6 Enzimi - fabio zonin

Appunti Appunti Appunti di di BIOCHIMICA BIOCHIMICA BIOCHIMICA – a cura di fabio Zonin 6 6 GLI GLI ENZIMI
ENZIMI
Gli enzimi enzimi enzimi sono catalizzatori catalizzatori catalizzatori proteici proteici proteici che, in condizioni fisiologiche, a 37 °C e a pH neutro, fanno
aumentare la velocità delle reazioni, restando immutati al termine del processo. Essi incanalano
selettivamente i reagenti, detti substrati substrati, substrati
in vie biochimiche utili, fra le tante reazioni biologiche
possibili sul piano energetico. Gli enzimi controllano tutti gli eventi metabolici e presentano un
sistema di controllo molto efficiente. Da studi sul genoma umano, ¼ dei geni umani codificano per
enzimi che catalizzano reazioni metaboliche
NOMENCLATURA
NOMENCLATURA NOMENCLATURA DEGLI DEGLI ENZIMI ENZIMI
Ad ogni enzima si attribuiscono 2 nomi: il nome
nome
corrente corrente, corrente corrente breve e di utilizzo abituale, ed il
nome nome nome sistematico sistematico sistematico completo, che permette
l’identificazione univoca dell’enzima.
Il Il Il nome nome nome corrente corrente
corrente
Il nome degli enzimi più comuni porta il
suffisso –asi asi unitamente al nome del substrato
della reazione (es. glicosidasi) o ad una
descrizione descrizione dell’azione dell’azione dell’azione dell’enzima dell’enzima dell’enzima (es. lattato
deidrogenasi). Alcuni enzimi conservano il
vecchio nome che non dà indicazione alcuna
sulla reazione chimica associata (es. tripsina).
Il Il nome nome sistematico
sistematico
La International International International International Union Union Union Union of of of of Biochemistry Biochemistry Biochemistry Biochemistry and and and and
Molecular Molecular Molecular Molecular Biology Biology Biology Biology (IUBMB IUBMB IUBMB) IUBMB ha messo a punto
un sistema di nomenclatura ove gli enzimi sono
suddivisi in 6 classi principali, ciascuna delle
quali comprende numerosi sottogruppi. Il
suffisso –asi è unito ad una descrizione
abbastanza completa delle reazione catalizzata
(es. D-gliceraldeide 3-fosfato: NAD ossido
reduttasi). I nomi IUBMB non presentano
ambiguità e forniscono un’informazione
completa, ma sono lunghi e scomodi per l’uso
abituale.
PROPRIETÀ PROPRIETÀ DEGLI DEGLI ENZIMI
ENZIMI
Esistono alcuni tipi di RNA, detti ribozimi ribozimi, ribozimi che possono avere un’attività enzimatica; essi catalizzano
la rottura e la sintesi di legami fosfodiesterici.
Siti Siti attivi
attivi
Nelle molecole enzimatiche è presente una particolare tasca o solco, denominato sito sito attivo attivo, attivo che
contiene delle catene laterali di aminoacidi che creano una superficie tridimensionale complementare
al substrato. Il sito attivo si lega al substrato, formando un compl complesso compl complesso
esso enzima enzima-substrato
enzima substrato substrato (ES ES ES) ES che si
converte nel complesso complesso enzima enzima-prodotto
enzima
prodotto (EP EP EP) EP il quale, successivamente, si dissocia in enzima e
prodotto.
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6 6 6 GLI GLI ENZIMI ENZIMI
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Efficienza Efficienza Efficienza catalitica catalitica
catalitica
un enzima può consentire ad una reazione di avvenire ad una
velocità da 103 a 108 volte maggiore rispetto alla velocità
della stessa reazione non catalizzata. In media un enzima piò
trasformare in prodotto da 100 a 1000 molecole di substrato
al secondo. Il numero di molecole di substrato convertite in
prodotto da una molecola di enzima in un secondo è detto
numero numero di di turnover turnover. turnover
Specificità Specificità
Specificità
Gli enzimi sono altamente altamente altamente specifici specifici, specifici ovvero interagiscono con
uno o con pochi substrati e catalizzano soltanto un tipo di
reazione chimica.
