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CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE tabElla iv. — Sono riportati media, deviazione standard e coefficiente di variazione dei valori di Ct ottenuti dall’amplificazione di sette geni target, I. — campioni preamplificati rispetto ai non preamplificati mostrano una riduzione altamente significativa (p< 0,0001) del valore di Ct in un intervallo tra 3,03 e 7,45. leu tRNA adh1 le1 Matrice Non non Non Preamplificato preamplificato Preamplificato preamplificato Preamplificato preamplificato Farina di soia 16,52±0,14 0,85% 19,54±1,05 - - 22,30±0,23 27,48±0,30 5,37% 1,03% 1,09% Polenta 12,22±0,01 16,06±0,47 19,57±0,32 25,69±0,33 - - 0,13% 2,92% 1,63% 1,28% Snack salato 12,68±0,02 17,49±0,09 29,08±0,16 34,65±0,67 - - 0,16% 0,52% 0,57% 1,93% Snack al mais 11,49±0,22 14,44±0,30 20,09±0,13 25,23±0,74 - - 1,91% 2,10% 0,64% 2,91% Merendina alla 14,83±0,50 19,46±0,62 - - - - frutta 3,37% 3,19% Mix shake 18,17±0,14 22,70±0,84 29,04±0,38 34,37±0,50 20,33±0,34 25,86±0,37 0,76% 3,7% 1,30% 1,47% 1,67% 1,43% semi di soia tostati 19,31±0,38 22,79±0,17 - - 19,48±0,14 25,32±0,38 1,97% 0,74% 0,72% 1,50% Pane di soia 13,25±0,35 17,42±0,41 - - 22,75±0,40 28,37±0,23 2,66% 2,36% 1,75% 0,81% Latte di soia 14,62±0,35 19,48±0,82 - - 18,63±0,30 24,67±0,22 2,41% 4,2% 1,61% 0,89% l’estremità 3’ del costrutto ed il genoma della pianta ospite ottenendo risultato positivo solo per il DNA estratto da polenta. Tutte le reazioni di amplificazione in PCR Real time sono state condotte sia sui campioni preamplificati che non preamplificati ed i risultati sono stati confrontati per verificare l’applicabilità della tecnica ed individuarne gli effettivi vantaggi. I parametri che sono stati considerati sono: la sensibilità, la linearità, la precisione, l’efficienza e l’accuratezza. La Tabella IV riporta i valori medi, la deviazione standard (SD) e la deviazione standard relativa (CV) dei valori di Ct. I campioni preamplificati, rispetto a quelli non preamplificati, hanno mostrato un significativo miglioramento dei valori di Ct (P
PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO p35S tNOS mais Bt11 RR soia Non non non non Preamplificato preamplificato Preamplificato preamplificato preamplificato preamplificato preamplificato preamplificato 31,00±0,00 36,25±1,06 - - NT NT - - - 2,92% 29,83±0,02 34,85±0,32 - - 32,50±0,30 39,45±0,60 NT NT 0,07% 0,92% 0,92% 1,5% - - - - NT NT NT NT - - - - NT NT NT NT - - - - NT NT NT NT 33,84±0,40 38,38±0,44 35,55±0,07 38,76±1,07 - - 34,88±0,08 40,15±0,30 1,20% 1,15% 0,20% 2,76% 0,23% 0,75% - - - - NT NT NT NT 34,38±1,12 3,26% 23,05±0,22 0,95% 37,29±0,52 1,39% 28,10±0,46 1,64% Discussione 31,67±0,15 0,47% 30,63±1,30 4,24% 38,22±0,59 1,54% 38,08±1,02 2,69% tabElla v. — Efficienze di amplificazione dei diversi campioni e target. L’impiego di DNA ricombinante come standard rappresenta un’interessante innovazione nell’ambito della certificazione OGM. La sua progettazione, realizzazione ed applicazione presenta tre fasi critiche: a) clonaggio della sequenza GM desiderata; b) accuratezza delle diluizioni del plasmide; c) verifica che il calibratore plasmidico si comporti in maniera equivalente a quello costituito da DNA genomico (commutabilità) 5. Per quanto riguarda il primo parametro, i risultati ottenuti dal sequenziamento dell’inserto NT NT 32,53±0,14 0,43% NT NT 32,71±0,24 0,75% 38,36±0,61 1,59% 38,59±0,25 0,65% Campione Preamp, Leu tRNA Non-preamp, Preamp, ADH1 Non-preamp, Preamp, LE1 Non-preamp, Farina di soia 0,49 0,66 - - 0,92 0,66 Polenta 0,79 1,00 0,81 0,69 - - Snack salato 0,91 1,00 0,87 0,91 - - Snack al mais 0,87 1,00 0,90 0,90 - - Merendina alla frutta 0,76 0,99 - - - - Mix shake 0,44 1,10 1,03 1,15 0,90 0,87 Semi di soia tostati 0,55 0,80 - - 0,77 0,76 Pane di soia 0,70 1,09 - - 0,91 0,84 Latte di soia 0,83 1,11 - - 0,93 0,94 integrato nel plasmide pCR2.1 hanno confermato il corretto clonaggio della sequenza GM. Per quanto riguarda la seconda fase un calibratore plasmidico che contenga entrambi i target (evento-specifico e specie-specifico) necessari per la quantificazione garantisce un errore minore nelle diluizioni. Infine, per verificare che il calibratore plasmidico si comporti in maniera equivalente a quello costituito da DNA genomico è necessario valutare una serie di requisiti che prendono in esame l’applicabilità e la commutabilità. Per la verifica della applicabilità del protocollo di Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 31
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