Studi genomici nei microrganismi - Centri di Ricerca - Università ...
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<strong>Stu<strong>di</strong></strong> <strong>genomici</strong> <strong>nei</strong> microorganismi<br />
Edoardo Puglisi<br />
Istituto <strong>di</strong> Microbiologia<br />
Facoltà <strong>di</strong> Agraria<br />
<strong>Università</strong> Cattolica del Sacro Cuore<br />
Piacenza, Italy<br />
BioDNA Workshop “La genomica al servizio dell’agricoltura”<br />
Piacenza, <strong>Università</strong> Cattolica del Sacro Cuore, 25 Maggio 2012
SCHEMA<br />
• La genomica dei microorganismi e la sua importanza in agricoltura<br />
• Cenni a tecniche <strong>di</strong> sequenziamento, assemblaggio, annotazione<br />
• Applicazioni della genomica microbica/casi stu<strong>di</strong>o:<br />
• Bio<strong>di</strong>versità in Lactobacillus rhamnosus<br />
• Degradazione dei contaminanti e resistenza al freddo in<br />
Pseudomonas<br />
• Patogenicità e resistenza agli antibiotici: Enterococcus faecium<br />
ed Escherichi coli O157:H7<br />
• La genomica come anticamera delle scienze omiche<br />
• Trascrittomica (DNA-microarrays, RNASeq)<br />
• Metagenomica<br />
• Metatrascrittomica<br />
• Sviluppi futuri
• Superamento degli approcci riduzionistici<br />
• Quadro completo dei geni <strong>di</strong> un organismo<br />
• Bio<strong>di</strong>versità e “mining” genomico<br />
L’IMPORTANZA DELLA GENOMICA MICROBICA<br />
• <strong>Stu<strong>di</strong></strong> <strong>di</strong> trasferimento genico laterale (e.g. antibiotico resistenze,<br />
metabolismo degli xenobiotici)<br />
• Ricostruzione <strong>di</strong> vie metaboliche (KEGG)<br />
• Un ponte per le scienze omiche<br />
• Biologia dei sistemi<br />
“it is like being given the operating manual for your car after you have been<br />
trying to trouble-shoot a problem with it for some time”<br />
David Relman, Stanford University, intervistato nel 2011 dal New York Times
(BREVE) STORIA DEL SEQUENZIAMENTO DEI<br />
GENOMI MICROBICI<br />
• 1977 – primo genoma completamente sequenziato:<br />
batteriofago φX174 (5386 bp)<br />
• Primo sequenziamento utilizzando frammenti random <strong>di</strong><br />
DNA: batteriofago λ (48502 bp)<br />
• 1986 – sequenziamento dei genomi mitocondriali (187<br />
kbp) e cloroplastici (121 kbp) <strong>di</strong> Marchantia polymorpha<br />
• 1995 – primo sequenziamento genomico completo <strong>di</strong> un<br />
organismo libero – Haemophilus influenzae (1.83 Mbp)<br />
<strong>Stu<strong>di</strong></strong> <strong>di</strong> trasferimento genico laterale (e.g. antibiotico<br />
resistenze, metabolismo degli xenobiotici)<br />
• Fine anni ‘90 – <strong>di</strong>versi microorganismi <strong>di</strong> interesse, tra cui<br />
archaea (Methanococcus jannaschii – 1996) ed eucarioti<br />
(Saccharomices cerevisiae – 1996)<br />
Sanger et al. (1977) Nucleotide sequence of bacteriophage φX174 Nature 265:687-695
OGGI<br />
• 3173 genomi completi: 153 archaea, 2487 batteri, 173 eucarioti<br />
http://www.genomesonline.org<br />
• Informazioni genomiche incomplete per 248 archaea, 11635 batteri,<br />
1805 eucarioti<br />
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse<br />
Lagesen et al. (2010) Genome update: the 1000° genome – a cautionary tale Microbiology 156:603-608
SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONE
Glenn TC (2011) Field guide to next-generation DNA sequencers Mol Ecol Res 11:759-769<br />
SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONE
Stein LD (2010) The case of cloud computing in genome informatics Genome Biology 11:207<br />
SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONE
INNOVAZIONE E MINIATURIZZAZIONE<br />
Piastra microtiter usata nel sequenziamento Sanger<br />
Vetrini utilizzati in tecniche <strong>di</strong> seconda generazione<br />
Piastra pico-titer usata nel sequenziamento 454<br />
Nanostrutture e membrane <strong>di</strong> silicio per sequenziamento a<br />
