CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE molecole del transgene ed il numero <strong>di</strong> molecole del gene endogeno. Per ciascun valore è stata riportata la me<strong>di</strong>a, la deviazione standard (SD) e la deviazione standard relativa (RSD o CV). Per la determinazione del LOD (limite <strong>di</strong> rilevamento) si è proceduto calcolando il più basso numero <strong>di</strong> copie corrispondenti ad un RSD≤33%. Per la determinazione del LOQ (limite <strong>di</strong> quantificazione) si è proceduto calcolando il più basso numero <strong>di</strong> copie corrispondenti ad un RSD≤25%. L’efficienza <strong>di</strong> amplificazione è stata determinata amplificando <strong>di</strong>luzioni seriali del DNA me<strong>di</strong>ante la seguente formula: 10 (-1/slope)-1. L’analisi statistica è stata effettuata con l’ausilio del software GraphPad (Prism 5). Per analizzare le <strong>di</strong>fferenze significative tra i campioni preamplificati e non preamplificati, è stato eseguito il test ANOVA a due code: un valore <strong>di</strong> probabilità P
PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO tabElla ii. — Valori <strong>di</strong> pendenza, efficienza <strong>di</strong> amplificazione, coefficiente <strong>di</strong> correlazione, LOD e LOQ delle rette <strong>di</strong> calibrazione per la sequenza endogena (UGPase) e transgenica (EH92-527-1) relativi ad esperimenti <strong>di</strong> Real-time PCR in cui il plasmide linearizzato è stato utilizzato come calibratore. UGPase EH92-527-1 Pendenza Efficienza R2 Pendenza Efficienza R2 -3,36 98,43 0,99 -3,70 86,32 0,99 -3,51 92,70 0,99 -3,69 86,64 0,99 -3,57 90,59 0,99 -3,68 86,95 0,99 -3,46 94,54 0,98 -3,60 89,57 0,98 -3,55 91,30 0,99 -3,65 87,92 0,99 LOD 6 LOD 21 LOQ 33 LOQ 148 tabElla iii. — Valori misurati del contenuto percentuale <strong>di</strong> EH92-527-1 nei campioni a concentrazione nota ottenuti impiegando il calibratore plasmi<strong>di</strong>co. In tabella sono riportati: il valore atteso corrispondente al contenuto percentuale noto <strong>di</strong> OGM nei campioni analizzati; il valore misurato e la deviazione standard relativa (RSD); il fattore <strong>di</strong> calibrazione calcolato come rapporto tra il valore misurato ed il valore atteso; il valore misurato corretto ottenuto dal rapporto tra il valore misurato ed il fattore <strong>di</strong> calibrazione e la deviazione standard relativa ad esso associato. Valore atteso (%) Valore misurato (%) RSD (%) basato sull’impiego del CTAB è risultato quello più efficace tra tutti quelli utilizzati per l’estrazione <strong>di</strong> DNA dalle matrici alimentari in esame (dati non mostrati). L’amplificabilità dei DNA estratti con questo metodo dalle matrici <strong>di</strong> interesse è stata valutata me<strong>di</strong>ante l’amplificazione del gene tRNA leu. Risultati positivi sono stati ottenuti per tutti i campioni in esame come mostrato in Tabella IV. Per quanto riguarda l’in<strong>di</strong>viduazione <strong>di</strong> OGM, è stata dapprima effettuata l’amplificazione delle sequenze specie-specifiche, quali ADH1 per il mais e LE1 per la soia i cui risultati sono riassunti nella Tabella IV: quattro campioni contenevano DNA <strong>di</strong> mais (polenta, snack salato, snack al mais, mix shake), cinque contenevano DNA <strong>di</strong> soia (farina <strong>di</strong> soia, mix shake, semi <strong>di</strong> soia tostati, pane <strong>di</strong> soia, latte <strong>di</strong> soia) e solo uno conteneva il DNA <strong>di</strong> entrambe le specie vegetali (mix shake). La sequenza del promotore 35S è stata rilevata in cinque campioni (farina <strong>di</strong> soia, polenta, mix shake, pane <strong>di</strong> soia, latte <strong>di</strong> soia) mentre il terminatore NOS è stato rilevato in tre campioni (mix shake, pane <strong>di</strong> soia, latte <strong>di</strong> soia). Fattore <strong>di</strong> calibrazione Valore misurato corretto (%) 0,1 3,800 x 10 -6 20,789 3,8 x 10 -5 5,430 x 10 -4 29,466 0,5 0,004 4,040 0,008 0,500 3,968 1 0,017 55,704 0,017 2,125 55,718 2 0,009 13,793 0,005 1,225 11,673 5 0,034 42,353 0,007 4,881 42,041 Me<strong>di</strong>a 27,336 0,007 28,573 I campioni <strong>di</strong> snack salato, snack al mais e semi <strong>di</strong> soia tostati, pur contenendo mais, soia o entrambe le specie, sono risultati negativi all’amplificazione del promotore 35S e del terminatore NOS. Per quanto riguarda le matrici alimentari contenenti soia gli estratti risultati positivi alla fase <strong>di</strong> screening (mix shake, pane <strong>di</strong> soia, latte <strong>di</strong> soia) sono stati sottoposti ad una PCR costrutto-specifica che prevedeva l’amplificazione della regione <strong>di</strong> giunzione tra il promotore 35S e la sequenza del Chloroplast Transit Peptide (CTP) che precede la sequenza del gene EPSPS presente nella soia Roundup Ready. I risultati (Tabella IV) in<strong>di</strong>cano che le matrici in esame contengono effettivamente soia transgenica derivante dall’evento <strong>di</strong> trasformazione GTS 40-3-2 (Roundup Ready), regolarmente autorizzato nell’ambito dell’UE. Per la specie Zea mays l’identificazione è stata limitata all’evento Bt11. Gli estratti risultati positivi all’analisi <strong>di</strong> screening (polenta e shake mix) sono stati saggiati impiegando una coppia <strong>di</strong> primer ed una sonda specifici per la regione <strong>di</strong> giunzione tra Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 29 RSD (%)
Change language