Il meccanismo della trascrizione
Il meccanismo della trascrizione
Il meccanismo della trascrizione
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L’inizio <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong> nei<br />
procarioti
Trascrizione:<br />
è il processo di sintesi di RNA a partire da uno stampo di DNA ad opera delle RNA polimerasi,<br />
enzimi che polimerizzano ribonucleotidi in direzione 5’->3’ utilizzando uno dei due filamenti di<br />
DNA come stampo.<br />
5’<br />
3’<br />
Sito di interazione<br />
con l’RNA polimerasi<br />
Sequenza da trascrivere<br />
RNA polimerasi<br />
Filamento di stampo<br />
3’<br />
5’
Interazione <strong>della</strong> RNA polimerasi con il sito promotore<br />
5’<br />
3’<br />
3’ 5’
Scorrimento in direzione <strong>della</strong> sequenza codificante<br />
5’<br />
3’<br />
3’<br />
5’
Inizio <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong> in direzione 5’->3’<br />
utilizzando il filamento C come stampo<br />
W<br />
5’<br />
3’<br />
3’<br />
C<br />
5’<br />
5’
5’<br />
3’<br />
3’ 5’<br />
5’
5’<br />
3’<br />
3’ 5’<br />
5’
5’<br />
3’<br />
3’ 5’<br />
5’
5’<br />
3’<br />
5’<br />
3’<br />
5’
Fine <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong>, distacco <strong>della</strong> RNA polimerasi dal DNA<br />
5’<br />
3’<br />
5’<br />
3’<br />
3’<br />
5’
5’<br />
3’<br />
3’ 5’<br />
5’<br />
3’
Eventuale nuova interazione <strong>della</strong> RNA polimerasi con<br />
il sito promotore<br />
5’<br />
3’<br />
3’ 5’<br />
5’<br />
3’
Le interazioni tra proteine ed acidi nucleici sono dovute alla possibilità di formazione<br />
di legami idrogeno tra basi azotate e residui amminoacidici.
“Footprinting” del DNA<br />
Questa tecnica è stata utilizzata per identificare le regioni del DNA che sono in grado di interagire con le<br />
numerose “DNA-binding proteins”.<br />
1. Marcatura del DNA con 32 P ad una estremità<br />
DNA senza<br />
proteine<br />
DNA con<br />
proteine<br />
Proteina che si lega al DNA<br />
2. Degradazione parziale con DNasi 2. Degradazione parziale con DNasi<br />
3. Frammenti di DNA a diversa lunghezza 3. Frammenti di DNA a diversa lunghezza<br />
(mancano quelli in cui la DNasi non ha potuto tagliare
3’<br />
Struttura del promotore dei procarioti<br />
Filamento di stampo<br />
Punto di inizio<br />
<strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong><br />
RNA<br />
5’ AUG 3’<br />
5’ TTGACA<br />
TATAAT<br />
3’<br />
-35 -10 +1<br />
Pribnow box<br />
5’
E’ quindi possibile identificare (e recuperare) i frammenti di DNA che contengono<br />
le sequenze responsabili <strong>della</strong> interazione con le proteine, sottoponendoli alla<br />
procedura di sequenziazione.<br />
sequenziazione<br />
In questo modo è possibile confrontare le sequenze delle regioni genomiche che<br />
interagiscono con proteine differenti, ma anche le diverse regioni di un genoma che<br />
interagiscono con una stessa proteina.
In genere, i promotori procariotici che contengono le sequenze -10 10 e -35 35 nella<br />
sequenza di consenso originale sono promotori FORTI, la cui attività attività<br />
viene<br />
regolata, come si vedrà più avanti, dai repressori. Vi sono però però<br />
numerosi<br />
promotori nei quali queste sequenze sono modificate, e legano la RNA polimerasi<br />
con minore affinità.<br />
subunità β: 150.600 d<br />
subunità α: 36.600 d<br />
α<br />
α<br />
β β’<br />
enzima “core”: α 2 ββ’<br />
380.000 d<br />
subunità β’: 155.600 d
L’enzima “core” è potenzialmente in grado di trascrivere qualsiasi qualsiasi<br />
segmento di DNA.<br />
Tuttavia, per iniziare la <strong>trascrizione</strong> dai promotori batterici con buona efficienza esso<br />
deve legarsi ad un fattore, chiamato FATTORE SIGMA (σ). ( ).<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
α α α α α α α α<br />
β β’ β β’ β β’ β β’<br />
Assenza di sigma: interazione a scarsa affinità con il DNA<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
Presenza di sigma: interazione affinità con il DNA in corrispondenza<br />
dei promotori aumentata fino a 10 6 volte
Fattori sigma e sequenze di consenso nei promotori procariotici<br />
σ70 σ : TTGACA------------------------TATAAT<br />
70 : TTGACA------------------------<br />
TTGACA------------------------TATAAT<br />
TATAAT<br />
-35<br />
35 -10<br />
10<br />
σ54 σ : GTGGC----------------------TTGCA<br />
54 : GTGGC----------------------<br />
GTGGC----------------------TTGCA<br />
TTGCA<br />
-26<br />
26 -14<br />
14<br />
σ32 σ : CCCCC---------------------TATAAATA<br />
32 : CCCCC---------------------<br />
CCCCC---------------------TATAAATA<br />
TATAAATA<br />
-39<br />
39 -16<br />
16<br />
σ28 σ : TAAA-------------------------GCCGATAA<br />
28 : TAAA-------------------------<br />
TAAA-------------------------GCCGATAA<br />
GCCGATAA<br />
-35<br />
35 -10<br />
10<br />