I I I cofattori cofattori
cofattori
Alcuni enzimi si associano ad un cofattore cofattore non non proteico proteico, proteico
necessario affinché l’enzima possa svolgere la sua attività. I
cofattori più comuni comprendono ioni metallici come lo Zn2+ o il Fe2+, e molecole molecole organiche note come coenzimi coenzimi, coenzimi
e
derivanti il più delle volta da vitamine (es. il coenzima NAD +
contiene niacina, il FAD contiene riboflavina, e il coenzima A
contiene l’acido pantotenico). L’enzima completo del suo
cofattore si chiama oloenzima oloenzima; oloenzima La sola parte proteica di un
oloenzima si chiama apoenzima apoenzima. apoenzima Mediamente un apoenzima
senza il suo cofattore è privo di attività biologica. Un
coenzima legato saldamente ad un enzima dal quale non si
dissocia si chiama gruppo gruppo gruppo prostetico prostetico. prostetico
La La regolazione
regolazione
L’attività enzimatica può essere regolata, ovvero un enzima
può essere attivato o inibito inibito, inibito in modo che la velocità di
formazione del prodotto risponda alle necessità della cellula.
La La localizzazione localizzazione all’interno all’interno delle delle cellule
cellule
Molti enzimi sono localizzati in specifici organelli cellulari.
Tale compartimentazione è utile per tenere separati i substrati
o i prodotti di reazioni fra loro in competizione. Ciò consente
alle reazioni di avvenire in un ambiente favorevole, e che le
migliaia di enzimi presenti in una cellula siano organizzati in determinate vie biochimiche.
PROPRIETÀ PROPRIETÀ DEGLI DEGLI ENZIMI
ENZIMI
Il meccanismo d’azione degli enzimi può essere trattato secondo 2 punti di vista:
1. 1. Analizzando i cambiamenti cambiamenti cambiamenti energetici energetici che si verificano nel corso di una reazione, visto che un
enzima fornisce una via alternativa e più favorevole sul piano energetico rispetto alla reazione
non catalizzata.
2. 2. 2. Analizzando il modo in cui il sito attivo favorisce la catalasi dal punto di vista chimico chimico.
chimico
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ENZIMI
Cambiamenti Cambiamenti Cambiamenti energetici energetici energetici che che che si si verificano verificano verificano durante durante durante la la la reazione reazione
reazione
Tutte le reazioni chimiche hanno una barriera barriera energetica energetica energetica che separa i reagenti dai prodotti. Tale
barriera, detta energia libera di attivazione attivazione, attivazione
è la differenza fra l’energia dei reagenti e l’energia degli
stadi ad alta energia che si formano nel corso della reazione. Lo stato ad alta energia di una reazione
è detto stato stato di di transizione transizione T* T*. T*
A ⇔ T ⇔
*
1. 1. 1. Energia Energia libe libera libe ra di di attivazione attivazione. attivazione Il picco di energia delle
figura a fianco rappresenta la differenza fra l’energia
libera del reagente e quella di T*, ovvero la stato a più
alta energia durante la conversione del reagente in
prodotto. È proprio a causa dell’elevata energia di
attivazione che le reazioni chimiche non catalizzate da
enzimi procedono spesso con estrema lentezza.
2. 2. 2. Velocità Velocità di di reazione reazione. reazione Le molecole, per reagire, devono
contenere energia sufficiente a superare la barriera
energetica dello stato T*. In mancanza dell’enzima solo
una piccola parte di reagente può possedere energia a
sufficienza per superare tale barriera. La velocità di
reazioni dipende dal numero di molecole di reagente
che possiedono un livello energetico pari q uello dello
stato T*. Tanto più bassa è l’energia libera di
attivazione, tante più molecole sono dotate di energia
sufficiente, e tanto più veloce sarà la reazione.
3. 3. Via Via alternativa alternativa per per per la la la reazione reazione. reazione L’enzima permette ad
una reazione di avvenire rapidamente nelle condizioni
che prevalgono nella cellula, offrendo alla reazione un
percorso alternativo caratterizzato da un’energia energia libera
libera
di di attivazione attivazione più più bassa bassa. bassa L’enzima non modifica
l’energia libera dei reagenti e dei prodotti, per cui non modifica l’equilibro della reazione.
La a chimica chimica del del ssito
s ito attivo
Il sito attivo è una macchina molecolare complessa che impiega una varietà di meccanismi chimici per
facilitare la conversione del substrato in prodotto. L’efficienza di un enzima dipende da svariati
fattori:
1. 1. La La La stabilizzazione stabilizzazione stabilizzazione dello dello stato stato di di ttransizione
t transizione
ransizione. ransizione Spesso il sito attivo agisce come uno stampo
molecolare flessibile che lega il substrato in una struttura geometrica simile allo stato T* della
molecola. La stabilizzazione del substrato nella sua fase di transizione fa sì che aumenti
notevolmente la concentrazione di questo stato reattivo che può convertirsi più agevolmente in
prodotto, accelerando così
la reazione.
