La duplicazione del DNA

La duplicazione del DNA

Evidenze sperimentali della duplicazione del DNA:
visualizzazione in microscopia elettronica

Conclusioni:
La duplicazione del DNA procede in maniera bidirezionale a partire da un
punto preciso dei cromosomi virali, batterici e cellulari, denominato
ORIGINE DELLA DUPLICAZIONE. DUPLICAZIONE Per ciascuna molecola di DNA si
osservano quindi due FORCELLE REPLICATIVE che avanzano in opposte
direzioni. Negli eucarioti, che hanno quantità molto elevate di DNA
rispetto ai virus e alle cellule batteriche, il DNA viene duplicato a
partire da molte origini della duplicazione. Ciò garantisce una velocità
complessiva di sintesi compatibile con i tempi osservati.
Dal momento che i due filamenti di DNA sono antiparalleli e che gli
enzimi responsabili della sintesi del DNA hanno una precisa direzionalità
d’azione, occorre chiarire bene la dinamica dell’intero processo.

La duplicazione del DNA è un meccanismo che richiede
energia. La reazione di polimerizzazione dei nucleotidi
trifosfati ha luogo con una precisa polarità ed è
catalizzata da enzimi chiamati DNA polimerasi.
polimerasi
Nell’intero processo di duplicazione sono coinvolte almeno
10 attività enzimatiche differenti

1
Analizziamo qui la duplicazione di un DNA lineare a doppio filamento,
nel quale i filamenti sono correttamente orientati in senso antiparallelo
5’
3’
DNA a doppio filamento
3’
5’

2
L’apertura della doppia elica è catalizzata dall’intervento di
un enzima, la DNA ELICASI, ELICASI che si ancora in corrispondenza di
un punto preciso del cromosoma circolare di E. coli, detto ORIGINE
DELLA DUPLICAZIONE. DUPLICAZIONE L’apertura della doppia elica richiede energia
che proviene dalla idrolisi dell’ATP.
5’
3’
2ATP
2ADP+Pi
ELICASI
3’
5’

3
Intervento di proteine che legano il DNA a singola elica
(SSBP, SSBP, Single Strand-Binding
Strand Binding Proteins) Proteins in modo stechiometrico
e mantengono distesi i singoli filamenti di DNA.
5’
3’
3’
SSBP
5’

4
5’
Intervento di una PRIMASI che sintetizza inneschi
costituiti da RNA in direzione 5’->3 >3’, utilizzando come
stampo la catena complementare.
3’
5’
3’
3’
3’
5’
5’

5
5’
3’
Direzione di apertura
della forcella replicativa
Intervento della DNA polimerasi III che si aggancia
all’estremità 3’-OH dell’innesco (primer primer) di RNA e
sintetizza DNA in direzione 5’->3’, utilizzando
come stampo la catena complementare.
DNA preesistente
DNA di nuova sintesi
Innesco di RNA
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
DNA polimerasi
3’

Dilemma
• La DNA polimerasi funziona solo
con polarità 5’->3’.
• Su un filamento la sintesi è
continua, sull’altro la sintesi è
discontinua.
• Come si arriva ad avere una
molecola di DNA integra?

Proprietà delle DNA polimerasi dei procarioti
Funzioni pol I pol II pol III
Polimerizzazione 5’ -> 3’ + + +
Esonucleasi 3’ -> 5’ + + +
Esonucleasi 5’ -> 3’ + - -
Dimensioni (kDa) 103 90 130
Molecole/cellula 400 10 - 20 4
Gene strutturale polA pol B pol C
Velocità 45.000 nt/minuto
Proprietà delle DNA polimerasi degli eucarioti
pol α pol δ pol ε pol β pol γ
Localizzazione nucleo nucleo nucleo nucleo mitocondri
Funzione Inizio Riparazione riparazione riparazione Replicazione DNA
Replicazione mitocondriale
Priming
Nucleasi NO 3’ -> 5’ eso 3’ -> 5’ eso NO, 5’ fosfatasi 3’ -> 5’ eso

Esperimento di Okazaki. 1
Allo scopo di indagare sul meccanismo di duplicazione del DNA e su alcuni degli enzimi coinvolti nella sua sintesi,
Okazaki fece uso di un MUTANTE CONDIZIONALE difettivo per l’enzima ligasi. Un mutante condizionale è un
organismo portatore di una mutazione che si esprime solo in determinate condizioni.
Ad esempio, il ceppo batterico usato da Okazaki era un Escherichia coli incapace di crescere a 42°C a causa di una
mutazione a carico dell’enzima ligasi che non è più attiva a questa temperatura. A 32°C, invece, i batteri crescono
regolarmente in quanto l’enzima ligasi, anche se è mutato, funziona regolarmente a 32°C.
Escherichia coli, ceppo selvatico Escherichia coli, ceppo ts per la ligasi
Coltura a 42°C Coltura a 32°C
Crescita, ligasi attiva Crescita, ligasi attiva
Coltura a 42°C Coltura a 32°C
Non cresce, ligasi inattiva
Crescita, ligasi attiva

5’
3’
5’
3’
6. Degradazione dei primers e riempimento degli spazi
con nuovo DNA ad opera della DNA polimerasi I
7. Chiusura dei “gap” ad opera della DNA ligasi
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
8. Al termine del processo, sono state prodotte
due molecole di DNA.
3’
5’
3’
5’

