tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab

STUDIO DEI METABOLITI SECONDARI DI VARIETà PRECOCI DI SolANUm tUBeroSUm LEPORE
Analisi HPlC-DAD
Le analisi sono state realizzate usando un HPLC-
DAD Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Palo
Alto, CA, USA), costituito da una pompa binaria (G-
1312A), un auto-campionatore (G-1329A), un degassatore
(G-1322A) e un rivelatore a serie di diodi
(1315D). I solventi usati sono il metanolo (ottenuto
da Romil, Cambridge, UK),) per la fase B e l’acqua
milliQ (preparata usando un Millipore, Bedford, MA,
USA). Gli standard sono stati acquistati da Extrasynthese
(Lione, Francia), e Sigma Aldrich (Milano, Italia).
Le analisi sono state effettuate utilizzando una
colonna monolitica Onyx (50x2 mm C18, Phemomenex,
Italia), velocità di flusso utilizzata 0,600 ml/min,
lunghezza d’onda selezionata 280 nm. I campioni
sono stati iniettati in triplicato.
Il gradiente utilizzato è stato: da 0 a 1 min, 100%
di tampone A (H2O + 0,01% acido trifluoroacetico);
da 1 a 6,7 min, 0-30% di tampone B (MeOH Merck);
da 6,7 a 11,7 min, 30-70% di B; da 11,7 a 14,56, 70-
90% di B; da 14,56 a 18, 90% di B, con un post-time
di 4 minuti. L’identificazione dei picchi cromatografici
è stata effettuata mediante analisi di spettrometria
di massa. Gli standard sono stati preparati alla
concentrazione di 0,05 mg/ml. La quantificazione
dei composti fenolici, aminoacidi e acido ascorbico,
è stata effettuata nelle medesime condizioni di
analisi dell’estratto. Sono state costruite le curve di
calibrazione degli standard acido ascorbico, tirosina,
triptofano, acido ferulico, acido caffeico, acido clorogenico,
rutina e quercetina. L’acido neoclorogenico è
stata valutato come equivalente di acido clorogenico.
I derivati dell’acido caffeico (caffeoil spermina, bis-diidrocaffeoil
spermina, tris-diidro caffeoil spermidina)
sono stati studiati come equivalenti di acido caffeico.
Gli standard sono stati preparati a una concentrazione
stock di 10 mg/ml in metanolo, eccetto la tirosina
e triptofano preparate ad una concentazione 10 mg/
ml 0,1 N HCl 7. Sono state effettuate iniettate a diversi
volumi di iniezione (da avere 0,1 µg, 0,5 µg, 1
µg, 1,5 µg, 2 µg, 3 µg). Riportando in grafico le aree
dei picchi cromatografici inn funzione delle rispettive
concentrazioni, è stata ottenuta una curva di calibrazione
con almeno 6 punti per ogni standard, utile per
quantizzare i metaboliti.
Analisi lC-mS
Le analisi LC-MS/MS sono state eseguite con uno
strumento di Q-TOF Premier (Waters, Milford, MA,
USA), dotato di una sorgente electrospray, accoppiato
ad un HPLC Alliance 2695 (Waters).
Il tuning e la calibrazione dello strumento sono state
effettuate utilizzando uno standard puro di Solanina
([M+H] += m/z 869,07). I campioni sono stati sciolti in
1,5 ml di acqua, agitati mediante vortex per 1 minuto
circa, e poi centrifugati per 2 min a 13 rpm. Dalla soluzione
ottenuta, sono stati prelevati 1 ml a cui sono
stati aggiunti 20 µl di angiotensina come standard interno.
Lo standard è stato preparato partendo da una
soluzione standard 8 mg/ml, successivamente diluito
fino ad una concentrazione di 40,8 µg/ml. La separazione
cromatografica è stata condotta iniettando 10 μl
di ciascun campione su una colonna monolitica Onyx
(Phenomenex) (50x2 mm, una velocità di flusso 0.4
ml/min). Il gradiente di eluizione è: 0-1 min buffer A
al 100% (H2O + 10 mM di acido formico, pH 3,5, con
NH4OH), 1-6,7 min 0-30% di buffer B (MeOH), 6,7-
11,7 min 40-70% di buffer B, 11,7-14,56 min 70-100%
di buffer B, 14,56-20 min 100% buffer B. Le analisi
sono state condotte in polarità positiva. La temperatura
della sorgente è stata fissata a 80 ºC, con temperatura
di desolvatazione di 150 ºC. Il capillary voltage
usato era pari a 3 kV e il sampling cone 30 eV. La
collision energy pari a 2, la cell entrance 5, la cell exit
-20. I metaboliti analizzati mediante HPLC sono stati
identificati mediante analisi LC-ESI-MS sia dell’estratto
che di una soluzione multi-standard, contenente
i principali metaboliti caratterizzati. Il multi-standard
è stato preparato a partire dai singoli analiti ad una
concentrazione 100 mg/ml in MeOH. Successivamente
tutte le soluzioni sono state diluite a 0,1 mg/ml. Di
ogni standard diluito a 0,1 mg/ml sono stati prelevati
5 µl e portato a 500 µl finali di acqua.
Mediante LC-MS sono stati identificati e quantizzati
i glicoalcaloidi α-chaconina e α-solanina (metodo
dell’aggiunta standard). I dati sono stati analizzati
attraverso l’uso del software MassLynx 4.1 (Waters).
La quantizzazione è stata ottenuta mediante
la curva di calibrazione, utilizzando come standard
α-chaconina, α-solanina e apigenina. Gli esperimenti
sono stati condotti in triplicato, sono stati iniettati diversi
volumi in modo da ottenere per i glicoalcaloidi
25 ng, 50 ng, 75 ng, 100 ng, 150 ng e 250 ng e per
l’apigenina 0,125 ng, 0,25 ng, 1 ng, 1,5 ng.
Risultati e discussione
Lo studio dei metaboliti secondari di varietà precoci
di Solanum tuberosum L. (solanaceae) è stato
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 45