livello <strong>di</strong> singola molecola<br />
Ståhl and Lunderberg. (2012) Towards the single-hour high-quality genome Annu Rev Biochem 81:15.1-15.20
• Prima del deep sequencing<br />
• Clonaggio <strong>di</strong> frammenti<br />
• Vettori BAC e PAC<br />
• PCR<br />
• Primer walking<br />
Anni prima <strong>di</strong> arrivare ad un singolo genoma<br />
• Dopo il deep sequencing<br />
• Frammentazione ed analisi<br />
TECNICHE PER LO STUDIO DELLA GENOMICA<br />
MICROBICA<br />
Due giorni per il genoma completo <strong>di</strong> E. coli O104:H4
Intero genoma<br />
APPROCCIO “ORDERED CLONES”<br />
Grosso<br />
frammento <strong>di</strong><br />
DNA<br />
Digestione e<br />
clonaggio<br />
Frammenti<br />
sequenziati<br />
casualmente<br />
Copertura dei<br />
“gaps”<br />
Ripetere per l’intero genoma
Intero genoma<br />
APPROCCIO DI SEQUENZIAMENTO RANDOM<br />
(“SHOTHGUN”)<br />
Frammentazione<br />
e clonaggio<br />
Sequenziamento<br />
random dei<br />
frammenti<br />
Copertura dei<br />
“gaps”
Contig 1 Contig 2<br />
CONTIGS E COPERTURA DEL GENOMA
• Ri-sequenziamento<br />
Contig 1 Contig 2<br />
CONTIGS E COPERTURA DEL GENOMA<br />
• Allineamento su un genoma noto (riferimento)
• Sequenziamento “de novo”<br />
• Chiusura dei gaps<br />
CONTIGS E COPERTURA DEL GENOMA<br />
Contig 1 Contig 2<br />
Gap
Assembly: unordered set of contigs<br />
Ordered sets of contigs (scaffolds)<br />
DEEP SEQUENCING ED ASSEMBLAGGIO DEI<br />
GENOMI<br />
10 16 21<br />
10 21<br />
Clone walk<br />
PCR product<br />
pri1 pri2<br />
PCR - sequence<br />
16
ANNOTAZIONE DEI GENOMI MICROBICI<br />
• Prima dell’annotazione, un genoma appare come una sequenza <strong>di</strong> 4<br />
basi <strong>di</strong>stribuite casualmente<br />
• Occorre una interpretazione che permetta una comprensione delle<br />
funzioni biologiche<br />
• Steps fondamentali: identificazione <strong>di</strong> ORF (opening rea<strong>di</strong>ng<br />
frames), CDS (co<strong>di</strong>ng sequences) e zone <strong>di</strong> regolazione<br />
• L’annotazione (=previsione della collocazione e della funzione <strong>di</strong><br />
tutti i geni nella sequenza genomica <strong>di</strong> un organismo) è comunque<br />
solo il punto <strong>di</strong> partenza per la caratterizzazione e la comprensione<br />
<strong>di</strong> un organismo
Similarity searches<br />
against reference<br />
databases<br />
ANNOTAZIONE DEI GENOMI MICROBICI<br />
Sequence<br />
Gene pre<strong>di</strong>ction<br />
Proteins<br />
Annotated<br />
Proteins<br />
Pathway pre<strong>di</strong>ction<br />
Calculations & pre<strong>di</strong>ctions<br />
(MW , structure, location etc)<br />
Annotated Proteins &<br />
pathways<br />
Data visualization<br />
Manual e<strong>di</strong>ting
L’ONTOLOGIA DEI GENI<br />
• Ontologie: rappresentazioni <strong>di</strong> oggetti misurabili o <strong>di</strong>rettamente<br />
osservabili, e delle relazioni che avvengono tra essi<br />
(a livello logico, ogni cosa esistente è un sottotipo <strong>di</strong> qualcos’altro)<br />
• L’ontologia dei geni è organizzata in tre gruppi separati:<br />
• Funzioni molecolari<br />
• Processi biologici<br />
• Componenti cellulari<br />
• Occorre tenere conto del fatto che ogni gene può:<br />
• avere più <strong>di</strong> una funzione molecolare<br />
• essere coinvolto in più processi biologici<br />
• agire in più componenti cellulari
ANALISI E RICOSTRUZIONE DI VIE<br />
METABOLICHE<br />
ieri oggi
(ALCUNE) CARATTERISTICHE DEI GENOMI<br />
MICROBICI<br />
Giovannoni et al. (2005) Genome streaming in a cosmopolitan oceanic bacterium Science 309:1242-1245
• Doppio habitat:<br />
GENOMICA MICROBICA E PATOGENICITA’:<br />
IL CASO ESCHERICHIA COLI O157:H7<br />
• Intestino, retto: caldo, costante, ricco <strong>di</strong> nutrienti, crescita vigorosa<br />
• Acqua, suoli, se<strong>di</strong>menti: freddo, fluttuante, nutrienti limitati<br />
• E. coli O157:H7 ha circa 1000 geni in più rispetto a E. coli K12<br />