2. 2. Altri Altri meccanismi meccanismi. meccanismi Il sito
attivo mette a disposizione
gruppi catalitici che fanno
aumentare la probabilità
della formazione dello
stato T*. in alcuni enzimi
tali gruppi partecipano ad
una catal catalisi catal
si si generale
generale
acido acido-base acido base base, base ove dei residui
B
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6 6 6 GLI GLI ENZIMI ENZIMI
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aminoacidici cedono oppure acquistano dei protoni. In altri enzimi la catalisi procede attraverso la
formazione transitoria di un complesso complesso complesso covalente covalente covalente en enzima en enzima
zima-substrato.
zima substrato.
FATTORI FATTORI FATTORI CHE CHE CHE INFLUENZANO INFLUENZANO INFLUENZANO LA LA LA VELOCITÀ VELOCITÀ VELOCITÀ DI DI DI REAZIONE REAZIONE
REAZIONE
Enzimi diversi rispondono in modo differente a cambiamenti della concentrazione del substrato, della
temperatura e del pH.
La La concentrazione concentrazione del del substrato
substrato
1. 1. La La velocità velocità massima massima. massima La velocità di una reazione (v)
rappresenta il numero di molecole di substrato che si
trasformano in prodotto nell’unità di tempo, e si esprime in
μmol/L mol/L mol/L di di di prodotto prodotto prodotto al al al minuto minuto. minuto
La velocità di reazione
catalizzata da un enzima aumenta all’aumentare della
concentrazione del substrato, fino a raggiungere una
velocità velocità velocità massima massima massima (Vmax max max). max Il livellamento della velocità di
reazione quando la concentrazione del substrato è elevata
riflette la saturazione dei siti attivi disponibili delle molecole
di enzima presenti.
2. 2. 2. L’andamento L’andamento iperbolico della curva curva cinetica dell’enzima dell’enzima. dell’enzima
La
maggior parte degli enzimi segue la cinetica di Michaelis Michaelis- Michaelis
Menten Menten ove il grafico della velocità velocità iniziale iniziale della della reazione reazione (v0) in funzione della concentrazione
del substrato (S) ha un andamento iperbolico simile a quello della curva di dissociazione dell’O2
dalla mioglobina. Al contrario, la curva degli enzimi enzimi allosterici allosterici allosterici è spesso sigmoidale, simile alla
curva di dissociazione dall’O2 dall’emoglobina.
La La temperatura temperatura
temperatura
1. 1. L’aumento L’aumento della della velocità velocità con con la la temperatura temperatura. temperatura La velocità di
reazione aumenta con l’aumentare della temperatura fino a
raggiungere un picco. Tale aumento deriva dall’aumento del
numero di molecole di substrato aventi un’energia
sufficiente a superare la barriera di energia.
2. 2. La La diminuzione diminuzione della della veloci velocità veloci tà a a temperature temperature più più elevate elevate. elevate Un
ulteriore innalzamento della temperatura produce una
diminuzione della velocità di reazione a causa del fatto che,
in queste condizioni, l’enzima è soggetto a denaturazione
denaturazione.
denaturazione
Il Il Il pH
pH
1. 1. L’effetto L’effetto L’effetto del del pH pH sulla sulla ionizzazione ionizzazione del del ssito
s ito attivo attivo. attivo La
concentrazione degli H + influenza la velocità di reazione in
vari modi. Di solito il processo catalitico richiede che
specifici gruppi dell’enzima e del substrato siano in uno
stato ionizzato o non ionizzato affinché avvenga
l’interazione. Ad esempio l’attività catalitica può richiedere
che un gruppo amminico dell’enzima si trovi nella forma
protonata (-NH3 +). A pH alcalino tale gruppo è deprotonato
e la velocità di reazione si abbassa.
2. 2. L’effetto L’effetto L’effetto del del pH pH pH sulla sulla sulla denaturazione denaturazione denaturazione dell’enzima dell’enzima. dell’enzima Valori di
pH estremi possono causare la denaturazione di un enzima.

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ENZIMI
3. 3. 3. Ciascun Ciascun Ciascun enzima enzima enzima ha ha ha un un pH pH pH ottimale ottimale. ottimale ottimale Il pH al quale l’attività di un enzima è massima varia da enzima
ad enzima ed in molti casi rispecchia la [H +] dell’ambiente in cui l’enzima svolge normalmente le
proprie funzioni. Ad esempio, la pepsina, un enzima digestivo dello stomaco, è massimamente
attiva a pH 2, mentre altri enzimi, adatti a lavorare a pH neutro, si denaturerebbero in un
ambiente così acido.
