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CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE secondi, una fase di annealing ed estensione a 60°C per 45 secondi. Le sequenze dei primer (evento-specifici) Event 527 bf1 e St527-r1- tail, dei primer (specie-specifici) UGPf e UGPr diretti contro una porzione del gene UGP-ase e le relative concentrazioni d’uso sono riportate in Tabella I, pannello A. Blunt ending degli ampliconi. Il trattamento con la T4 DNA polimerasi è stato condotto in un volume totale di 100 µl di una soluzione 165 mM tris-acetato pH 7.9, 330 mM sodio acetato, 50 mM DTT, 100 µM dNTP, 10 U T4 DNA polimerasi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in presena di 3µl di prodotto di PCR. La miscela è stata incubata a 11°C per 15 minuti, in ghiaccio per 2 minuti ed incubata a 75°C per 10 minuti per l’inattivazione dell’enzima. Integrazione in tandem dei frammenti specie-specifici ed evento specifici. La reazione di amplificazione della seconda fase della PCR overlapping è stata condotta in un volume totale di 25 µl di una soluzione 1,5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 0,1% Triton X-100, 200 µM dNTP, 0.2 µM di ciascun primer (Event 527bf1 ed UGPr), 2,5 U di AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems) in presenza di 0,5 µl del prodotto di PCR ottenuto per l’amplificazione del gene endogeno UGP-ase e 0,5 µl del prodotto di PCR evento-specifico dopo trattamento con T4 DNA polimerasi. Dopo una fase di denaturazione iniziale del DNA a 95 °C per 6 minuti, i 40 cicli di amplificazione prevedono una fase di denaturazione a 95 °C per 45 secondi, una fase di annealing ed estensione a 60 °C per 45 secondi. La dimensione attesa dell’amplicone è di 196 bp. tabElla i. — Sequenze dei primer e delle sonde utilizzate per la realizzazione del calibratore plasmidico (Pannello A) e per la preamplificazione (Pannello B). Da sinistra a destra troviamo il target, il nome del primer e della sonda, le sequenze, le concentrazioni d’uso e le dimensioni attese dell’amplicone. Target Pannello A Primer e sonda Sequenza Concentrazione (nM) Dimensione dell’amplicone UGP-ase UGP f 5’-TGGCCTCTGTGGTGGACAA-3’ 900 UGPr 5’-TCTCTTCACATGTCCAAACCATCT-3’ 300 62 UGP probe 5’-VIC-CTGAGGGAAGCGAGACT-BHQ-3’ 100 Evento EH92-527-1 Event 527 bf1 5’-GTGTCAAAACACAATTTACAGCA-3’ 900 St527-r1 5’-TCCCTTAATTCTCCGCTCATGA-3’ 900 134 St527-S1 5’-FAM-AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-TAMRA-3’ 160 Pannello B St527-r1- tail 5’-CCACAGAGGCCATCCCTTATTCTCCG-3’ 100 196 Leu tRNA tLeu F 5’-TCCAAATTCAGAGAAACCCTGG-3’ 200 180 bp tLeu R 5’-GCTAAGCAATCTTGTCGAAGGT-3’ 200 ADH1 ADH F3 5’-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3’ 300 134 bp ADH R4 5’-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3’ 300 ADH1-MDO 5’-FAM-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-TAMRA-3’ 200 LE1 GM1-F 5’-CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC-3’ 600 74 bp GM1-R 5’-GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC-3’ 600 Sonda GM1 5’-FAM-CTTCACCTTCTATGCCCCTGACAC-TAMRA-3’ 120 p35S 35S-F 5’-GCCTCTGCCGACAGTGGT-3’ 300 82 bp 35S-R 5’-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’ 900 35S-TMP 5’-FAM-CAAAGATGGACCCCCACCCAC-TAMRA-3’ 100 tNOS tNOS-F 5’-CAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAG-3’ 300 98 bp tNOS-R 5’-TTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAG-3’ 300 Sonda tNOS 5’-FAM-TCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-TAMRA-3’ 120 Evento Bt11 Bt11 3JF 5’-GCGGAACCCCTATTTGTTTA-3’ 750 70 bp Bt11 3JR 5’-TCCAAGAATCCCTCCATGAG-3’ 750 Bt11 3JFT 5’-FAM-AAATACATTCAAATATGTATCCGCTCA-TAMRA-3’ 250 Costrutto RR RR1-F 5’-CATTTGGAGAGGACACGCTGA-3’ 600 74 bp RR1-R 5’-GAGCCATGTTGTTAATTTGTGCC-3’ 600 Sonda RR1 5’-FAM-CAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTC-TAMRA-3’ 120 26 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO clonaggio dEl costrutto in cEllulE battErichE Gli ampliconi ibridi ottenuti dalla PCR overlapping sono stati integrati nel plasmide pCR 2.1 attraverso l’uso del kit TA Cloning Kit (Invitrogen), clonati in cellule batteriche chimicamente competenti di E. coli “One Shot Top 10 Chemically Competent E. coli” (Invitrogen) secondo le indicazioni del fornitore e piastrate su un terreno di coltura selettivo contenente ampicillina (Sigma-Aldrich). Le colonie ottenute sono state sottoposte a mini preparazione plasmidica utilizzando il kit Nucleo Spin Plasmid (Macherey-Nagel, Düren, Germany) secondo le istruzioni del fornitore. 