• Circa il 7.5% del genoma <strong>di</strong> E. coli O157:H7 è costituito da geni <strong>di</strong> virulenza<br />
• Aree in rosso:<br />
geni presenti solo<br />
in E. coli K12<br />
• Aree in<br />
arancione: geni<br />
presenti solo in<br />
E. coli O157:H7<br />
• Aree in blu:<br />
presenti in<br />
entrambi<br />
upregulated with<br />
epithelial cells<br />
12%<br />
toxins<br />
1%<br />
secretion systems<br />
14%<br />
regulator<br />
1%<br />
pathogen island<br />
4% iron acquisition<br />
3%<br />
upregulated with<br />
norepinephrine<br />
9%<br />
defense from host barriers<br />
8%<br />
hemolysin<br />
2%<br />
effacing<br />
1%<br />
adhesion<br />
23%<br />
effector<br />
14%<br />
antigen<br />
3%<br />
upregulated in<br />
human<br />
clinical isolates<br />
5%
Eppinger et al (2011) Genomic anatomy of Escherichia coil O157:H7 PNAS 13:925-935<br />
BIODIVERSITA’ MICROBICA E PATOGENICITA’:<br />
IL CASO ESCHERICHIA COLI O157:H7
SCIENZE OMICHE E<br />
PROSPETTIVE FUTURE
Biologia dei<br />
sistemi<br />
UNA VISIONE DI INSIEME<br />
Biologia molecolare<br />
Scienze<br />
omiche
ug/kg<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
PCB 28<br />
PCB 52<br />
PCB 101<br />
PCB 114<br />
PCB 138<br />
PCB 153<br />
Total<br />
HPCD RE<br />
HPCD BA<br />
PCB 180<br />
STUDI OMICI: TRASCRITTOMICA<br />
Puglisi et al (2010) Transcriptional response of R. aetherovorans I24 to PCB-contaminated se<strong>di</strong>ments Microb Ecol 60:505-515<br />
•<br />
•<br />
•<br />
•<br />
•<br />
•<br />
BP<br />
GLU<br />
SPIKED<br />
PCB<br />
NON CONT<br />
CONT
PROSPETTIVE PER IL FUTURO:<br />
TRASCRITTOMICA A SINGOLA CELLULA<br />
Kang et al (2012) Transcript amplification from single bacterium for transciptome analysis Genome Research 21:925-935
Acidobacteria"<br />
Firmicutes"<br />
Bacteroidetes"<br />
Ac=nobacteria"<br />
Chloroflexi"<br />
Gemma=monadates"<br />
Nitrospira"<br />
Planctomycetes"<br />
Proteobacteria"<br />
Verrucomicrobia"<br />
Cyanobacteria"<br />
Unclassified"<br />
(869)&<br />
(900)&<br />
(4127)&<br />
(4884)&<br />
(4638)&<br />
(1556)&<br />
METAGENOMICA AMBIENTALE<br />
(8138)&<br />
(10230)&<br />
Suoli& Oceani& Ghiacciai&<br />
(82783)&<br />
0" 5000" 10000" 15000" 20000"<br />
numero"<strong>di</strong>"sequenze"16S"depositate"in"RDP"(totali)"<br />
(383115)&<br />
(182084)&<br />
(252218)&
Tamames et al. BMC Microbiology 2010, 10:85<br />
METAGENOMICA AMBIENTALE<br />
soil% human% ocean% gut% freshwater% plants% other%<br />
bacteria(<br />
soil% human% ocean% gut% freshwater% plants% other%<br />
archaea&<br />
RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) database query among<br />
1727996 (bacteria) and 73354 (archea) total sequences
Brul et al (2012) Omics technologies in quantitative microbial risk assessment Trends Food Sci Technol doi: 10.1016/j.tifs.2012.04.004
METATRASCRITTOMICA
CONCLUSIONI<br />
• Avanzamento tecnologico fornisce strumenti sempre più potenti<br />
• Necessità <strong>di</strong> una ancor maggiore comprensione dei processi<br />
biologici<br />
• Opportuni strumenti bioinformatici accompagnati da solide ipotesi <strong>di</strong><br />
ricerca<br />
• Non “scordarsi” <strong>di</strong> altri approcci (e.g., coltivazione e stu<strong>di</strong> fisiologici)<br />
• Genomica come ponte per le scienze omiche<br />
• Ampissime potenzialità <strong>di</strong> applicazione <strong>nei</strong> settori dell’agricoltura,<br />
degli alimenti, dell’ambiente e della salute
Prof. PierSandro Cocconcelli<br />
Dott. Fabrizio Cappa<br />
Dott.ssa Simona Gazzola<br />
Dott.ssa Daniela Bassi<br />
Dott.ssa Cecilia Fontana<br />
Dott.ssa Ester Pietta<br />
Istituto <strong>di</strong> Microbiologia, <strong>Università</strong> Cattolica del Sacro Cuore, Piacenza<br />
Prof. Marco Trevisan<br />
Dott. Sotirios Vasileia<strong>di</strong>s<br />
RINGRAZIAMENTI<br />
Istituto <strong>di</strong> Chimica Agraria, <strong>Università</strong> Cattolica del Sacro Cuore, Piacenza
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