L’EQUAZIONE L’EQUAZIONE DI DI MICHAELIS MICHAELIS-MENTEN
MICHAELIS MENTEN
Un Un Un modell modello modell modello
o di di di reazione reazione
reazione
Michaelis e Menten proposero un modello di reazione che chiarisce molte delle relazioni tipiche delle
reazioni catalizzate da enzimi. L’enzima si combina reversibilmente con il proprio substrato formando
un complesso ES che, successivamente, si scinde liberando il prodotto e rigenerando l’enzima libero.
Il modello assume per definizione che sia coinvolta una sola molecola di substrato, ed è
rappresentato dai seguenti equilibri:
Dove:
S = substrato;
E = enzima;
ES = complesso enzima-substrato;
P = prodotto;
k1, k-1 e k2 = costanti di velocità delle reazioni.
L’equazione L’equazione di di Michaelis Michaelis-Menten
Michaelis Menten
Dove:
V0 = velocità iniziale della reazione;
Vmax = velocità massima;
Km = costante di Michaelis= (K-1+k2)/k1;
[S] = concentrazione del substrato.
k1
k2
E + S ⇔ ES ⎯⎯→
E + P
k −1
V
V
K
Per ricavare l’equazione della velocità di Michaelis-Menten si assume quanto segue:
1. 1. La La La concentrazione concentrazione relativa relativa di di E E e e di di SS.
S La concentrazione del substrato è molto maggiore di quella
dell’enzima [S] >>[E] per cui solo una piccola % di substrato è legata all’enzima.
2. 2. Lo Lo stato stato stazionario stazionario. stazionario Si assume che la [ES] non cambi nel tempo (stato stazionario), ovvero che
la velocità di formazione di ES sia uguale alla velocità di degradazione di ES (in E + S o in E +
P).
3. 3. La La La velocità velocità iniziale iniziale (V (V0). (V Nelle analisi delle reazioni enzimatiche si utilizzano soltanto le velocità
di reazione iniziali (V0), ovvero quelle che si misurano non appena si mescola E con S. in quel
momento la concentrazione del prodotto è molto piccola e quindi la velocità della reazione
inversa è trascurabile.
Importanti Importanti Importanti aspetti aspetti della della cinetica cinetica cinetica di di Michaelis Michaelis-Menten
Michaelis Menten
1. 1. Le Le caratteristiche caratteristiche della della KKm.
K Ogni enzima ha una caratteristica costante di Michaelis Michaelis-Menten
Michaelis
Menten (Km)
rispetto a un particolare substrato. Il valore della Km riflette l’affinità affinità affinità dell’enzima per quel
⋅
m +
= max
0
[ S]
[ S]
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6 6 6 GLI GLI ENZIMI ENZIMI
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substrato. Il valore della Km è pari alla concentrazione concentrazione del del
substrato substrato alla alla quale quale la la velocità velocità della della reazione reazione è è ½ ½ VVmax
V Vmax
max. max La
Km non varia al variare della concentrazione dell’enzima.
a. a. Km piccola piccola. piccola
Una Km bassa riflette un’alta alta affinità
dell’enzima per il substrato, in quanto è necessaria
una piccola piccola concentrazione concentrazione di di substrato substrato per
ottenere l’emistaturazione dell’enzima, ed una
velocità pari a ½ Vmax.
b. Km grande grande. grande
Una Km alta riflette un bass bassa bass
a affinità
affinità
dell’enzima per il substrato, in quanto è necessaria
una concentrazione
concentrazione elevata elevata di di substrato substrato per
ottenere l’emistaturazione dell’enzima, ed una
velocità pari a ½ Vmax.
2. 2. 2. Re Relazione Re lazione fra fra la la velocità velocità e e la la concentrazione concentrazione dell’enzima dell’enzima. dell’enzima
La
velocità di una reazione è direttamente proporzionale alla
concentrazione dell’enzima, indipendentemente dalla
concentrazione del substrato. Ciò in quanto la
concentrazione dell’enzima influisce sia culla V0 che sulla
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Vmax.
3. 3. Ordine Ordine di di reazione reazione. reazione Quando [S] > Km, la velocità di reazione è pressoché
costante e circa uguale a Vmax. In questo caso la velocità di
reazione è indipendente da [S] e diventa di ordine zero
rispetto a [S].