σ23 σ : TATAATA<br />
23 : TATAATA<br />
-15<br />
15
promotore<br />
Inizio <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong>
Dopo aver interagito con la subunità σ, l’RNA polimerasi<br />
interagisce ad alta affinità con il promotore<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
promotore
L’RNA polimerasi inizia a trascrivere le sequenze codificanti<br />
promotore<br />
5’<br />
σ<br />
α α<br />
β β’<br />
mRNA nascente
Dopo l’incorporazione di una decina di nucleotidi, la subunità<br />
σ si stacca dall’enzima “core”<br />
promotore<br />
σ<br />
α α<br />
β β’
L’RNA polimerasi procede in direzione dell’estremità terminale<br />
del gene<br />
5’<br />
promotore<br />
mRNA in allungamento<br />
α α<br />
β β’<br />
sequenze ripetute<br />
invertite<br />
AAAAA
In corrispondenza <strong>della</strong> terminazione, molti geni procariotici<br />
contengono due sequenze ripetute invertite, dotate di<br />
autocomplementarietà e seguite da un breve tratto di adenine<br />
(Terminatori di tipo I o rho-indipendenti)<br />
promotore<br />
5’<br />
ansa dovuta all’appaiamento delle<br />
sequenze ripetute invertite nel<br />
filamento di mRNA<br />
mRNA quasi terminato<br />
α α<br />
β β’<br />
AAAAA<br />
sequenze ripetute<br />
invertite
Le sequenze ripetute invertite formano un’ansa nell’mRNA. Questo<br />
risulta essere legato al DNA soltanto attraverso una breve regione<br />
ad appaiamento A-U, poco stabile. Si ha quindi il distacco dell’mRNA<br />
e dell’enzima RNA polimerasi.<br />
ansa dovuta all’appaiamento delle<br />
sequenze ripetute invertite nel<br />
filamento di mRNA<br />
5’<br />
mRNA<br />
UUUUU<br />
AAAAA<br />
sequenze ripetute<br />
invertite<br />
α α<br />
β β’<br />
appaiamento A-U A U debole, distacco<br />
dell’mRNA e <strong>della</strong> RNA pol
L’inizio <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong><br />
negli eucarioti
E’ stato dimostrato che, negli eucarioti, le RNA polimerasi non si legano direttamente al DNA ma<br />
interagiscono con proteine che si legano alle sequenze presenti nella regione del promotore dei geni<br />
Le tre RNA polimerasi degli eucarioti<br />
Enzima Localizzazione condiz. ioniche ottimali<br />
Sensibilità a-amanitina<br />
a amanitina Prodotti<br />
RNA polimerasi I Nucleolo Mg 2+ , bassa F.I. Insensibile rRNA28S, 18S, 5.8S<br />
RNA polimerasi II Cromatina Mn 2+ , alta F.I. Molto sensibile mRNA<br />
RNA polimerasi III Cromatina Mn 2+ , alta F.I. Mediamente sensibile tRNA, snRNA<br />
rRNA 5S<br />
attività dell’enzima<br />
100% pol I<br />
50%<br />
0%<br />
10 -3<br />
pol II<br />
10 -2<br />
10 -1<br />
pol III<br />
10 0<br />
10 1<br />
Concentrazione di α-amanitina (µg/ml)<br />
10 2<br />
10 3
3’<br />
5’<br />
Struttura del promotore degli eucarioti<br />
CCAAT GGGCG<br />
TATAAT<br />
CCAAT box<br />
Filamento di stampo<br />
GC box<br />
60-120 basi a monte del punto<br />
d’inizio <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong><br />
-30<br />
TATA box<br />
Punto di inizio<br />
<strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong><br />
RNA<br />
5’ AUG 3’<br />
+1<br />
5’<br />
3’
Le fasi <strong>della</strong> formazione del complesso di preinizio<br />
TATA INI
Interazione del “Transcription Factor IID” con la TATA box<br />
TF IID<br />
TATA INI
<strong>Il</strong> fattore TF IIB interagisce con TF IID<br />
TF IID<br />
TF IIB<br />
TATA INI
Intervento del TF IIF<br />
TF IID<br />
TF IIF<br />
TF IIB<br />
TATA INI
Reclutamento <strong>della</strong> RNA polimerasi<br />
TF IID<br />
TF IIF<br />
TF IIB<br />
pol II<br />
TATA INI
Formazione del “Pre-initiation complex” (PIC)<br />
TF IIH<br />
TF IID<br />
TF IIF<br />
TF IIB<br />
TF IIE<br />
pol II<br />
TATA INI
Fosforilazione <strong>della</strong> RNA polimerasi<br />
TF IIH<br />
TF IID<br />
TF IIF<br />
TF IIB<br />
TF IIE<br />
P<br />
pol II<br />
TATA INI
Inizio <strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong><br />
TF IIH<br />
TF IID<br />
TF IIF<br />
TF IIB<br />
TF IIE<br />
TATA INI<br />
RNA<br />
P<br />
pol II
<strong>Il</strong> <strong>meccanismo</strong> sinora illustrato garantisce un livello basale di attività trascrizionale. L’efficienza del<br />
processo di <strong>trascrizione</strong> può venire incrementata o rallentata attraverso attraverso<br />
l’interazione dei fattori trascri-<br />
zionali con altre sequenze a monte del promotore.<br />
Fattore trascrizionale<br />
Fattori trascrizionali legati<br />
specifico legato all’enhancer alla TATA box<br />
ENHANCER TATA
<strong>Il</strong> modello ad ansa spiega l’effetto delle sequenze distali<br />
e dei fattori che vi si legano sulla formazione del<br />
complesso di preinizio<br />
ENHANCER<br />
TATA<br />
POL<br />
punto di inizio<br />
<strong>della</strong> <strong>trascrizione</strong>
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