TRASCRIZIONE DEL DNA

TRASCRIZIONE DEL DNA
1

Trascrizione
Le nuove molecole di RNA sono formate per incorporazione
di nucleotidi complementari al filamento stampo. stampo.
5
’
3’
Filamento di DNA
codificante
GTCATTCGG
3’
G U C A U U C
G
G
CAGTAAGCC
Filamento di DNA
stampo
DNA
RNA
3’
5’
5
’
2

Numero di filamenti
Zucchero presente
Basi nucleotidiche
3

Tipi di RNA
Abbreviazione Funzione
mRNA RNA Messaggero - codifica
proteine
rRNA RNA Ribosomiale - parte dei ribosomi
- utilizzato per
trdurre l’mRNA mRNA in
proteine
tRNA RNA Transfer - accoppia la regione
che lega il codone
dell’mRNA dell mRNA ed il suo
amminoacido
corrispondente
4

RNA
RNA messaggero (mRNA): sequenza di RNA direttamente
trascritta dal DNA.
RNA monocistronico: la sua sequenza codifica per una sola
proteina
RNA policistronico: RNA che contiene più sequenze ognuna
delle quali codifica per una proteine
5

Elica a singolo filamento;
mRNA
la catena idrofilica di ribosio e
legami fosfodiesterei sono esterni;
Le basi nucleotidiche sono poste
all’interno dell’avvolgimento ad elica;
può formare doppie eliche di
forma A con DNA ed RNA;
Il gruppo OH in posizione 2’ può
formare legami idrogeno che
stabilizzano la struttura;
Le basi nucleotidiche si appaiano
come nel DNA ed inoltre formano
interazioni idrofobiche
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tRNA
7

RNA polimerasi
Catalizzano sintesi di RNA.
Non necessitano di un primer.
Iniziano a sintetizzare RNA a partire da
specifiche sequenze
Necessitano di un DNA stampo
La trascrizione è meno accurata della
replicazione del DNA: 1 errore/10 4 .
8

Trascrizione
Avviene in tre step
Inizio
Allungamento
Termine
9

RNA polimerasi
•RNA polimerasi sintetizza RNA in direzione 5’ 3’
•Non necessita di un innesco
•Utilizza ribonucleosidi 5’-trifosfato (ATP, GTP, UTP
e CTP) e richiede Mg ++
•Ogni nucleotide è selezionato in base alle regole
della complementarietà A:U e G:C e alla geometria
della coppia di basi
•V di 50 nt/s
10

•Il 3’OH agisce da nucleofilo sul gruppo
fosfato del ribonucleoside trifosfato
entrante e si ha liberazione di PPi
(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi
La chimica di sintesi dell’RNA è identica a
quella del DNA. Il PPi viene scisso in 2Pi dalla
pirofosfatasi inorganica.
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Sequenza codificante= sequenza di DNA 5’ 3’ catena
senso (+)
Sequenza stampo = sequenza complementare di DNA
in direzione 3’ 5’ catena antisenso (-)
La direzione di lettura dello stampo è 3’ 5’,
La direzione di sintesi è 5’ 3’
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Il filamento stampo (-) è trascritto ad mRNA
Filamento codificante (+) filamento
5’ 3’
ATG
TAG
3’
Start
codon
Il Codone è evidenziato sull’mRNA
AUG
UAG
5’ 3’ RNA
TAC
Filamento stampo
ATC
(-) filamento
Sequenze
identiche
5’
13
Juang RH (2004) BCbasics

3’
Entrambi I filamenti di DNA potrebbero
essere trascritti
DNA
5’ 3’
3’ 5’
RNA
RNA è sintetizzato in direzione 5’→ 3’
RNA
5’ 3’
Promotore marca l’inizio della trascrizione
DNA
5’
14
Juang RH (2004) BCbasics

Un unico enzima responsabile della sintesi di rRNA, tRNA e
mRNA
Nucleo dell’enzima (core)
a = 40 kDa
β = 155 kDa
β’ = 160 kDa
RNA polimerasi batterica
α2ββ’
Nucleo dell’enzima
Subunità σ =32-90 kDa specificità per il promotore
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Inizio
L’RNA polimerasi deve legarsi al DNA da
trascrivere su appropriati sequenze di inizio
della trascrizione detti promotori
Per convenzione:
-100
Sito d’inizio
-1
+1
+100
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Promotore in E. coli
-35 -10 +1
5’----TTGACA------------------TATAAT-------Sito
d’inizio
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Footprinting
18

