tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab

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LEPORE STUDIO DEI METABOLITI SECONDARI DI VARIETà PRECOCI DI SolANUm tUBeroSUm sono stati: acido ascorbico, tirosina, caffeoil spermina, triptofano, acido-3-O-caffeoil-5-O-feruloil-chinico, bis-diidrocaffeoil spermina, acido clorogenico e neoclorogenico, ammide dell’acido ferulico, bis e tris-diidro-caffeoil-spermidina, rutina, apigenina, glicoalcaloidi (α-solanina e α-chaconina), kaemferolo- 3-O-rutinoside, quercetina dimetil-etere. I metaboliti più abbondanti nei tuberi di patata precoce sono risultati l’acido clorogenico, e l’acido ascorbico (vitamina C) 6. Di quest’ultimo metabolita la patata precoce risulta più ricca rispetto alla patata comune (30 mg/ kg vs. 15 mg/kg), mentre metaboliti come flavonoidi, derivati poliammidici e triptofano sono risultati presenti in bassissime quantità. L’analisi del contenuto in glicoalcaloidi dei tuberi di patata precoce studiati ha permesso di dimostrare che questi metaboliti sono presenti a concentrazioni molto più basse dei limiti critici. Correlando la provenienza geografica e il contenuto metabolico delle cultivar studiate, è stato possibile dedurre che all’interno della stessa cultivar studiate, coltivata in regioni differenti, le differenze nel tenore di metaboliti secondari sono significative. Materiali e metodi materiale vegetale Sono stati analizzati tuberi di patata precoce delle cultivar Arinda, Sieglinde, Spunta prelevati da differenti zone di coltivazione nelle regioni Puglia e Sicilia (Tabella I). estrazione L’estrazione è stata effettuata secondo il metodo riportato da Shakya et al. (2006) 1-12. I tuberi sono stati lavati con acqua deionizzata senza asportarne la buccia, asciugati e tagliati longitudinalmente in otto parti uguali scartando le due estremità. In seguito sono stati ridotti in cubetti e, per evitare reazioni di degradazione enzimatica, sono stati immediatamente congelati in azoto liquido e liofilizzati. Solo dopo la completa disidratazione, il campione è stato ridotto in polvere fine mediante l’uso di un omogeneizzatore. I campioni polverizzati sono stati conservati a -20 °C, al buio, fino all’uso. Sono stati pesati 400 mg di liofilizzato e messi in eppendorf da 2 ml con 0,9 ml di buffer di (50% v/v di MeOH, 50% v/v di H 2O, con 2,5% di acido metafosforico e 1 mM di EDTA). Le eppendorf contenenti il campione disperso nel buffer di estrazione sono state agitate con vortex per 1 minuto circa, sottoposte a sonicazione per 15 minuti, a bassa temperatura e alla massima potenza disponibile. Dopo la sonicazione, le eppendorf sono state nuovamente agitate con vortex per 1 minuto circa, poi centrifugate per 7 minuti, a 4 ºC, a 13000 rpm. Il surnatante è stato prelevato e trasferito in altre eppendorf. Il pellet rimanente è stato riestratto con 0,6 ml del buffer di estrazione, sonicato e centrifugato. Della soluzione dei due surnatanti sono stati prelevati 200 µl, congelati a -80 ºC per 15 minuti e seccati in Speed Vac (Eppendorf, Amburgo, Germania) a temperatura ambiente, per due ore. Tabella I. — Siti di campionamento delle differenti aree di coltivazione nelle regioni Puglia e Sicilia. Campione Sigla Siti di campionamento Data raccolta Arinda (Sicilia) 09-AR-S-A1-3 Torre Milocca (SR) 2009 Arinda (Sicilia) 09-AR-S-E1-3 Carruba-Riposto (CT) 21/05/2009 Arinda (Sicilia) 09-AR-S-G1-3 Giardinaccio-Montef. S. Giorgio (ME) 22/05/2009 Sieglinde (Puglia) 09-SG-P-C1-3 Cisternella (LE) 25/05/2009 Sieglinde (Puglia) 09-SG-P-D1-3 San Ferdinando (BAT) 26/05/2009 Sieglinde (Puglia) 09-SG-P-C-COM Puglia 2009 Sieglinde (Sicilia) 09-SG-S-F2-3 Scala- Torregrotta (ME) 22/05/2009 Sieglinde (Sicilia) 09-SG-S-I-GIARRE Giarre (CT) 2009 Sieglinde (Sicilia) 09-SG-S-L-ISPICA Ispica (RG) 2009 Sieglinde (Sicilia) 09-SG-S-H-MARSALA Marsala (TP) 2009 Spunta (Puglia) 09-SP-P-A1-3 Chianchi (LE) 25/05/2009 Spunta (Puglia) 09-SP-P-I1-3 Mola di Bari-Cozze (BA) 2009 Spunta (Puglia) 09-SP-S-B1-3 Cassibile (SR) 21/05/2009 Spunta (Puglia) 09-SP-S-C1-3 Acireale-Scura (CT) 21/05/2009 44 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