Il Il grafico grafico di di Lineweave Lineweaver-Burk
Lineweave Burk Burke Burk e o dei doppi reciproci
Tracciando il grafico della v0 in funzione di [S] non è sempre
possibile identificare con esattezza quando si raggiunge la Vmax,
in quanto a valori elevati di [S] la curva iperbolica ha una
andamento asintottico. Il grafico grafico di di Lineweawer Lineweawer-Burke
Lineweawer Burke pone 1/V0
in funzione di 1/[S] ed è caratterizzato da una linea retta. Esso
può essere agevolmente utilizzato per calcolare la Km e la Vmax,
e per determinare il meccanismo di azione degli inibitori
enzimatici. L’equazione che descrive la curva di Lineweawer-
Burke è:
1 Km
1
=
+
V V S V
max
[ ] max
dove l’intercetta sull’asse delle x è uguale a -1/Km e l’intercetta
sull’asse delle y è uguale a 1/Vmax.
L’INIBIZIONE L’INIBIZIONE DELL’ATTIVITÀ DELL’ATTIVITÀ ENZIMATICA
ENZIMATICA
0
Qualsiasi sostanza capace di far diminuire la velocità di una reazione catalizzata da un enzima si
definisce inibitore inibitore. inibitore Gli inibitori inibitori reversibili reversibili reversibili si legano agli enzimi mediante legami non covalenti. La
diluizione del complesso enzima-inibitore provoca la dissociazione dell’inibitore legato
reversibilmente e il recupero dell’attività enzimatica. Gli inibitori inibitori non reversibili invece sono

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ENZIMI
caratterizzati dal fatto che l’enzima non riacquista la propria attività in seguito alla diluizione del
complesso enzima inibitore. I 2 tipi principali di inibizione sono l’inibizione inibizione inibizione competitiva competitiva competitiva e l’inibizione inibizione inibizione
non non competitiva competitiva. competitiva
Inibizione Inibizione Inibizione competitiva competitiva
competitiva
Si verifica quando l’inibitore, legandosi reversibilmente al sito attivo dell’enzima normalmente
occupato dal substrato, compete con il substrato per il legame a quel sito.
1. 1. 1. Effetto ffetto sulla sulla VVmax
V Vmax
max. max aumentando la [S] si può attenuare, fino ad annullare l’effetto di un inibitore
competitivo. Ad una [S] sufficientemente elevata la velocità di reazione raggiunge ugualmente la
Vmax, anche in presenza dell’inibitore.
2. 2. Effetto Effetto sulla sulla KKm.
K Un inibitore competitivo comporta un aumento della Km, che in questo caso si
dice Km apparente apparente. apparente
In presenza di un inibitore competitivo è necessaria una [S] maggiore per
raggiungere ½ Vmax.
3. 3. 3. Effetto ffetto ffetto sul sul sul grafico grafico grafico di di di Lineweaver Lineweaver-Burke
Lineweaver Burke Burke. Burke L’inibizione competitiva ha un grafico di Lineweaver-Burke
caratteristico, ove le retta relative alla reazione non inibita e alla reazione inibita intersecano
l’asse delle y in corrispondenza di 1/Vmax (infatti la Vmax resta immutata). Le rette delle reazioni
inibita e non inibita intercettano invece l’asse delle x in punti diversi, in quanto in presenza
dell’inibitore competitivo la Km aumenta.
4. 4. Le statine come esempi di farmaci che agiscono da inibitori inibitori
competitivi competitivi. competitivi I farmaci appartenenti a questo gruppo di agenti
anti nti nti-iperlipi nti iperlipi iperlipidemici iperlipi demici inibiscono in modo competitivo la tappa
di controllo della sintesi del colesterolo. Questa reazione è
catalizzata dalla idrossimetil idrossimetil idrossimetil idrossimetil CoA CoA CoA CoA reduttasi reduttasi reduttasi reduttasi (HMG HMG HMG HMG CoA CoA CoA CoA
reduttasi). reduttasi reduttasi reduttasi Le statine, quali ad esempio la atorvastatina atorvastatina e la
simvastatina simvastatina, simvastatina sono analoghi strutturali del substrato
naturale di questo enzima e si comportano quindi da efficaci
inibitori competitivi della HMG CoA reduttasi, rallentando
così la sintesi del colesterolo e riducendone i livelli
plasmatici.
Inibizione Inibizione non non competitiva
competitiva
Si verifica quando l’inibitore ed il substrato si legano a siti
diversi diversi dell’enzima. Essa è riconoscibile per il suo caratteristico
effetto sulla Vmax. L’inibitore non competitivo può legarsi sia
all’enzima libero, sia al complesso ES, bloccando la reazione.
