tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab

PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO
to. La concentrazione del DNA è stata determinata
impiegando lo spettrofotometro Nanodrop ND1000
(Thermo Scientific, Wilmington, DE). L’integrità del
DNA estratto è stata verificata mediante corsa elettroforetica
su gel di agarosio all’1% in TE (Tris-EDTA).
rEalizzazionE dEl calibratorE plasmidico: pcr ovErlapping
Amplificazione del DNA da farina di patata con
primer specie-specifici ed evento specifici.
Le reazioni di amplificazione dei frammenti target
nella prima fase della PCR sono state condotte impiegando
100ng di DNA estratto da farina di patata
100% OGM in un volume totale di 25 µl di una solu-
zione 3 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH
9.0, 0.1% Triton X-100, 200 µM dNTP e 2.5 U di AmpliTaq
Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems)
(Figura 1).
Il primer St527-r1- tail è costituito, a partire
dall’estremità 5’, da 12 nucleotidi complementari ad
un tratto dell’estremità 5’ del primer UGPf e condivide
poi la sequenza dei primi 15 nucleotidi del primer
st 527-r, in modo tale che l’amplicone ottenuto
con i primer Event 527 bf1 e St527-r1-tail contenga
una sequenza complementare all’amplicone ottenuto
con i primer UGPf e UGPr.
Dopo una fase di denaturazione iniziale del DNA
a 95 °C per 6 minuti, i 35 cicli di amplificazione
prevedono una fase di denaturazione a 95 °C per 45
Figura 1. — Schema semplificativo della reazione di PCR overlapping. In una prima reazione di PCR vengono amplificati separatamente
il frammento evento-specifico e quello specie-specifico. In una seconda reazione di PCR i prodotti della prima amplificazione vengono
miscelati in eguale quantità e sottoposti ad amplificazione. Il risultato è l’integrazione in tandem dei due ampliconi. Il riquadro rappresenta
uno stadio intermedio della seconda reazione di PCR in cui le estremità 3’ delle molecole ibride sono estese dalla Taq DNA polimerasi.
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 25