Legame dell’RNA dell RNA polimerasi al sito d’inizio d inizio
Il nucleo dell’enzima ha un’alta affinità per il DNA
α
α
ββ’
σ
Core Oloenzima
La subunità σ ha due vantaggi: diminuisce di 104 volte
l’affinità dell’RNA polimerasi per il DNA e riconosce
i siti promotori
19

La RNA
polimerasi srotola
di 17 coppie di
basi il DNA
stampo.
Si passa da
complesso
promotore chiuso
a complesso
promotore aperto
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Allungamento
L’RNA polimerasi non ha bisogno di un primer.
La sintesi va in direzione 5’ 3’.
In 5’ il primo ribonucleotide è caratteristico
pppG o pppA
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Dopo la formazione del primo legame
fosfodiesterico si ha:
distacco della subunità σ;
formazione della bolla di trascrizione;
formazione di un elica ibrida di DNA –RNA;
L’RNA polimerasi si sposta lungo lo stampo
srotolando la doppia elica di DNA;
L’RNA polimerasi non ha attività nucleasica.
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Termine
Presenza di segnali di terminazione.
Sequenza palindromica ricca di G-C seguita
da una regione ricca di A-T.
Sequenza di quattro residui di uracile.
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Proteina ρ
In alcuni geni il termine della trascrizione è
coadiuvato dalla proteina ρ che funziona come
un’elicasi
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Trascrizione tRNA ed rRNA
28

Trascrizione tRNA ed rRNA
29

TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI
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RNA polimerasi negli Eucarioti
RNA polimerasi I rRNA
RNA polimerasi II mRNA
RNA polimerasi III tRNA,
snRNA
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I promotori negli eucarioti hanno una
struttura modulare
Elementi del promotore “core”: TATA box
Elementi basali: CAAT box, GC box
Enhancers, silencers
Moduli di risposta a segnali provenienti
dall’esterno della cellula
Moduli di risposta tessuto-specifici
Moduli di risposta a regolatori dello sviluppo
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TFIID
TFIIA
TFIIB
TFIIF
RNA
polimerasi II
TFIIE
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Attivatori
Queste proteine si legano
ai siti del gene noto come
enhancer. Gli attivatori
aiutano a determinare
quale gene deve essere
trascritto ed aumentano la
velocità di trascrizione
Coattivatori
Queste molecole
“adattatrici” integrano i
segnali di attivatori e
forse di repressori
Repressori
Queste proteine si legano a
siti di set selezionati di
geni noti come silencers.
Interferiscono con la
funzione degli attivatori e
rallentano la trascrizione
Fattori di trascrizione
basale
In risposta a stimoli degli
attivatori questi fattori
posizionano l’RNA
polimerasi all’inizio della
regione codificante del
gene ed indirizzano gli
enzimi nel verso opportuno
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Capping
Poliadenilazione
Splicing
MATURAZIONE DELL’RNA DELL RNA
39

