tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab

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SCELZA LA PROTEOMICA La composizione nutrizionale degli alimenti può essere influenzata dalla diversità dei territori, per cui il prodotto tradizionale tipizzato assume un ruolo fondamentale per la sostenibilità salutistica e sanitaria, sia per l’uomo che per l’animale, nonché per il territorio stesso, con riflessi positivi anche sulla sostenibilità economica. Inoltre, la tipizzazione in campo alimentare è uno degli aspetti di maggior rilievo nell’ambito della prevenzione delle frodi, della sicurezza e della valorizzazione degli alimenti 2. La proteomica rappresenta dunque un prezioso strumento per la caratterizzazione alimentare di uno specifico territorio. È, infatti, possibile ottenere delle vere e proprie impronte (fingerprinting) di mappe bidimensionali polipeptidiche dei prodotti tradizionali tipizzati, che vengono poi registrate come immagini in banche dati e che possono essere utilizzate, nelle analisi di tracciabilità, per verificare la presenza di alcuni parametri di tipicità e di salubrità nel prodotto in esame 3. Tra i prodotti dell’agricoltura italiana la patata riveste un ruolo molto importante, soprattutto per quel che riguarda la produzione extrastagionale 4-6. Le condizioni climatiche di alcune aree costiere dell’Italia meridionale (Campania, Sicilia e Puglia) e la nota capacità di adattamento della patata a condizioni non ottimali di temperatura, radiazione solare e fotoperiodo, permettono di realizzare due cicli di coltivazione extrastagionali: uno autunno-vernino-primaverile e l’altro estivo-autunno-vernino, temporalmente differenti da quello ordinario primaverile-estivo. Con il primo ciclo si ottiene la classica e affermata produzione precoce (denominata anche primaticcia o novella), realizzata tra marzo e giugno. Con il ciclo estivoautunnale si realizza, invece, la produzione invernale o di secondo raccolto o bisestile, che in questi anni ha visto aumentare la propria importanza relativa, in virtù soprattutto della favorevole e interessante dislocazione temporale delle raccolte, che consente la commercializzazione della patata durante tutto l’anno. Le patate extrastagionali sono molto apprezzate dai consumatori nazionali e nord-europei, anche se, talvolta, tale produzione è contaminata da materiale proveniente dal nord Africa o da Cipro, da zone quindi che non sono quelle tipiche della produzione di patata extrastagionale e che non sono sottoposte ad appropriati controlli di qualità e sicurezza. Pertanto, lo scopo del presente lavoro è la caratterizzazione proteomica di alcune varietà di patate extrastagionali (Spunta, Arinda, Antea, Agria, Agata, Sieglinde) provenienti dal sud Italia, in particolare da Campania, Puglia e Sicilia, al fine di identificare eventuali marcatori proteici legati al luogo di provenienza del prodotto. Materiali e metodi Preparazione del campione Dopo la raccolta, un campione di 500 g di tuberi è stato prelevato in maniera casuale, eliminando quelli con evidenti attacchi fitopatologici. I tuberi selezionati sono stati lavati prima in acqua corrente per eliminare tracce di suolo, poi in acqua deionizzata, e quindi asciugati con carta assorbente. Ciascun tubero è stato tagliato ortogonalmente rispetto alla sua lunghezza maggiore in otto sezioni, di cui sono state scartate le due sezioni apicali 7. Le sei sezioni più interne sono state poi rapidamente tagliate in cubetti e questi ultimi mescolati con quelli provenienti da altri tuberi dello stesso campione, sottoposti allo stesso trattamento (Figura 1). Sono stati prelevati 200 g di cubetti e subito congelati per immersione in azoto liquido fino al raggiungimento dell’equilibrio termico. I campioni sono stati poi trasferiti e conservati temporaneamente a -80 °C, liofilizzati, e infine ridotti