tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab
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PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO<br />
clonaggio dEl costrutto in cEllulE battErichE<br />
Gli ampliconi ibri<strong>di</strong> ottenuti dalla PCR overlapping<br />
sono stati integrati nel plasmide pCR 2.1 attraverso<br />
l’uso del kit TA Cloning Kit (Invitrogen), clonati<br />
in cellule batteriche chimicamente competenti<br />
<strong>di</strong> E. coli “One Shot Top 10 Chemically Competent<br />
E. coli” (Invitrogen) secondo le in<strong>di</strong>cazioni del fornitore<br />
e piastrate su un terreno <strong>di</strong> coltura selettivo<br />
contenente ampicillina (Sigma-Aldrich). Le colonie<br />
ottenute sono state sottoposte a mini preparazione<br />
plasmi<strong>di</strong>ca utilizzando il kit Nucleo Spin Plasmid<br />
(Macherey-Nagel, Düren, Germany) secondo le<br />
istruzioni del fornitore. 800 ng <strong>di</strong> DNA plasmi<strong>di</strong>co<br />
sono stati sequenziati utilizzando il kit “CEQ 8000<br />
dye terminator cycle sequencing with quick start kit’’<br />
protocol” (Beckman Coulter Fullerton, CA) utilizzando<br />
il sequenziatore automatico CEQ8000 (Beckman<br />
Coulter).<br />
linEarizzazionE dEl calibratorE plasmi<strong>di</strong>co<br />
La <strong>di</strong>gestione <strong>di</strong> 1 µg <strong>di</strong> plasmide viene condotta<br />
in un volume totale <strong>di</strong> 25 µl <strong>di</strong> una soluzione<br />
100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2,<br />
1 mM DTT in presenza <strong>di</strong> 20 U dell’enzima <strong>di</strong> restrizione<br />
BssHII e 20 U dell’enzima <strong>di</strong> restrizione BglII.<br />
La miscela è stata incubata a 37 °C per 2 ore e la<br />
presenza <strong>di</strong> DNA <strong>di</strong>gerito è stata verificata con una<br />
corsa elettroforetica su gel <strong>di</strong> agarosio all’ 1,2 %.<br />
prEamplificazionE<br />
La procedura sperimentale <strong>di</strong> preamplificazione<br />
come in<strong>di</strong>cato da Del Gau<strong>di</strong>o et al., (2009) è stata<br />
eseguita utilizzando 9 pmol <strong>di</strong> ciascun primer (Tabella<br />
I, pannello B) per ottenere una pooled mix.<br />
Le con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> reazione prevedono la preamplificazione<br />
<strong>di</strong> 200 ng <strong>di</strong> DNA in un volume totale <strong>di</strong> 50<br />
µl, contenente 25 µl <strong>di</strong> TaqMan PreAmp Master Mix<br />
(Applied Biosystems) e 6.25 µl <strong>di</strong> pooled mix. La reazione<br />
condotta in un termociclatore Veriti (Applied<br />
Biosystems), prevede una fase <strong>di</strong> denaturazione del<br />
DNA a 95 °C per 10 minuti, seguita da 10 cicli <strong>di</strong> amplificazione<br />
così costituiti: denaturazione del DNA a<br />
95 °C per 15 secon<strong>di</strong>, 4 minuti a 60 °C per annealing<br />
ed estensione. I prodotti della preamplificazione<br />
sono stati <strong>di</strong>luiti 1:5 con il buffer 1X Tris-EDTA ed<br />
usati come stampo per le successive PCR Real time.<br />
Per ciascun target la PCR real time è stata condotta<br />
in triplicato sia su campioni preamplificati che non<br />
preamplificati, utilizzando il termociclatore DNA Engine<br />
Opticon 2 MJ Research (Biorad). Sia per la reazione<br />
con SYBR Green sia con sonde TaqMan, 5 µl<br />
<strong>di</strong> DNA sono stati amplificati in un volume totale <strong>di</strong><br />
reazione <strong>di</strong> 25 µl con primer specifici per il target <strong>di</strong><br />
interesse alle con<strong>di</strong>zioni descritte in Del Gau<strong>di</strong>o et<br />
al. (2009) 11.<br />
Raccolta ed analisi dei dati<br />
Le curve <strong>di</strong> calibrazione sono state costruite <strong>di</strong>luendo<br />
serialmente il DNA estratto dalla farina al<br />
5% <strong>di</strong> mais Bt11, ottenendo 258 129, 65, 16 e 5 ng<br />
<strong>di</strong> DNA corrispondenti a 4734, 2366, 1184, 296, 98<br />
copie della sequenza transgenica e 94676, 47340,<br />
23680, 5920, 1960 copie del genoma <strong>di</strong> mais per<br />
reazione 14.<br />
Il DNA estratto dalla farina al 5% <strong>di</strong> soia RR è<br />
stato <strong>di</strong>luito serialmente ottenendo 100, 50, 12.5, 4.2<br />
ed 1.4 ng <strong>di</strong> DNA corrispondenti a 4425, 2212, 533,<br />
184, 61 copie della sequenza transgenica e 88495,<br />
44248, 11062, 3687, 1229 copie del genoma <strong>di</strong> soia<br />
per reazione.<br />
Le curve <strong>di</strong> calibrazione per la quantificazione<br />
dell’evento EH92-527-1 sono state costruite utilizzando<br />
DNA estratto da farina al 100% <strong>di</strong> OGM <strong>di</strong>luito<br />
in rapporto 1:10 in DNA estratto da farina <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
0% OGM al fine <strong>di</strong> ottenere un campione <strong>di</strong> DNA<br />
al 10%. I campioni a percentuale nota <strong>di</strong> EH92-527-1<br />
pari a 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% sono stati ottenuti miscelando<br />
quantità opportune <strong>di</strong> DNA estratto da farina<br />
al 100% con DNA estratto da farina <strong>di</strong> <strong>patata</strong> 0%.<br />
Per la costruzione della curva <strong>di</strong> riferimento sono<br />
state eseguite <strong>di</strong>luizioni in H2O bi<strong>di</strong>stillata pari a<br />
200, 66.6, 22.2, 7.04, 2.46, 1 ng <strong>di</strong> DNA corrispondenti<br />
a 11111, 3704, 1234, 411, 137, 46 copie della<br />
sequenza transgenica e 111111, 37036, 12346, 4115,<br />
1372, 457 copie del genoma <strong>di</strong> <strong>patata</strong> per reazione.<br />
Le curve <strong>di</strong> calibrazione utilizzando il calibratore<br />
plasmi<strong>di</strong>co sono state eseguite <strong>di</strong>luendo il DNA plasmi<strong>di</strong>co<br />
<strong>di</strong>gerito al fine <strong>di</strong> ottenere 107, 106, 105, 104, 103, 102, 50, 25 copie della sequenza transgenica ed<br />
endogena per reazione. 5 µl <strong>di</strong> ciascuna <strong>di</strong>luzione<br />
sono stati utilizzati in una reazione condotta in 25 µl<br />
<strong>di</strong> soluzione 1X TaqMan Universal PCR Master Mix,<br />
utilizzando primer e sonde alle concentrazioni d’uso<br />
in<strong>di</strong>cate in Tabella III.<br />
I valori <strong>di</strong> Ct in funzione del log10 del numero<br />
<strong>di</strong> molecole sono stati utilizzati per determinare il<br />
contenuto <strong>di</strong> OGM del campione incognito come<br />
rapporto espresso in percentuale tra il numero <strong>di</strong><br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 27