800 ng di DNA plasmidico sono stati sequenziati utilizzando il kit “CEQ 8000 dye terminator cycle sequencing with quick start kit’’ protocol” (Beckman Coulter Fullerton, CA) utilizzando il sequenziatore automatico CEQ8000 (Beckman Coulter). linEarizzazionE dEl calibratorE plasmidico La digestione di 1 µg di plasmide viene condotta in un volume totale di 25 µl di una soluzione 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM DTT in presenza di 20 U dell’enzima di restrizione BssHII e 20 U dell’enzima di restrizione BglII. La miscela è stata incubata a 37 °C per 2 ore e la presenza di DNA digerito è stata verificata con una corsa elettroforetica su gel di agarosio all’ 1,2 %. prEamplificazionE La procedura sperimentale di preamplificazione come indicato da Del Gaudio et al., (2009) è stata eseguita utilizzando 9 pmol di ciascun primer (Tabella I, pannello B) per ottenere una pooled mix. Le condizioni di reazione prevedono la preamplificazione di 200 ng di DNA in un volume totale di 50 µl, contenente 25 µl di TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) e 6.25 µl di pooled mix. La reazione condotta in un termociclatore Veriti (Applied Biosystems), prevede una fase di denaturazione del DNA a 95 °C per 10 minuti, seguita da 10 cicli di amplificazione così costituiti: denaturazione del DNA a 95 °C per 15 secondi, 4 minuti a 60 °C per annealing ed estensione. I prodotti della preamplificazione sono stati diluiti 1:5 con il buffer 1X Tris-EDTA ed usati come stampo per le successive PCR Real time. Per ciascun target la PCR real time è stata condotta in triplicato sia su campioni preamplificati che non preamplificati, utilizzando il termociclatore DNA Engine Opticon 2 MJ Research (Biorad). Sia per la reazione con SYBR Green sia con sonde TaqMan, 5 µl di DNA sono stati amplificati in un volume totale di reazione di 25 µl con primer specifici per il target di interesse alle condizioni descritte in Del Gaudio et al. (2009) 11. Raccolta ed analisi dei dati Le curve di calibrazione sono state costruite diluendo serialmente il DNA estratto dalla farina al 5% di mais Bt11, ottenendo 258 129, 65, 16 e 5 ng di DNA corrispondenti a 4734, 2366, 1184, 296, 98 copie della sequenza transgenica e 94676, 47340, 23680, 5920, 1960 copie del genoma di mais per reazione 14. Il DNA estratto dalla farina al 5% di soia RR è stato diluito serialmente ottenendo 100, 50, 12.5, 4.2 ed 1.4 ng di DNA corrispondenti a 4425, 2212, 533, 184, 61 copie della sequenza transgenica e 88495, 44248, 11062, 3687, 1229 copie del genoma di soia per reazione. Le curve di calibrazione per la quantificazione dell’evento EH92-527-1 sono state costruite utilizzando DNA estratto da farina al 100% di OGM diluito in rapporto 1:10 in DNA estratto da farina di patata 0% OGM al fine di ottenere un campione di DNA al 10%. I campioni a percentuale nota di EH92-527-1 pari a 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% sono stati ottenuti miscelando quantità opportune di DNA estratto da farina al 100% con DNA estratto da farina di patata 0%. Per la costruzione della curva di riferimento sono state eseguite diluizioni in H2O bidistillata pari a 200, 66.6, 22.2, 7.04, 2.46, 1 ng di DNA corrispondenti a 11111, 3704, 1234, 411, 137, 46 copie della sequenza transgenica e 111111, 37036, 12346, 4115, 1372, 457 copie del genoma di patata per reazione. Le curve di calibrazione utilizzando il calibratore plasmidico sono state eseguite diluendo il DNA plasmidico digerito al fine di ottenere 107, 106, 105, 104, 103, 102, 50, 25 copie della sequenza transgenica ed endogena per reazione. 5 µl di ciascuna diluzione sono stati utilizzati in una reazione condotta in 25 µl di soluzione 1X TaqMan Universal PCR Master Mix, utilizzando primer e sonde alle concentrazioni d’uso indicate in Tabella III. I valori di Ct in funzione del log10 del numero di molecole sono stati utilizzati per determinare il contenuto di OGM del campione incognito come rapporto espresso in percentuale tra il numero di Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 27
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