Il meccanismo della trascrizione
Il meccanismo della trascrizione
Il meccanismo della trascrizione
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
L’inizio <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong> nei<br />
procarioti
Trascrizione:<br />
è il processo di sintesi di RNA a partire da uno stampo di DNA ad opera delle RNA polimerasi,<br />
enzimi che polimerizzano ribonucleotidi in direzione 5’->3’ utilizzando uno dei due filamenti di<br />
DNA come stampo.<br />
5’<br />
3’<br />
Sito di interazione<br />
con l’RNA polimerasi<br />
Sequenza da trascrivere<br />
RNA polimerasi<br />
Filamento di stampo<br />
3’<br />
5’
Interazione <strong>della</strong> RNA polimerasi con il sito promotore<br />
5’<br />
3’<br />
3’ 5’
Scorrimento in direzione <strong>della</strong> sequenza codificante<br />
5’<br />
3’<br />
3’<br />
5’
Inizio <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong> in direzione 5’->3’<br />
utilizzando il filamento C come stampo<br />
W<br />
5’<br />
3’<br />
3’<br />
C<br />
5’<br />
5’
5’<br />
3’<br />
3’ 5’<br />
5’
5’<br />
3’<br />
3’ 5’<br />
5’
5’<br />
3’<br />
3’ 5’<br />
5’
5’<br />
3’<br />
5’<br />
3’<br />
5’
Fine <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong>, distacco <strong>della</strong> RNA polimerasi dal DNA<br />
5’<br />
3’<br />
5’<br />
3’<br />
3’<br />
5’
5’<br />
3’<br />
3’ 5’<br />
5’<br />
3’
Eventuale nuova interazione <strong>della</strong> RNA polimerasi con<br />
il sito promotore<br />
5’<br />
3’<br />
3’ 5’<br />
5’<br />
3’
Le interazioni tra proteine ed acidi nucleici sono dovute alla possibilità di formazione<br />
di legami idrogeno tra basi azotate e residui amminoacidici.
“Footprinting” del DNA<br />
Questa tecnica è stata utilizzata per identificare le regioni del DNA che sono in grado di interagire con le<br />
numerose “DNA-binding proteins”.<br />
1. Marcatura del DNA con 32 P ad una estremità<br />
DNA senza<br />
proteine<br />
DNA con<br />
proteine<br />
Proteina che si lega al DNA<br />
2. Degradazione parziale con DNasi 2. Degradazione parziale con DNasi<br />
3. Frammenti di DNA a diversa lunghezza 3. Frammenti di DNA a diversa lunghezza<br />
(mancano quelli in cui la DNasi non ha potuto tagliare
3’<br />
Struttura del promotore dei procarioti<br />
Filamento di stampo<br />
Punto di inizio<br />
<strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong><br />
RNA<br />
5’ AUG 3’<br />
5’ TTGACA<br />
TATAAT<br />
3’<br />
-35 -10 +1<br />
Pribnow box<br />
5’
E’ quindi possibile identificare (e recuperare) i frammenti di DNA che contengono<br />
le sequenze responsabili <strong>della</strong> interazione con le proteine, sottoponendoli alla<br />
procedura di sequenziazione.<br />
sequenziazione<br />
In questo modo è possibile confrontare le sequenze delle regioni genomiche che<br />
interagiscono con proteine differenti, ma anche le diverse regioni di un genoma che<br />
interagiscono con una stessa proteina.
In genere, i promotori procariotici che contengono le sequenze -10 10 e -35 35 nella<br />
sequenza di consenso originale sono promotori FORTI, la cui attività attività<br />
viene<br />
regolata, come si vedrà più avanti, dai repressori. Vi sono però però<br />
numerosi<br />
promotori nei quali queste sequenze sono modificate, e legano la RNA polimerasi<br />
con minore affinità.<br />
subunità β: 150.600 d<br />
subunità α: 36.600 d<br />
α<br />
α<br />
β β’<br />
enzima “core”: α 2 ββ’<br />
380.000 d<br />
subunità β’: 155.600 d
L’enzima “core” è potenzialmente in grado di trascrivere qualsiasi qualsiasi<br />
segmento di DNA.<br />
Tuttavia, per iniziare la <strong>trascrizione</strong> dai promotori batterici con buona efficienza esso<br />
deve legarsi ad un fattore, chiamato FATTORE SIGMA (σ). ( ).<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
α α α α α α α α<br />
β β’ β β’ β β’ β β’<br />
Assenza di sigma: interazione a scarsa affinità con il DNA<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
Presenza di sigma: interazione affinità con il DNA in corrispondenza<br />
dei promotori aumentata fino a 10 6 volte
Fattori sigma e sequenze di consenso nei promotori procariotici<br />
σ70 σ : TTGACA------------------------TATAAT<br />
70 : TTGACA------------------------<br />
TTGACA------------------------TATAAT<br />
TATAAT<br />
-35<br />
35 -10<br />
10<br />
σ54 σ : GTGGC----------------------TTGCA<br />
54 : GTGGC----------------------<br />
GTGGC----------------------TTGCA<br />
TTGCA<br />
-26<br />
26 -14<br />
14<br />
σ32 σ : CCCCC---------------------TATAAATA<br />
32 : CCCCC---------------------<br />
CCCCC---------------------TATAAATA<br />
TATAAATA<br />
-39<br />
39 -16<br />
16<br />
σ28 σ : TAAA-------------------------GCCGATAA<br />
28 : TAAA-------------------------<br />
TAAA-------------------------GCCGATAA<br />
GCCGATAA<br />
-35<br />
35 -10<br />