Esperimento di Okazaki. 2.
Ceppo ts
Coltivazione a 32°C
in presenza di 3 H-TdR
per pochi minuti
Coltivazione a 32°C
in presenza di 3 H-TdR
per pochi minuti
Terreno contenente 3H-Tdr
sostituito con timidina non
radioattiva. Ulteriore coltivazione a 42°C con
raccolta di aliquote della coltura a
tempi diversi, estrazione del DNA
e analisi in elettroforesi e
autoradiografia
Terreno contenente 3H-Tdr
sostituito con timidina non
radioattiva.
DNA ad alto peso
molecolare (sintesi
continua)
DNA a basso peso
molecolare (sintesi
per frammenti)
DNA ad alto peso
molecolare (sintesi
continua)
DNA a basso peso
molecolare (sintesi
per frammenti)
Ulteriore coltivazione a 32°C con
raccolta di aliquote della coltura a
tempi diversi, estrazione del DNA
e analisi in elettroforesi e
autoradiografia
0 5 10 15
0 5 10 15

Conclusioni:
Nei pochi minuti di esposizione alla timidina marcata, questa viene incorporata nel DNA, sia nel
filamento anticipato, sia in quello ritardato. Se in seguito i batteri vengono ricoltivati in terreno non
radioattivo, e ad una temperatura permissiva per l’attività della ligasi, (32°C), la radioattività
precedentemente associata ai frammenti viene a far parte di un DNA a peso molecolare sempre più
elevato (gel superiore, la banda si sposta gradualmente verso l’alto).
Se viceversa la ricoltivazione viene effettuata ad una temperatura di 42°C, quindi non permissiva per
l’attività della ligasi di questo ceppo particolare, la radioattività associata ai frammenti di Okazaki non
potrà entrare a far parte del DNA ad alto peso molecolare, quindi in autoradiografia si vedrà sempre
sempre la radioattività associata a questi frammenti.
Ciò dimostra che la ligasi è indispensabile nel processo di duplicazione del DNA e che nel corso di
questo processo si passa attraverso uno stadio nel quale esistono frammenti di DNA a basso peso
molecolare.
DOMANDA: Come fareste voi a selezionare dei ceppi batterici termosensibili ???
Mandare eventualmente la risposta al mio indirizzo e-mail: Alberto.Clivio@unimi.it

Quadro sintetico del processo di duplicazione

5’
3’
5’
origine della replicazione
1. Apertura della doppia elica da parte dell’enzima elicasi.
2. Sintesi degli inneschi di RNA (“primers”) ad opera
dell’enzima primasi (in direzione 5’-->3’)
3’
5’
3’
3. Intervento della DNA polimerasi III che
riconosce l’estremità 3’OH degli inneschi
e sintetizza DNA in direzione 5’ -->3’
subentrando alla primasi.
Direzione di apertura delle forcelle replicative
3’
5’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
4. Le molecole di DNA polimerasi orientate nella direzione
di apertura delle forcelle replicative continuano la sintesi di
DNA.
Quelle che procedono in senso opposto necessitano di
nuovi inneschi che forniscono estremità 3’OH disponibili.
5’
3’
Direzione di apertura delle forcelle replicative
sintesi discontinua
(frammenti di Okazaki)
3’
5’
sintesi continua
5. Di conseguenza, in corrispondenza di ciascuna
forcella replicativa, uno dei due filamenti del DNA viene
sintetizzato sotto forma di un filamento continuo, mentre
l’altro a frammenti che verranno in seguito legati tra loro
dall’enzima ligasi, dopo che gli inneschi di RNA sono stati
rimossi e sostituiti da DNA ad opera della DNA polimerasi I.
5’
3’
3’
5’
3’
5’

In questo modo, tutto il DNA viene duplicato; i frammenti a basso
peso molecolare vengono progressivamente incorporati in una
molecola di grandi dimensioni.
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’

DUPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI
Che cosa succede a livello dell’origine della replicazione?
ORI

Che cosa succede a livello dell’origine della replicazione?
1. Formazione del complesso ORC in corrispondenza delle
origini di replicazione
ORI

Che cosa succede a livello dell’origine della replicazione?
2. Caricamento dei fattori di replicazione
(DNA-binding factor replication protein A, RP-A)
ORI

Che cosa succede a livello dell’origine della replicazione?
3. Destabilizzazione della doppia elica

Che cosa succede a livello dell’origine della replicazione?
4. Apertura della doppia elica
e reclutamento della topoisomerasi I
Elicasi

Che cosa succede a livello dell’origine della replicazione?
5. Inizio della sintesi del filamento anticipato
per reclutamento di Pol α-primasi
polα pol
polα
pol

Che cosa succede a livello dell’origine della replicazione?
6. Sintesi del filamento anticipato
e del filamento ritardato
per reclutamento di pol δ e pol ε
ε
δ
α
α δ
ε

Che cosa succede a livello dell’origine della replicazione?
7. Commutazione delle polimerasi α sul filamento ritardato con
l’apertura ulteriore delle forcelle replicative
ε
δ
α
α
δ
ε

Che cosa succede a livello dell’origine della replicazione?
8. Sintesi di nuovi primers da parte della pol α e reclutamento di altre molecole di
pol δ ed ε per la sintesi dei frammenti di Okazaki, che in seguito verranno
saldati tra loro dalla ligasi dopo la degradazione dei primers ad RNA
Direzione di apertura
ε
δ
α
ε
δ
ε
δ
α
δ
ε
Direzione di apertura