tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab

PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO
tabElla ii. — Valori di pendenza, efficienza di amplificazione, coefficiente di correlazione, LOD e LOQ delle rette di calibrazione
per la sequenza endogena (UGPase) e transgenica (EH92-527-1) relativi ad esperimenti di Real-time PCR in cui il plasmide
linearizzato è stato utilizzato come calibratore.
UGPase EH92-527-1
Pendenza Efficienza R2 Pendenza Efficienza R2 -3,36 98,43 0,99 -3,70 86,32 0,99
-3,51 92,70 0,99 -3,69 86,64 0,99
-3,57 90,59 0,99 -3,68 86,95 0,99
-3,46 94,54 0,98 -3,60 89,57 0,98
-3,55 91,30 0,99 -3,65 87,92 0,99
LOD 6 LOD 21
LOQ 33 LOQ 148
tabElla iii. — Valori misurati del contenuto percentuale di EH92-527-1 nei campioni a concentrazione nota ottenuti impiegando
il calibratore plasmidico. In tabella sono riportati: il valore atteso corrispondente al contenuto percentuale noto di OGM
nei campioni analizzati; il valore misurato e la deviazione standard relativa (RSD); il fattore di calibrazione calcolato come
rapporto tra il valore misurato ed il valore atteso; il valore misurato corretto ottenuto dal rapporto tra il valore misurato ed il
fattore di calibrazione e la deviazione standard relativa ad esso associato.
Valore atteso
(%)
Valore misurato
(%)
RSD (%)
basato sull’impiego del CTAB è risultato quello più
efficace tra tutti quelli utilizzati per l’estrazione di
DNA dalle matrici alimentari in esame (dati non mostrati).
L’amplificabilità dei DNA estratti con questo
metodo dalle matrici di interesse è stata valutata mediante
l’amplificazione del gene tRNA leu. Risultati
positivi sono stati ottenuti per tutti i campioni in
esame come mostrato in Tabella IV.
Per quanto riguarda l’individuazione di OGM, è
stata dapprima effettuata l’amplificazione delle sequenze
specie-specifiche, quali ADH1 per il mais
e LE1 per la soia i cui risultati sono riassunti nella
Tabella IV: quattro campioni contenevano DNA di
mais (polenta, snack salato, snack al mais, mix shake),
cinque contenevano DNA di soia (farina di soia,
mix shake, semi di soia tostati, pane di soia, latte di
soia) e solo uno conteneva il DNA di entrambe le
specie vegetali (mix shake). La sequenza del promotore
35S è stata rilevata in cinque campioni (farina
di soia, polenta, mix shake, pane di soia, latte di
soia) mentre il terminatore NOS è stato rilevato in
tre campioni (mix shake, pane di soia, latte di soia).
Fattore di
calibrazione
Valore misurato
corretto (%)
0,1 3,800 x 10 -6 20,789 3,8 x 10 -5 5,430 x 10 -4 29,466
0,5 0,004 4,040 0,008 0,500 3,968
1 0,017 55,704 0,017 2,125 55,718
2 0,009 13,793 0,005 1,225 11,673
5 0,034 42,353 0,007 4,881 42,041
Media 27,336 0,007 28,573
I campioni di snack salato, snack al mais e semi di
soia tostati, pur contenendo mais, soia o entrambe
le specie, sono risultati negativi all’amplificazione
del promotore 35S e del terminatore NOS.
Per quanto riguarda le matrici alimentari contenenti
soia gli estratti risultati positivi alla fase di screening
(mix shake, pane di soia, latte di soia) sono
stati sottoposti ad una PCR costrutto-specifica che
prevedeva l’amplificazione della regione di giunzione
tra il promotore 35S e la sequenza del Chloroplast
Transit Peptide (CTP) che precede la sequenza
del gene EPSPS presente nella soia Roundup Ready.
I risultati (Tabella IV) indicano che le matrici in
esame contengono effettivamente soia transgenica
derivante dall’evento di trasformazione GTS 40-3-2
(Roundup Ready), regolarmente autorizzato nell’ambito
dell’UE.
Per la specie Zea mays l’identificazione è stata
limitata all’evento Bt11. Gli estratti risultati positivi
all’analisi di screening (polenta e shake mix) sono
stati saggiati impiegando una coppia di primer ed
una sonda specifici per la regione di giunzione tra
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RSD
(%)