tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab

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SCELZA LA PROTEOMICA tampone riducente SDS, sono state separate su gel al 10% di poliacrilammide secondo il metodo Laemmli 8. Dopodiché è stata eseguita l’analisi 2-D. L’isoelettrofocalizzazione (IEF) è stata effettuata utilizzando IPG strip di 17 cm, pH 4-7 (Bio-Rad) sulle quali sono stati caricati circa 500 µg di proteine. Dopo la reidratazione attiva delle strip a 50 V per 12 h, la focalizzazione è stata eseguita mediante una PROTEAN ® IEF Cell, (Bio-Rad) utilizzando le seguenti condizioni: da 0 a 500 V in 1 h, da 500 a 1000 V in 8 h, da 1000 a 5000 V in 3 h, da 5000 a 10000 V fino ad un massimo di 60000 V/h. Prima kD 250 150 100 75 50 37 St CN P1 P2 P3 25 20 Volume caricato: 20 μL Campione: Agria (AG-C A 1) S1 S2 Acrilammide 10% St = standard molecolari CN = controllo negativo P1 = Estr. fenolica rep. 1 P2 = Estr. fenolica rep. 2 P3 = Estr. fenolica rep. 3 S1 = Estr. con SDS rep. 1 S2 = Estr. con SDS rep. 2 S3 = Estr. con SDS rep. 3 Figura 2. — Gel SDS-PAGE degli estratti proteici della cv Agria, ottenuti con i diversi metodi di estrazione. Protein (mg·g -1 ) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Agria Agria Spunta Spunta S3 Antea Antea Figura 4. — Contenuto proteico delle cv di patata raccolte nelle tre Regioni italiane. Antea Arinda Arinda Arinda della seconda dimensione le strip sono stare equilibrate per 15 minuti in 3 ml di tampone di equilibrazione (urea 6 M, SDS 2%, Tris-HCl 0,375 M pH 8,8, glicerolo 20%) contenente DTT 130 mM e successivamente per 15 minuti in 3 ml di tampone di equilibrazione contenente 135 mM iodoacetammide. Per la seconda dimensione sono stati preparati gel al 12% di poliacrilammide. La seconda dimensione è stata realizzata a 12 mA/gel per 30 minuti e 24 mA/ gel per 6 h mediante una PROTEAN ® II XL Multi- Cells, (Bio-Rad). La scansione dei gel, colorati con Coomassie colloidale G-250 9, è stata eseguita mediante den- Figura 3. — Gel SDS-PAGE preparati con diversi volumi degli estratti proteici della cv Agria, ottenuti con i diversi metodi di estrazione. 38 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 20125 kD 250 150 100 75 50 37 25 20 St CN P1 S1 P1 S1 P1 S1 P1 S1 Volume caricato: 2.5 μL 5 μL 10 μL 15 μL Campione: Agria (AG-C A 1) Sieglinde Sieglinde Sieglinde Sieglinde Spunta Spunta Elvira Elvira Acrilammide 10% St = standard molecolari CN = controllo negativo P1 = Estr. fenolica S1 = Estr. con SDS Campagnia Sicilia Puglia Sieglinde Sieglinde Sieglinde
LA PROTEOMICA SCELZA sitometro GS-800 (Bio-Rad) e l’acquisizione delle immagini è stata realizzata utilizzando il software PDQuest (Bio-Rad). Le corse elettroforetiche mono- e bi-dimensionali sono stati eseguite in duplicato. Risultati Confronto dei metodi di estrazione I metodi di estrazione proteica basati, rispettivamente, sull’uso di fenolo e di SDS sono stati testati sulla cv Agria. Per verificare l’efficienza estrattiva dei due metodi messi a confronto, i campioni ottenuti dalle due diverse estrazioni sono stati sottoposti ad analisi elettroforetica monodimensionale SDS-PAGE. Dai risultati ottenuti è emerso che nel campione di tubero erano presenti proteine di diverso peso molecolare e che il metodo basato sull’uso di fenolo è risultato più efficiente (Figura 2). In particolare quest’ultimo ha mostrato una maggiore efficienza nell’estrazione di proteine ad alto peso molecolare (75 e 100 kD), mentre quello basato sull’utilizzo di SDS è risultato più efficiente per le proteine a più basso peso molecolare (
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