutte le registrazioni si sono svolte a ratto sveglio e libero
di muoversi nella gabbia secondo il pattern usuale. Prima della procedura
di instillazione, gli animali sono stati anestetizzati con il metodo
già descritto e si è proceduto ad inserzione di cannula endotracheale, at-
traverso la quale è stata somministrata una sospensione di 400 µl di
SWCNT ad una concentrazione finale di 1mg/ml. Il giorno dell’induzione
dell’infarto miocardico si provvede ad effettuare una registrazione base
di 30 minuti della Pressione Arteriosa e della Frequenza Cardiaca, prima
di qualsiasi intervento sul ratto. Dopo aver anestetizzato l’animale come
prima descritto si procede all’intubazione tracheale con una piccola
cannula e l’instaurazione della ventilazione artificiale. La procedura chirurgica
vera e propria invece inizia con una toracotomia sinistra al livello
del terzo spazio intercostale per esporre il cuore e, con l’ausilio del microscopio
operatore, prosegue con l’apertura del pericardio e l’esposizione
della coronaria sinistra. Quindi si provvede alla cauterizzazione dell’arteria
coronaria discendente anteriore ad 1 mm circa dalla sua origine.
Questa procedura produce un’area cianotica e lievemente rigonfia di miocardio
ischemico (chiaramente demarcata da quello sano circostante) nel
territorio di irrorazione della coronaria sinistra, distalmente all’occlusione.
Dopo la cauterizzazione della coronaria il cuore viene riposizionato
nel torace, il sottocute e la cute vengono suturati e l’aria nel torace rimossa
con una siringa.
Analisi delle sequenze i valori pressori battito per battito e l’intervallo
R-R all’elettrocardiogramma, sono stati analizzati al computer secondo
le modalità descritte, al fine di identificare sequenze spontanee di 3 o
più battiti consecutivi in cui la pressione e l’intervallo R-R del quinto battito
successivo (lag 5) si modificavano nello stesso senso (cioè ipertensione
e bradicardia, sequenze baro-riflesse) o in modo opposto (cioè ipertensione
e tachicardia, sequenze non baroriflesse). A ciascuna sequenza
individuale è stata applicata una regressione lineare, analogamente alla
tecnica Oxford, che usa iniezioni in bolo di farmaci vasoattivi. Sono state
prese in considerazione solo le sequenze in cui r 2 era > 0.85, ed è stato
calcolato il numero delle sequenze baro-riflesse e non baroriflesse. Altri
parametri calcolati sono stati: lo slope medio individuale delle sequenze
non baroriflesse, e l’engagement time.
RISULTATI
7 ratti sono stati inclusi nel protocollo di studio. Tutti e 7 (4 casi sottoposti
ad instillazione e 3 controlli) hanno eseguito una sola seduta di in-
Figura 1. Numero di sequenze baroriflesse nei casi e nei controlli
Figura 2. Percentuale di “engagement” baroriflesso nei casi e nei
controlli