in polvere con un blender in acciaio e conservati a -20 °C. Estrazione della frazione proteica I tuberi liofilizzati sono stati sottoposti a prove di estrazione della frazione proteica al fine di individuare una procedura che risultasse efficace nella visualizzazione del loro intero corredo proteico. Per l’analisi 2-D la preparazione del campione rappresenta un fattore critico, soprattutto nel caso di tessuti vegetali dove si riscontra un basso rapporto quantità di proteine/volume di estrazione e un’alta concentrazione di sostanze interferenti quali pigmenti, enzimi proteolitici, carboidrati, ecc. Sono stati selezionati due metodi tra quelli maggiormente riportati in letteratura in cui era previsto l’impiego di fenolo o di sodio dodecilsolfato (SDS) 3. Per quanto riguarda il metodo di estrazione con fenolo, il tubero liofilizzato (0,25 g) è stato omogeneizzato con 4 ml di tampone di estrazione (sac- 36 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 20125
LA PROTEOMICA SCELZA Figura 1. — Preparazione dei tuberi. carosio 0,7 M, EDTA 50 mM, KCl 0,1 M, tiourea 10 mM, TRIS 0,5 M, PMSF 2 mM, DTT 50 mM) e incubato per 10 minuti in ghiaccio. L’omogenato è stato poi centrifugato (15 min a 13000 g e 4 °C) e il surnatante è stato sottoposto a una nuova estrazione con 5 ml di una soluzione di fenolo tamponata a pH 8 mediante agitazione a 1800 rpm per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione (10 minuti a 6000 g), un’ulteriore estrazione è stata eseguita sulla fase fenolica con 5 ml del tampone di estrazione mediante agitazione a 1800 rpm per 10 minuti e centrifugazione nuovamente come già descritto. Il tampone è stato rimosso e la precipitazione delle proteine contenute nella fase fenolica è stata ottenuta mediante aggiunta di 20 ml di acetato di ammonio in metanolo 0,1 M, con tempo di reazione di 16 ore a -20 °C e centrifugazione a 20000 g per 20 minuti a 4 °C. Il precipitato è stato lavato due volte con 4 ml di una soluzione fredda di ammonio acetato in metanolo 0,1 M e una volta con una soluzione fredda di ditiotreitolo (DTT) 10 mM in acetone. Il pellet così lavato è stato essiccato all’aria per 30 minuti a temperatura ambiente e poi solubilizzato in 1 ml di tampone di reidratazione (urea 5 M, tiourea 2M, CHAPS 2% p/v, C 7BzO 2% p/v, DTT 20 mM, TCEP- HCl 5 mM) per le analisi successive. La procedura prevista nel metodo di estrazione con SDS è pressoché simile: il tubero liofilizzato (0,25 g) è stato miscelato ed incubato a 65 °C per 10 minuti con 2 ml di tampone di lisi (SDS 4% p/v, saccarosio 5% p/v, polivinilpirrolidone (PVP) 10% p/v, DTT 0,3% p/v, fosfato di sodio 20 mM a pH 7). L’omogenato è stato raffreddato per 15 minuti in ghiaccio prima della centrifugazione (15 minuti a 15000 g e 4 °C). Il surnatante è stato centrifugato una seconda volta prima della precipitazione ottenuta mediante l’aggiunta di 8 ml di una soluzione fredda di 10 mM DTT in acetone, con tempo di reazione di 16 ore, e della successiva centrifugazione a 20000 g per 20 minuti a 4 °C. Il precipitato proteico è stato lavato 2 volte con DTT 10 mM in acetone e poi essiccato all’aria per 30 minuti a temperatura ambiente prima di essere solubilizzato in 1 ml di tampone di reidratazione per le analisi successive. Determinazione della concentrazione proteica La concentrazione proteica è stata valutata mediante il 2-D Quant Kit (GE Healthcare) utilizzando una soluzione di sieroalbumina 2 mg ml-1 per la costruzione della retta di taratura. Le analisi sono state eseguite in triplicato. Analisi elettroforetica Gli estratti proteici sono stati sottoposti dapprima ad elettroforesi monodimensionale SDS-PAGE per verificare l’avvenuta estrazione. Le proteine presenti nel campione, precedentemente solubilizzato in Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 37
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