10<br />
σ23 σ : TATAATA<br />
23 : TATAATA<br />
-15<br />
15
promotore<br />
Inizio <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong>
Dopo aver interagito con la subunità σ, l’RNA polimerasi<br />
interagisce ad alta affinità con il promotore<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
promotore
L’RNA polimerasi inizia a trascrivere le sequenze codificanti<br />
promotore<br />
5’<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
mRNA nascente
Dopo l’incorporazione di una decina di nucleotidi, la subunità<br />
σ si stacca dall’enzima “core”<br />
promotore<br />
σ<br />
α α<br />
β β’
L’RNA polimerasi procede in direzione dell’estremità terminale<br />
del gene<br />
5’<br />
promotore<br />
mRNA in allungamento<br />
α α<br />
β β’<br />
sequenze ripetute<br />
invertite<br />
AAAAA
In corrispondenza <strong>della</strong> terminazione, molti geni procariotici<br />
contengono due sequenze ripetute invertite, dotate di<br />
autocomplementarietà e seguite da un breve tratto di adenine<br />
(Terminatori di tipo I o rho-indipendenti)<br />
promotore<br />
5’<br />
ansa dovuta all’appaiamento delle<br />
sequenze ripetute invertite nel<br />
filamento di mRNA<br />
mRNA quasi terminato<br />
α α<br />
β β’<br />
AAAAA<br />
sequenze ripetute<br />
invertite
Le sequenze ripetute invertite formano un’ansa nell’mRNA. Questo<br />
risulta essere legato al DNA soltanto attraverso una breve regione<br />
ad appaiamento A-U, poco stabile. Si ha quindi il distacco dell’mRNA<br />
e dell’enzima RNA polimerasi.<br />
ansa dovuta all’appaiamento delle<br />
sequenze ripetute invertite nel<br />
filamento di mRNA<br />
5’<br />
mRNA<br />
UUUUU<br />
AAAAA<br />
sequenze ripetute<br />
invertite<br />
α α<br />
β β’<br />
appaiamento A-U A U debole, distacco<br />
dell’mRNA e <strong>della</strong> RNA pol
L’inizio <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong><br />
negli eucarioti
E’ stato dimostrato che, negli eucarioti, le RNA polimerasi non si legano direttamente al DNA ma<br />
interagiscono con proteine che si legano alle sequenze presenti nella regione del promotore dei geni<br />
Le tre RNA polimerasi degli eucarioti<br />
Enzima Localizzazione condiz. ioniche ottimali<br />
Sensibilità a-amanitina<br />
a amanitina Prodotti<br />
RNA polimerasi I Nucleolo Mg 2+ , bassa F.I. Insensibile rRNA28S, 18S, 5.8S<br />
RNA polimerasi II Cromatina Mn 2+ , alta F.I. Molto sensibile mRNA<br />
RNA polimerasi III Cromatina Mn 2+ , alta F.I. Mediamente sensibile tRNA, snRNA<br />
rRNA 5S<br />
attività dell’enzima<br />
100% pol I<br />
50%<br />
0%<br />
10 -3<br />
pol II<br />
10 -2<br />
10 -1<br />
pol III<br />
10 0<br />
10 1<br />
Concentrazione di α-amanitina (µg/ml)<br />
10 2<br />
10 3
3’<br />
5’<br />
Struttura del promotore degli eucarioti<br />
CCAAT GGGCG<br />
TATAAT<br />
CCAAT box<br />
Filamento di stampo<br />
GC box<br />
60-120 basi a monte del punto<br />
d’inizio <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong><br />
-30<br />
TATA box<br />
Punto di inizio<br />
<strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong><br />
RNA<br />
5’ AUG 3’<br />
+1<br />
5’<br />
3’
Le fasi <strong>della</strong> formazione del complesso di preinizio<br />
TATA INI
Interazione del “Transcription Factor IID” con la TATA box<br />
TF IID<br />
TATA INI
<strong>Il</strong> fattore TF IIB interagisce con TF IID<br />
TF IID<br />
TF IIB<br />
TATA INI
Intervento del TF IIF<br />
TF IID<br />
TF IIF<br />
TF IIB<br />
TATA INI
Reclutamento <strong>della</strong> RNA polimerasi<br />
TF IID<br />
TF IIF<br />
TF IIB<br />
pol II<br />
TATA INI
Formazione del “Pre-initiation complex” (PIC)<br />
TF IIH<br />
TF IID<br />
TF IIF<br />
TF IIB<br />
TF IIE<br />
pol II<br />
TATA INI
Fosforilazione <strong>della</strong> RNA polimerasi<br />
TF IIH<br />
TF IID<br />
TF IIF<br />
TF IIB<br />
TF IIE<br />
P<br />
pol II<br />
TATA INI
Inizio <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong><br />
TF IIH<br />
TF IID<br />
TF IIF<br />
TF IIB<br />
TF IIE<br />
TATA INI<br />
RNA<br />
P<br />
pol II
<strong>Il</strong> <strong>meccanismo</strong> sinora illustrato garantisce un livello basale di attività trascrizionale. L’efficienza del<br />
processo di <strong>trascrizione</strong> può venire incrementata o rallentata attraverso attraverso<br />
l’interazione dei fattori trascri-<br />
zionali con altre sequenze a monte del promotore.<br />
Fattore trascrizionale<br />
Fattori trascrizionali legati<br />
specifico legato all’enhancer alla TATA box<br />
ENHANCER TATA
<strong>Il</strong> modello ad ansa spiega l’effetto delle sequenze distali<br />
e dei fattori che vi si legano sulla formazione del<br />
complesso di preinizio<br />
ENHANCER<br />
TATA<br />
POL<br />
punto di inizio<br />
<strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong>