tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab

PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO
La verifica della commutabilità del metodo che
utilizza il calibratore plasmidico è stata realizzata
effettuando esperimenti di quantificazione di campioni
a percentuale nota di EH92-527-1. I dati riportati
in Tabella III indicano che nell’ambito del range
considerato si evidenziano significative deviazioni
del contenuto percentuale di OGM rispetto al valore
atteso, accompagnati da una RSD superiore al
25%. È stato calcolato un fattore di calibrazione 12
che indica la variazione del valore misurato rispetto
a quello noto. Anche in questo caso la RSD mostra
valori superiori al 25%.
I risultati di commutabilità contrastano quindi con
i dati di efficienza, R 2, LOD e range dinamico. Le discrepanze
osservate possono essere dovute ad errori
di accuratezza nella preparazione dei campioni a
percentuale nota di EH52-927-1. La preparazione di
campioni a percentuali note è inevitabile in quanto
la farina a concentrazione nota di riferimento da cui
essi sono ottenuti è disponibile in commercio solo
alla percentuale del 100%.
La strategia attuata per il rilevamento di OGM
è basata su uno screening iniziale per le due più
comuni sequenze di regolazione (promotore 35S e
terminatore Nos) associato all’amplificazione di sequenze
specie-specifiche per mais e soia. Infine, sulla
base dei risultati di screening, la strategia prevede
amplificazioni costrutto e/o evento specifiche per
identificare e quantificare la soia Roundup Ready
(RRS) ed il mais Bt11. Come già accennato abbiamo
applicato a tutte le fasi della strategia di rilevamento
una procedura di preamplificazione basata sull’utilizzo
del reagente TaqMan ® PreAmp Master Mix
(Applied Biosystems) e di una miscela di coppie di
primer e sonde specifiche per i marcatori da analizzare.
In questo contesto la tecnologia di preamplificazione
ha aumentato la sensibilità della reazione di
amplificazione in PCR Real time.
L’efficienza della PCR deve essere valutata per eseguire
una determinazione quantitativa attendibile del
contenuto di OGM 16. La riduzione dell’efficienza di
amplificazione di tRNA leu nei campioni preamplificati
rispetto ai non preamplificati potrebbe essere legata
ad una possibile interazione dei primer all’interno
della pooled mix utilizzata nella reazione di preamplificazione.
Una spiegazione alternativa è stata fornita
da Coudry e collaboratori (dati non pubblicati) che
hanno evidenziato una riduzione dell’amplificazione
dei geni altamente espressi in campioni di cDNA preamplificati.
e questo potrebbe essere vero anche per
geni ad alto numero di copie come tRNA leu.
Conclusioni
I vantaggi offerti dall’uso di calibratori plasmidici
sono molteplici e testimoniati da diversi lavori
presenti in letteratura. In particolare, accanto
alla quantità illimitata di tali molecole che si può
ottenere, esse offrono la possibilità di effettuare
un’analisi quantitativa anche nei casi in cui non
siano disponibili i calibratori certificati dall’IRMM.
La loro realizzazione e soprattutto la loro applicazione
alla quantificazione di OGM in DNA estratto
da matrici alimentare presenta, però, non poche
difficoltà.
I dati ottenuti in questo lavoro dimostrano che i
risultati di quantificazione ottenuti con un calibratore
plasmidico non risultano sempre commutabili
con quelli ottenuti con l’uso di un calibratore a
DNA genomico, anche se nell’ambito dei Minimum
Performance Requirements diversi parametri, quali
efficienza, R 2 e LOD vengono soddisfatti.
La tecnologia di preamplificazione ha aumentato
la sensibilità della reazione di amplificazione in PCR
Real time, risultando utile in particolare per i target
presenti in basso numero di copie aumentando inoltre
il numero di target analizzabili in DNA estratti da
alimenti lavorati.
I risultati ottenuti con la reazione di preamplificazione
indicano che essa non influisce sull’affidabilità
del dato quantitativo, suggerendo che tale strategia
possa trovare interessanti applicazioni in tutti quei
campi che richiedono analisi quantitative mediante
PCR Real time.
Riassunto
La rilevazione e la quantificazione degli organismi geneticamente
modificati (OGM) negli alimenti viene effettuata mediante
la Reazione a Catena della Polimerasi in Tempo reale
(PCR Real time). L’impiego di tale tecnica è condizionata da
due fattori critici: la scelta di calibratori adeguati e un DNA
di qualità e quantità adeguate. In questo lavoro sono descritti
esperimenti relativi all’applicabilità di un calibratore plasmidico
come standard per la determinazione quantitativa della
patata EH92-527-1. Inoltre, vengono presentati risultati ottenuti
applicando la tecnica di preamplificazione al DNA estratto
da alimenti lavorati per migliorare la sensibilità della PCR real
time ed aumentare il numero di target analizzabili.
Parole chiave: Reazione a catena della polimerasi in tempo
reale - DNA, recombinant - Organismi geneticamente modificati.
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 33