tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab
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SCELZA LA PROTEOMICA<br />
tampone riducente SDS, sono state separate su gel<br />
al 10% <strong>di</strong> poliacrilammide secondo il metodo Laemmli<br />
8.<br />
Dopo<strong>di</strong>ché è stata eseguita l’analisi 2-D. L’isoelettrofocalizzazione<br />
(IEF) è stata effettuata utilizzando<br />
IPG strip <strong>di</strong> 17 cm, pH 4-7 (Bio-Rad) sulle<br />
quali sono stati caricati circa 500 µg <strong>di</strong> proteine.<br />
Dopo la reidratazione attiva delle strip a 50 V per<br />
12 h, la focalizzazione è stata eseguita me<strong>di</strong>ante<br />
una PROTEAN ® IEF Cell, (Bio-Rad) utilizzando le<br />
seguenti con<strong>di</strong>zioni: da 0 a 500 V in 1 h, da 500 a<br />
1000 V in 8 h, da 1000 a 5000 V in 3 h, da 5000 a<br />
10000 V fino ad un massimo <strong>di</strong> 60000 V/h. Prima<br />
kD<br />
250<br />
150<br />
100<br />
75<br />
50<br />
37<br />
St<br />
CN<br />
P1<br />
P2<br />
P3<br />
25<br />
20<br />
Volume caricato: 20 μL<br />
Campione: Agria (AG-C A 1)<br />
S1<br />
S2<br />
Acrilammide 10%<br />
St = standard molecolari<br />
CN = controllo negativo<br />
P1 = Estr. fenolica rep. 1<br />
P2 = Estr. fenolica rep. 2<br />
P3 = Estr. fenolica rep. 3<br />
S1 = Estr. con SDS rep. 1<br />
S2 = Estr. con SDS rep. 2<br />
S3 = Estr. con SDS rep. 3<br />
Figura 2. — Gel SDS-PAGE degli estratti proteici della cv Agria,<br />
ottenuti con i <strong>di</strong>versi meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> estrazione.<br />
Protein (mg·g -1 )<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
Agria<br />
Agria<br />
Spunta<br />
Spunta<br />
S3<br />
Antea<br />
Antea<br />
Figura 4. — Contenuto proteico delle cv <strong>di</strong> <strong>patata</strong> raccolte nelle tre Regioni italiane.<br />
Antea<br />
Arinda<br />
Arinda<br />
Arinda<br />
della seconda <strong>di</strong>mensione le strip sono stare equilibrate<br />
per 15 minuti in 3 ml <strong>di</strong> tampone <strong>di</strong> equilibrazione<br />
(urea 6 M, SDS 2%, Tris-HCl 0,375 M pH 8,8,<br />
glicerolo 20%) contenente DTT 130 mM e successivamente<br />
per 15 minuti in 3 ml <strong>di</strong> tampone <strong>di</strong> equilibrazione<br />
contenente 135 mM iodoacetammide. Per<br />
la seconda <strong>di</strong>mensione sono stati preparati gel al<br />
12% <strong>di</strong> poliacrilammide. La seconda <strong>di</strong>mensione è<br />
stata realizzata a 12 mA/gel per 30 minuti e 24 mA/<br />
gel per 6 h me<strong>di</strong>ante una PROTEAN ® II XL Multi-<br />
Cells, (Bio-Rad).<br />
La scansione dei gel, colorati con Coomassie<br />
colloidale G-250 9, è stata eseguita me<strong>di</strong>ante den-<br />
Figura 3. — Gel SDS-PAGE preparati con <strong>di</strong>versi volumi degli<br />
estratti proteici della cv Agria, ottenuti con i <strong>di</strong>versi meto<strong>di</strong> <strong>di</strong><br />
estrazione.<br />
38 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 20125<br />
kD<br />
250<br />
150<br />
100<br />
75<br />
50<br />
37<br />
25<br />
20<br />
St<br />
CN<br />
P1<br />
S1 P1 S1 P1 S1 P1 S1<br />
Volume caricato: 2.5 μL 5 μL 10 μL 15 μL<br />
Campione: Agria (AG-C A 1)<br />
Sieglinde<br />
Sieglinde<br />
Sieglinde<br />
Sieglinde<br />
Spunta<br />
Spunta<br />
Elvira<br />
Elvira<br />
Acrilammide 10%<br />
St = standard molecolari<br />
CN = controllo negativo<br />
P1 = Estr. fenolica<br />
S1 = Estr. con SDS<br />
Campagnia Sicilia Puglia<br />
Sieglinde<br />
Sieglinde<br />
Sieglinde
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