STUDIO DEI METABOLITI SECONDARI DI VARIETà PRECOCI DI SolANUm tUBeroSUm LEPORE Analisi HPlC-DAD Le analisi sono state realizzate usando un HPLC- DAD Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), costituito da una pompa binaria (G- 1312A), un auto-campionatore (G-1329A), un degassatore (G-1322A) e un rivelatore a serie di diodi (1315D). I solventi usati sono il metanolo (ottenuto da Romil, Cambridge, UK),) per la fase B e l’acqua milliQ (preparata usando un Millipore, Bedford, MA, USA). Gli standard sono stati acquistati da Extrasynthese (Lione, Francia), e Sigma Aldrich (Milano, Italia). Le analisi sono state effettuate utilizzando una colonna monolitica Onyx (50x2 mm C18, Phemomenex, Italia), velocità di flusso utilizzata 0,600 ml/min, lunghezza d’onda selezionata 280 nm. I campioni sono stati iniettati in triplicato. Il gradiente utilizzato è stato: da 0 a 1 min, 100% di tampone A (H2O + 0,01% acido trifluoroacetico); da 1 a 6,7 min, 0-30% di tampone B (MeOH Merck); da 6,7 a 11,7 min, 30-70% di B; da 11,7 a 14,56, 70- 90% di B; da 14,56 a 18, 90% di B, con un post-time di 4 minuti. L’identificazione dei picchi cromatografici è stata effettuata mediante analisi di spettrometria di massa. Gli standard sono stati preparati alla concentrazione di 0,05 mg/ml. La quantificazione dei composti fenolici, aminoacidi e acido ascorbico, è stata effettuata nelle medesime condizioni di analisi dell’estratto. Sono state costruite le curve di calibrazione degli standard acido ascorbico, tirosina, triptofano, acido ferulico, acido caffeico, acido clorogenico, rutina e quercetina. L’acido neoclorogenico è stata valutato come equivalente di acido clorogenico. I derivati dell’acido caffeico (caffeoil spermina, bis-diidrocaffeoil spermina, tris-diidro caffeoil spermidina) sono stati studiati come equivalenti di acido caffeico. Gli standard sono stati preparati a una concentrazione stock di 10 mg/ml in metanolo, eccetto la tirosina e triptofano preparate ad una concentazione 10 mg/ ml 0,1 N HCl 7. Sono state effettuate iniettate a diversi volumi di iniezione (da avere 0,1 µg, 0,5 µg, 1 µg, 1,5 µg, 2 µg, 3 µg). Riportando in grafico le aree dei picchi cromatografici inn funzione delle rispettive concentrazioni, è stata ottenuta una curva di calibrazione con almeno 6 punti per ogni standard, utile per quantizzare i metaboliti. Analisi lC-mS Le analisi LC-MS/MS sono state eseguite con uno strumento di Q-TOF Premier (Waters, Milford, MA, USA), dotato di una sorgente electrospray, accoppiato ad un HPLC Alliance 2695 (Waters). Il tuning e la calibrazione dello strumento sono state effettuate utilizzando uno standard puro di Solanina ([M+H] += m/z 869,07). I campioni sono stati sciolti in 1,5 ml di acqua, agitati mediante vortex per 1 minuto circa, e poi centrifugati per 2 min a 13 rpm. Dalla soluzione ottenuta, sono stati prelevati 1 ml a cui sono stati aggiunti 20 µl di angiotensina come standard interno. Lo standard è stato preparato partendo da una soluzione standard 8 mg/ml, successivamente diluito fino ad una concentrazione di 40,8 µg/ml. La separazione cromatografica è stata condotta iniettando 10 μl di ciascun campione su una colonna monolitica Onyx (Phenomenex) (50x2 mm, una velocità di flusso 0.4 ml/min). Il gradiente di eluizione è: 0-1 min buffer A al 100% (H2O + 10 mM di acido formico, pH 3,5, con NH4OH), 1-6,7 min 0-30% di buffer B (MeOH), 6,7- 11,7 min 40-70% di buffer B, 11,7-14,56 min 70-100% di buffer B, 14,56-20 min 100% buffer B. Le analisi sono state condotte in polarità positiva. La temperatura della sorgente è stata fissata a 80 ºC, con temperatura di desolvatazione di 150 ºC. Il capillary voltage usato era pari a 3 kV e il sampling cone 30 eV. La collision energy pari a 2, la cell entrance 5, la cell exit -20. I metaboliti analizzati mediante HPLC sono stati identificati mediante analisi LC-ESI-MS sia dell’estratto che di una soluzione multi-standard, contenente i principali metaboliti caratterizzati. Il multi-standard è stato preparato a partire dai singoli analiti ad una concentrazione 100 mg/ml in MeOH. Successivamente tutte le soluzioni sono state diluite a 0,1 mg/ml. Di ogni standard diluito a 0,1 mg/ml sono stati prelevati 5 µl e portato a 500 µl finali di acqua. Mediante LC-MS sono stati identificati e quantizzati i glicoalcaloidi α-chaconina e α-solanina (metodo dell’aggiunta standard). I dati sono stati analizzati attraverso l’uso del software MassLynx 4.1 (Waters). La quantizzazione è stata ottenuta mediante la curva di calibrazione, utilizzando come standard α-chaconina, α-solanina e apigenina. Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato, sono stati iniettati diversi volumi in modo da ottenere per i glicoalcaloidi 25 ng, 50 ng, 75 ng, 100 ng, 150 ng e 250 ng e per l’apigenina 0,125 ng, 0,25 ng, 1 ng, 1,5 ng. Risultati e discussione Lo studio dei metaboliti secondari di varietà precoci di Solanum tuberosum L. (solanaceae) è stato Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 45
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