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6 6 6 GLI GLI ENZIMI ENZIMI
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1. 1. 1. Effetto Effetto Effetto sulla sulla sulla Vmax max max. max L’inibizione non competitiva non può essere annullata aumentando la [S]. Gli
inibitori non competitivi fanno dunque diminuire la Vmax della reazione.
2. 2. 2. Effetto Effetto Effetto sulla sulla sulla KKm.
KK
Gli inibitori non competitivi non interferiscono con il legame fra substrato ed
enzima, e pertanto la Km resta invariata.
3. 3. Effetto ffetto ffetto sul sul sul grafico grafico grafico di di di Lineweaver Lineweaver-Burke
Lineweaver Burke Burke. Burke In presenza dell’inibitore non competitivo la Vmax
diminuisce, mentre la Km resta immutata.
4. 4. Esempi Esempi di di inibitori inibitori non non competitivi competitivi. competitivi Il Piombo Piombo (Pb Pb Pb) Pb forma legami covalenti con i gruppi sulfidrilici
delle catene laterali dei residui di cisteina delle proteine. Il legame dei metalli pesanti esercita
un’inibizione non competitiva. Le ferrochinasi, ferrochinasi ferrochinasi ferrochinasi enzimi che catalizzano l’introduzione del Fe2+ nella protoporfirina (un precursore dell’eme), sono un esempio di enzimi sensibili all’inibizione
da parte del Pb. Alcuni insetticidi devono i loro effetti neurotossici al loro legame irreversibile nel
sito catalitico dell’acetil-colinesterasi.
Gli Gli inibitori inibitori inibitori degli degli enzimi enzimi come come come farmaci
farmaci
Certi β-lattamici, quali la penicillina e l’amoxicillina inibiscono gli enzimi coinvolti nella sintesi della
parete cellulare dei batteri. Alcuni farmaci, come ad esempio gli inibitori dell’enzima che converte
l’angiotensina (ACE), possono anche agire su reazioni extracellulari. Essi abbassano la pressione
sanguigna bloccando l’enzima che scinde l’angiotensina I e forma il potente vasocostrittore
angiotensina II. Questi farmaci, quali ad esempio il captopril ed il lisinopril, provocano una
vasodilatazione ed una conseguente riduzione della pressione sanguigna. [Nota: vedi aspirina e
Viagra].
LA LA REGOLAZIONE REGOLAZIONE DELL’ATTIVITÀ DELL’ATTIVITÀ ENZIMATICA
ENZIMATICA
La regolazione della velocità delle reazioni enzimatiche è fondamentale affinché un organismo possa
coordinare i sui numerosi processi metabolici. La velocità di molti enzimi risponde ai cambiamenti
della concentrazione del substrato, in quanto il livello intracellulare di molti substrati ha valori vicini a
quelli della Km. Alcuni enzimi con specifiche funzioni regolatrici rispondono a modulatori allosterici o a
certe modificazioni covalenti. Anche la velocità di sintesi dell’enzima può essere ritoccata in risposta a
modificazioni delle condizioni fisologiche.
I I siti siti di di legame legame allosterici
allosterici
Gli enzimi allosterici sono regolati da molecole chiamate effettori che si legano in modo non covalente
in un sito diverso dal sito attivo. Tali enzimi sono mediamente formati da più subunità ed i siti
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ENZIMI
regolatori ai quali si legano gli effettori possono trovarsi in una
subunità che non possiede di per sé un’attività catalitica. La presenza
di un effettore allosterico è in grado di modificare l’affinità dell’enzima
per il substrato, l’attività catalitica massima dell’enzima, oppure
entrambe le cose. Gli effettori che inibiscono l’attività di un enzima si
chiamano effettori negativi negativi, negativi
quelli che ne provocano un aumento si
chiamano effettori positivi positivi. positivi
gli enzimi allosterici spesso catalizzano
una reazione limitante una via biochimica, ovvero una tappa che ne
limita la velocità.
1. 1. Effettori Effettori omotropici omotropici. omotropici Quando un substrato è esso stesso un
effettore, si dice che l’effetto è omotropico omotropico. omotropico
Il substrato funge
spesso da effettore positivo, facendo sì che la sua presenza
provochi un aumento dell’attività catalitica degli altri siti di legame
per lo stesso. In tal modo i siti di legame funzionano in modo
cooperativo cooperativo. cooperativo In tali enzimi la relazione fra V0 ed [S] ha una
andamento andamento andamento sigmoidale sigmoidale, sigmoidale sigmoidale in contrasto con la curva iperbolica tipica
degli enzimi che seguono la cinetica di Michaelis-Menten. Gli
effettori positivi e negativi degli enzimi allosterici possono
influenzare la Vmax, la Km, o entrambe.