Capping
-Aggiunta all’estremità 5’
dell’mRNA di un nucleotide
modificato, la 7’metilguanosina
-A cosa serve? Stabilizza la
molecola di mRNA e rende
più efficace la sintesi
proteica
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Poliadenilazione
Nelle cellule eucariotiche la maggior parte
degli mRNA ha una “coda” di ADENINE (poli-A)
all’estremità 3’.
Un enzima specifico chiamato POLI-A-
POLIMERASI attacca una catena di 150-200
nucleotidi adenina all’estremità 3’ dell’mRNA
dopo la trascrizione.
A cosa serve? Non è chiaro, aumenta la
stabilità e quindi la durata di vita della
molecola di mRNA ha un ruolo nell’inizio della
traduzione
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Splicing
GENE
Pre-mRNA
ORGANIZZAZIONE DEI GENI NEGLI EUCARIOTI
RNA maturo
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Autosplicing
Introni tipo I
Introni tipo II
Meccanismi di splicing
No Autosplicing
Gruppo III
Gruppo IV
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Meccanismo
di splicing
Introni tipo I
5’UA………….GU3’
Intervento di una
guanosina
monofosfato, il 3’OH
agisce da nucleofilo
sul legame
fosfodiesterico fra i
nucleotidi UA.
L’U-OH in 3’ agisce da
nucleofilo sul II
legame
fosfodiesterico GU.
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Meccanismo di splicing
Introni tipo II
5’AGGU……………….A…………………CAGG3’
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Lo splicing degli esoni nel premRNA
avviene mediante due
reazioni di transesterificazione
Nella prima reazione il legame
esterico fra il 5’-P dell’introne
ed il 3’-O dell’esone 1 è
scambiato con il legame all’O
in 2’ del residuo di A del sito
di ramificazione
Nella seconda reazione il
legame esterico fra il 5’-P
dell’esone 2’ ed il 3’-O
dell’introne è scambiato con il
legame al 3’-O dell’introne
unendo così i due esoni.
47

Splicing del gruppo III
Il meccanismo è simile
al tipo II, occorre:
idrolisi di ATP,
complessi RNA
proteine specifici che
portano alla formazione
dello spliceosoma
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Splicing del gruppo IV
Occorre:
Endonucleasi specifiche
Idrolisi di ATP.
Le endonucleasi tagliano contemporaneamente alle estremità
dell’introne ed agiscono come una DNA ligasi sulle estremità
degli esoni
5’
OH
Endonucleasi
+ATP
Pi
Pi-ribosio-Adenina
3’
50

Il 15% delle mutazioni puntiformi che
causano malattie genetiche nell’uomo è a
carico dello SPLICING
MALATTIE CAUSATE DA DIFETTI NEL MECCANISMO
DI SPLICING:
Sindrome di Frasier (difetti nello sviluppo di rene e
gonadi)
Distrofia miotonica
Retinite pigmentosa
Atrofia muscolare spinale
Alcuni tipi di tumore
Indoprofen- farmaco
antiinfiammatorio non steroideosembra
aumentare i livelli della
proteina responsabile della
sopravvivenza dei motoneuroni
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(SMN)

SPLICING ALTERNATIVO
Processo attraverso il quale più mRNA possono
essere generati dallo stesso pre-mRNA
unendo in modo diverso gli esoni.
Viene considerato la fonte più importante di
diversità delle proteine nei vertebrati.
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Meccanismo di splicing alternativo
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GENOMA UMANO
30- 40000 GENI
CENTINAIA DI MIGLIAIA DI PROTEINE!!
54

FARMACI E TRASCRIZIONE
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GLUCOCORTICOIDI
I glucocorticoidi sono farmaci
diffusamente utilizzati in tutte le
condizioni
patologiche in cui vi sia abnorme attivita’
del sistema immunitario.
Hanno azione antiinfiammatoria e
antiproliferativa inibendo l’espressione di
citochine pro-infiammatorie e molecole di
adesione
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MECCANISMO D’AZIONE AZIONE
Gli ormoni steroidei regolano l’espressione di geni specifici in
diversi tessuti attivando recettori e vie di trasduzione
intracellulari.
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MECCANISMO D’AZIONE AZIONE
Attivazione
della trascrizione genica,
Proteine antiinfiammatorie,
ma anche effetti collaterali
Inibizione
della trascrizione genica,
Fattori di trascrizzione
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NF-kB, AP-1, NF-AT

MECCANISMO D’AZIONE AZIONE
GLUCOCORTICOIDI
RECETTORI NUCLEARI
DNA
MODIFICAZIONE DELLA TRASCRIZIONE GENICA
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MECCANISMO D’AZIONE AZIONE
Glucocorticoidi/recettore
DNA
INDUCE REPRIME
Inizia la trascrizione
di geni
Previene la trascrizione
di geni
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Cortisolo
Meccanismo d’azione
•Recettore citoplasmatico
–Traslocazione nucleare
–Stimolazione-inibizione
trascrizione mRNA
–Sintesi proteica
•Interazioni dirette con
proteine
–proteine infiammatorie
–proteine antinfiammatorie
•Recettore glucocorticoidi
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