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SIGILLO INdAGINE SuLLO STATO fITOSANITARIO dELLE PROduzIONI dI VARIETà PRECOCI dI PATATA dA CONSuMO Il PVX è il responsabile del mosaico leggero della patata, è facilmente trasmissibile (prevalentemente per contatto) e causa sintomi la cui severità varia in base alla cultivar colpita. La sintomatologia comprende un mosaico internervale più o meno accentuato, la riduzione delle dimensioni fogliari e l’increspatura dei margini del lembo fino alla necrosi dei tessuti; in alcuni casi il virus si può presentare in forma latente 1. Il PLRV è l’agente dell’accartocciamento fogliare della patata. Le piante infette presentano clorosi diffusa sulle foglie apicali che si ripiegano a doccia verso l’alto, inoltre i tessuti fogliari si ispessiscono assumendo consistenza vetrosa. L’evidenza dei sintomi è fortemente condizionata dalla varietà e dall’epoca di infezione 1. Il virus più diffuso su patata è universalmente il Potato virus Y (PVY), capostipite della famiglia dei Potyvirus 5. Sia in America che in Europa la sua presenza viene monitorata nei programmi di certificazione della patata da seme e le normative sementiere prevedono, per la commercializzazione, la presenza dell’organismo solo entro determinate soglie di tolleranza 5. Il PVY è agente del mosaico nervale della patata. La malattia si manifesta comunemente come una clorosi maculata del lembo fogliare che assume un aspetto ruvido-rugoso. Le nervature vanno incontro a processi necrotici talvolta seguiti anche da necrosi del picciolo e dello stelo 1. Il virus Y è distinto in tre tipologie principali: il PVY O, PVY N e PVY C, caratterizzate dalla diversa sintomatologia che inducono in Nicotiana tabacum 5. Il primo ad essere stato descritto e ritrovato in tutto il mondo è stato il PVY O (ceppo comune) ma successivamente, prima in Europa e poi negli altri continenti, è stato rilevato un nuovo gruppo: il PVY N (ceppo necrotico) 6, 7. All’interno del gruppo PVY N sono stati successivamente identificati ulteriori ceppi, originati dalla ricombinazione genetica del PVY O con il PVY N. La loro classificazione è in continua evoluzione e diversi autori si sono occupati della loro patogenesi 5. Nel nostro lavoro, faremo riferimento alla classificazione utilizzata da Lorenzen 8 che riconosce, oltre ai due gruppi principali (PVY N e PVY O), i sottogruppi PVY N:O (Wilga-type) 9-11, PVY NTN (agente della maculatura ad anelli dei tuberi di patata) 12, NA- PVY N e NA-PVY NTN (isolati nordamericani del PVY N e PVY NTN) 13. Questa classificazione è basata sulle sequenze nucleotidiche e sui punti di ricombinazione del genoma 11. Nel caso del PVY NTN sembrerebbe che una ricombinazione a livello della coat protein 14 sia responsabile della capacità di tali ceppi di determinare la maculatura necrotica; ulteriori studi dimostrano però che non tutti i ceppi NTN presentano tale ricombinazione 15. diversa è la classificazione del PVY basata sul comportamento sierologico. Mediante l’uso di antisieri monoclonali, infatti, è possibile riconoscere solo i tre sierotipi: PVYO, PVYN e PVYC 16. In base alla reazione sierologica, i ceppi Wilga (PVYN:O), inoltre, vengono riconosciuti come sierotipi O anche se si comportano in vivo come ceppi necrotici e gli isolati NTN non vengono distinti dagli N 62 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012 17, 18. un altro importante potyvirus che infetta la patata è il Potato virus V (PVV). Alcuni isolati europei di PVV erano originariamente considerati varianti di isolati di PVY C poiché causavano sintomi necrotici nelle varietà contenenti il gene Nc, gene responsabile della risposta di ipersensibilità di isolati di PVY C in patata. Successivamente fu verificata la presenza, in queste stesse cultivar, del gene Nv, responsabile di una reazione di ipersensibilità specifica nei confronti degli isolati di PVV. Il PVY C e il PVV sono inoltre sierologicamente distinguibili 19. In questo lavoro vengono presentati i risultati di un’indagine eseguita dall’anno 2008 all’anno 2010 al fine di studiare lo stato fitosanitario di tuberi di patata precoce da consumo prodotti nel Sud Italia. La ricerca è stata condotta nell’ambito del progetto “Tipicizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche” finanziato dal Ministero delle Politiche Agricole, Alimentari e forestali. Oggetto dello screening è stata la ricerca di R. solanacearum e PSTVd. Oltre a questi due patogeni da quarantena, sono stati ricercati i più importanti patogeni di qualità presenti su territorio nazionale, dedicando particolare interesse ai virus trasmissibili per tubero-seme: virus X, V e Y della patata e il virus dell’accartocciamento fogliare (PLRV) 5. Nel caso del virus Y, inoltre, è stato eseguito uno studio filogenetico delle varianti genetiche al fine di ricercare anche una eventuale correlazione tra sequenze nucleotidiche e l’origine geografica degli isolati. Materiali e metodi Le analisi sono state eseguite in tre anni successivi, dal 2008 al 2010, su un totale di 119 campioni di
INdAGINE SuLLO STATO fITOSANITARIO dELLE PROduzIONI dI VARIETà PRECOCI dI PATATA dA CONSuMO SIGILLO tuberi di patata da consumo appartenenti alle varietà Agria, Annabel, Arinda, Bellini, Elvira, Inova, Lady Rosetta, Nicola, Safrane, Santè, Sieglinde e Spunta. Il campionamento è stato effettuato in diverse aziende della Campania, della Puglia e della Sicilia per lo svolgimento di un progetto multidisciplinare intitolato “Tipicizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche”. Nell’ultimo anno di sperimentazione sono stati analizzati anche campioni provenienti dall’Egitto e dall’Italia settentrionale. In Tabella I è riportato il numero di campioni studiati, raggruppati per anno e origine geografica. Sui 119 campioni sono state eseguite le analisi per la detection di Ralstonia solanacearum, Potato Spindle Tuber Viroid (PSTVd), PVX, PVV, PVY e PLRV. Per la ricerca di R. solanacearum, le analisi sono state eseguite mediante isolamento dai tessuti prelevati dai tuberi, su substrato semi-selettivo (SMSA). La procedura per la preparazione del campione ha previsto il lavaggio dei tuberi in acqua corrente, il prelievo dei coni ombelicali e la macerazione in un’opportuna quantità di tampone fosfato addizionato di un antiossidante 20, 21. Eventuali colonie sospette isolate sono state purificate su substrato generico NAG (agar nutritivo addizionato di glucosio) e identificate mediante reazione di ipersensibilità in tabacco e analisi PCR. La reazione di PCR è stata eseguita secondo il protocollo di Seal e collaboratori 22. La ricerca del PSTVd è stata eseguita sui tessuti fogliari sviluppatisi in seguito al germogliamento dei tuberi ottenuto in condizioni controllate. Lo screening è stato eseguito mediante ibridazione su membrana (dOT-BLOT) con l’utilizzo di un kit commerciale (Agdia Incorporated, Indiana). L’utilizzo del kit prevede un metodo di estrazione rapido dell’RNA e la detection mediante una sonda marcata con digossigenina. Come per il viroide, le analisi virologiche sono state eseguite su tessuti fogliari sviluppatisi in seguito a germogliamento dei tuberi in serra. Tabella I.
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