2. 2. Effettori Effettori Effettori eterotropici eterotropici. eterotropici eterotropici Quando l’effettore è
diverso dal substrato, si dice che l’effetto è
eterotropico eterotropico. eterotropico Molti effettori etero tropici sono
caratterizzati da un effetto retroattivo retroattivo (o a
feedback positivo o negativo). Nella figura a
tergo è presentato un esempio di inibizione
retroattiva, ove l’enzima che converte A in B
possiede un sito allosterico al quale si lega il prodotto finale E. quando [E] aumenta, l’enzima
iniziale della via biochimica viene inibito. L’inibizione retroattiva consente alla cellula di regolare
la quantità di prodotto che le è necessaria, agendo sul flusso delle molecole del substrato lungo
la via biosintetica che porta alla formazione del prodotto. Un esempio è l’enzima
fosfofruttochinasi che risente dell’inibizione allosterica da parte del citrato, che non è un
substrato dell’enzima.
Regolazione Regolazione degli degli enzimi enzimi per per modificazione modificazione covalente
covalente
Molti enzimi possono essere regolati mediante una modificazione covalente, più spesso l’addizione di
gruppi fosfato a specifici residui di serina, treonina o tirosina dell’enzima, oppure la loro
eliminazione. La fosforilazione delle proteine è ritenuta essere una delle principali vie di regolazione
dei processi cellulari.
1. 1. Fosfori Fosforilazione Fosfori lazione e e defosforilazione
defosforilazione. defosforilazione Le reazioni di
fosforilazione delle proteine sono catalizzate da una
famiglia di enzimi chiamati proteina proteina proteina proteina chinasi, chinasi chinasi chinasi che utilizzano
l’ATP come donatore di fosfato. I gruppi fosfato sono invece
allontanati dagli enzimi fosforilati grazie all’azione delle
fosfoproteina fosfoproteina fosfoproteina fosfoproteina fosfatasi. fosfatasi fosfatasi fosfatasi
2. 2. La La La risposta risposta degli degli enzimi enzimi alla alla fosforilazione
fosforilazione. fosforilazione
fosforilazione A seconda dei
casi, la forma fosforilata può essere più o meno attiva
dell’enzima non fosforilato. La fosforilazione della
glicogeno fosforilasi (un enzima che degrada il glicogeno),
ad esempio, ne fa aumentare l’attività, mentre la fosforilazione della glicogeno sinteasi (un
enzima che sintetizza il glicogeno) ne fa diminuire l’attività.
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6 6 6 GLI GLI ENZIMI ENZIMI
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Induzione Induzione Induzione e e e repressione repressione repressione della della della sintesi sintesi degli degli degli enzimi enzimi
enzimi
Le cellule possono regolare la quantità di enzima presente, modificandone la velocità di sintesi.
L’aumento (induzione) o la diminuzione (repressione) della sintesi dell’enzima ne modifica la
popolazione complessiva di siti attivi. Molti enzimi la cui sintesi è soggetta a regolazione sono quelli
necessari soltanto in un determinato stadio dello sviluppo o in particolari condizioni fisiologiche. La
maggiore secrezioni di insulina in risposta all’aumento della glicemia, ad esempio, stimola la sintesi
di alcuni enzimi chiave del metabolismo del glucosio. Gli enzimi utilizzati costantemente non sono
invece in media regolati attraverso la regolazione della velocità della loro sintesi. Le modificazioni del
livello di un enzima derivanti dalla induzione o dalla repressione della sintesi proteica sono lente
(richiedono ore o giorni) in confronto alle modificazioni allosteriche dell’attività enzimatica, che si
verificano nel giro di secondi o minuti.
GLI GLI ENZIMI ENZIMI NELLA NELLA DIAGNOSI DIAGNOSI CLINICA
CLINICA
Gli enzimi plasmatici possono essere classificati in 2 gruppi. Il primo è un piccolo gruppo di enzimi
secreti nel sangue da certe cellule. Il fegato, ad esempio, secerne degli zimogeni (precursori inattivi)
degli enzimi che partecipano alla coagulazione del sangue. Il secondo è un ampio gruppo di specie
enzimatiche liberate dalle cellule durante il loro normale ricambio. Questi enzimi svolgono la loro
funzione all’interno delle cellule e non hanno funzione biologica nel plasma. Negli individui sani il
livello di questi enzimi è pressoché costante e riflette uno stato stazionario ove la velocità di rilascio
nel plasma da parte delle cellule danneggiate è controbilanciata da un’eguale velocità di eliminazione
dell’enzima. La presenza di un’elevata attività enzimatica nel plasma può essere indice di un danno
tissutale, accompagnato da un aumento della liberazione degli enzimi cellulari.
