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CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE tabElla vi. — Risultati dell’analisi quantitativa condotta su DNA estratto da prodotti lavorati, materiali di riferimento certificati (IRMM) e provenienti da proficiency test (FAPAS). I risultati sono espressi come percentuale di OGM±deviazione standard e coefficiente di variazione (%). Il valore del limite di quantificazione (LOQ) per il mais Bt11 e la soia RR è, rispettivamente, pari a 0.07% e 0.05%. OGM Matrice DNA preamplificato mais Bt11 Polenta 0,12±0,02 19,32 0,1% mais Bt11 (IRMM) 0,07±0,01 12,13 1% mais Bt11 (IRMM) 0,66±0,20 30,29 FAPAS GeMSU09A (farina di mais + Bt11) 1,42±0,36 25,26 quantificazione di EH92-527-1 nei prodotti alimentari sono stati valutati i requisiti minimi, Minimum Performance Requirements, che un buon metodo analitico per la rivelazione di OGM basato sulla PCR Real time deve soddisfare 15. Essi comprendono diversi aspetti tra i quali: — la specificità (il metodo deve essere eventospecifico); — l’efficienza di amplificazione (il coefficiente angolare della retta di taratura o slope, proporzionale all’efficienza di amplificazione, deve essere compreso nel seguente intervallo di valori: -3.1
PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO La verifica della commutabilità del metodo che utilizza il calibratore plasmidico è stata realizzata effettuando esperimenti di quantificazione di campioni a percentuale nota di EH92-527-1. I dati riportati in Tabella III indicano che nell’ambito del range considerato si evidenziano significative deviazioni del contenuto percentuale di OGM rispetto al valore atteso, accompagnati da una RSD superiore al 25%. È stato calcolato un fattore di calibrazione 12 che indica la variazione del valore misurato rispetto a quello noto. Anche in questo caso la RSD mostra valori superiori al 25%. I risultati di commutabilità contrastano quindi con i dati di efficienza, R 2, LOD e range dinamico. Le discrepanze osservate possono essere dovute ad errori di accuratezza nella preparazione dei campioni a percentuale nota di EH52-927-1. La preparazione di campioni a percentuali note è inevitabile in quanto la farina a concentrazione nota di riferimento da cui essi sono ottenuti è disponibile in commercio solo alla percentuale del 100%. La strategia attuata per il rilevamento di OGM è basata su uno screening iniziale per le due più comuni sequenze di regolazione (promotore 35S e terminatore Nos) associato all’amplificazione di sequenze specie-specifiche per mais e soia. Infine, sulla base dei risultati di screening, la strategia prevede amplificazioni costrutto e/o evento specifiche per identificare e quantificare la soia Roundup Ready (RRS) ed il mais Bt11. Come già accennato abbiamo applicato a tutte le fasi della strategia di rilevamento una procedura di preamplificazione basata sull’utilizzo del reagente TaqMan ® PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) e di una miscela di coppie di primer e sonde specifiche per i marcatori da analizzare. In questo contesto la tecnologia di preamplificazione ha aumentato la sensibilità della reazione di amplificazione in PCR Real time. L’efficienza della PCR deve essere valutata per eseguire una determinazione quantitativa attendibile del contenuto di OGM 16. La riduzione dell’efficienza di amplificazione di tRNA leu nei campioni preamplificati rispetto ai non preamplificati potrebbe essere legata ad una possibile interazione dei primer all’interno della pooled mix utilizzata nella reazione di preamplificazione. Una spiegazione alternativa è stata fornita da Coudry e collaboratori (dati non pubblicati) che hanno evidenziato una riduzione dell’amplificazione dei geni altamente espressi in campioni di cDNA preamplificati. e questo potrebbe essere vero anche per geni ad alto numero di copie come tRNA leu. Conclusioni I vantaggi offerti dall’uso di calibratori plasmidici sono molteplici e testimoniati da diversi lavori presenti in letteratura. In particolare, accanto alla quantità illimitata di tali molecole che si può ottenere, esse offrono la possibilità di effettuare un’analisi quantitativa anche nei casi in cui non siano disponibili i calibratori certificati dall’IRMM. La loro realizzazione e soprattutto la loro applicazione alla quantificazione di OGM in DNA estratto da matrici alimentare presenta, però, non poche difficoltà. I dati ottenuti in questo lavoro dimostrano che i risultati di quantificazione ottenuti con un calibratore plasmidico non risultano sempre commutabili con quelli ottenuti con l’uso di un calibratore a DNA genomico, anche se nell’ambito dei Minimum Performance Requirements diversi parametri, quali efficienza, R 2 e LOD vengono soddisfatti. La tecnologia di preamplificazione ha aumentato la sensibilità della reazione di amplificazione in PCR Real time, risultando utile in particolare per i target presenti in basso numero di copie aumentando inoltre il numero di target analizzabili in DNA estratti da alimenti lavorati. I risultati ottenuti con la reazione di preamplificazione indicano che essa non influisce sull’affidabilità del dato quantitativo, suggerendo che tale strategia possa trovare interessanti applicazioni in tutti quei campi che richiedono analisi quantitative mediante PCR Real time. Riassunto La rilevazione e la quantificazione degli organismi geneticamente modificati (OGM) negli alimenti viene effettuata mediante la Reazione a Catena della Polimerasi in Tempo reale (PCR Real time). L’impiego di tale tecnica è condizionata da due fattori critici: la scelta di calibratori adeguati e un DNA di qualità e quantità adeguate. In questo lavoro sono descritti esperimenti relativi all’applicabilità di un calibratore plasmidico come standard per la determinazione quantitativa della patata EH92-527-1. Inoltre, vengono presentati risultati ottenuti applicando la tecnica di preamplificazione al DNA estratto da alimenti lavorati per migliorare la sensibilità della PCR real time ed aumentare il numero di target analizzabili. Parole chiave: Reazione a catena della polimerasi in tempo reale - DNA, recombinant - Organismi geneticamente modificati. Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 33
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