Alterazione Alterazione dei dei dei livelli livelli degli degli enzimi enzimi plasmatici plasmatici negli negli stati stati di di malattia
malattia
Molte malattie che comportano un danno tissutale provocano un aumento della liberazione di enzimi
intracellulari nel plasma. L’attività di tali enzimi è determinata di routine per la diagnosi di malattie
cardiache, epatiche, del muscolo scheletrico e di altri tessuti. Il livello plasmatico di una specifica
attività enzimatica è spesso correlato con l’entità del danno tissutale. Perciò la determinazione
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ENZIMI
dell’aumento di una particolare attività enzimatica nel plasma può essere utile per valutare la
prognosi.
Gli Gli enzimi enzimi plasmatici plasmatici come come strumenti strumenti strumenti diagnostici
diagnostici
L’attività di alcuni enzimi è elevata soltanto in uno o pochi tessuti. L’aumento del livello di tali enzimi
nel plasma riflette dunque un danno al tessuto corrispondente. Ad esempio, l’enzima alanina alanina alanina alanina
amminotransferasi
amminotransferasi amminotransferasi
amminotransferasi (ALT ALT) ALT ALT è abbondante nel fegato. Livelli plasmatici elevati di enzimi distribuiti in
molti tessuti fornisce invece indicazioni meno specifiche sulla localizzazione del danno tissutale,
limitando il valore diagnostico di tali dosaggi enzimatici.
Gli Gli Gli isoenzimi isoenzimi isoenzimi e e e le le le malattie malattie malattie cardiache cardiache
cardiache
Gli isoenzimi isoenzimi (o isozimi isozimi) isozimi sono enzimi diversi che catalizzano la
medesima reazione. Essi non hanno necessariamente le stesse
proprietà fisiche, a causa di differenze nella loro sequenza
aminoacidica. Gli isoenzimi possono perciò essere separati l’uno
dall’altro mediante elettroforesi. Organi diversi spesso contengono
isoenzimi diversi per proporzioni e caratteristiche. Il quadro
isoenzimatico del plasma può quindi servire a identificare il sito del
danno tissutale. Nella diagnosi di infarto del miocardio, ad esempio,
normalmente si determina il livello plasmatico della creatina chinasi
(CK) e della lattato deidrogenasi (LDH).
1. 1. La La struttura struttura quaternaria quaternaria degli degli degli isozimi isozimi. isozimi isozimi Molti isozimi contengono
subinità diverse in varie combinazioni. La CK, ad esempio, si
presenta sottoforma di 3 isozimi. Ciascun isozima è un dimero
composto da 2 polipeptidi, denominati subunità B e subunità M,
associati in una di 3 possibili combinazioni: CK1 = BB, CK2 = MB
e CK3 = MM. Ciascun isozima CK ha una caratteristica mobilità
elettroforetica.
2. 2. Diagnosi Diagnosi di di infarto infarto del del miocardio miocardio. miocardio Il miocardio è l’unico tessuto che
contiene più del 5% dell’attività CK totale sottoforma dell’isozima
CK2 (MB). La comparsa di tale isozima ibrido nel plasma è
praticamente specifica dell’infarto del miocardio. Dopo un infarto
del miocardio acuto, questo isozima compare dalle 4 alle 8 ore
dopo l’insorgere del dolore toracico e raggiunge un picco di
attività dopo 24 ore. Dopo un infarto aumenta anche il livello
plasmatico della LDH, con un picco a 36-40 ore dall’insorgenza
dei sintomi. L’attività LDH ha dunque un valore diagnostico nei
pazienti ricoverati da più di 48 ore dopo l’infarto, quando il livello
plasmatico della CK2 non dà più risultati attendibili.
3. 3. I I markers markers più più recenti recenti dell’infarto dell’infarto del del miocardio miocardio. miocardio La troponina troponina T e la
troponina troponina troponina II
I I sono proteine regolatrici nella contrazione del
miocardio. Esse sono liberate nel plasma in risposta ad un danno
cardiaco. Rispetto al convenzionale dosaggio della CK2, livelli
elevati di troponina nel plasma indicano con maggiore certezza
danni tissutali nell’angina o nell’infarto del miocardio.
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