tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab

CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE
to il tubero GM, contenendo una minore quantità
di amilosio, si presta meglio alla lavorazione industriale.
Il calibratore plasmidico descritto in questo lavoro
contiene in tandem due frammenti target (evento-specifico
e specie-specifico) necessari per la determinazione
quantitativa di EH92-527-1 attraverso
la PCR real time. La costruzione del tandem è stata
ottenuta utilizzando la tecnica della PCR overlapping
4 che prevede l’uso di primer progettati ad
hoc per ottenere ampliconi parzialmente complementari
tra loro.
Nell’ambito della tracciabilità dei prodotti OGM
lungo la filiera produttiva è stato affrontato il problema
della loro rilevabilità anche in prodotti lavorati.
Infatti, mentre l’amplificazione del DNA estratto da
matrici non lavorate (semi, foglie) o poco lavorate
(sfarinati) non presenta particolari problemi, l’analisi
dei prodotti lavorati risulta più difficoltosa poiché
i procedimenti meccanici, termici e chimici possono
danneggiare il DNA causando idrolisi, depurinazione,
cross-linking ed ossidazione 8. È stato anche
dimostrato 9, 10 che i metodi di estrazione possono
avere un effetto significativo sulla resa e sulla qualità
del DNA e che ciascuna matrice alimentare richiede,
pertanto, l’individuazione del metodo di estrazione
più appropriato o l’ottimizzazione di esso. La presenza
di un DNA danneggiato e frammentato comporta
una ridotta efficienza di amplificazione o, addirittura,
l’impossibilità di rilevare le sequenze target
quando si utilizzano ingredienti processati o quando
questi ingredienti siano presenti in tracce. La strategia
di preamplificazione, una tecnica di biologia
molecolare che consente di aumentare la sensibilità
della PCR Real time e conseguentemente il numero
di target analizzabili in DNA estratti da alimenti
lavorati 11 è stata applicata alla rilevazione di OGM
in prodotti lavorati contenenti mais e/o soia con
l’obiettivo di risolvere le problematiche su esposte.
Materiali e metodi
Materiali
Sono stati usati materiali di riferimento (Sigma-
Aldrich St. Louis, UK) certificati dall’IRMM contenenti
100% (ERM-BF421b) e 0% (ERM-BF421a) di
farina di patata EH92-527-1, 5% (ERM-BF412f), 1%
(ERM-BF412d) e 0.1% (ERM-BF412b) di farina di
mais Bt11, 5% (ERM-BF410f), 1% (ERM-BF410d) e
0.1% (ERM-BF410b) di farina di soia RR. I campioni
di controllo (GeMSU09A, GeMSU09B, GeMSU22A
e GeMSU22B) sono stati acquisiti presso il “Central
Science Laboratory”, (UK) nell’ambito del circuito
FAPAS (Proficiency testing schemes).
Le matrici alimentari (farina di soia, polenta, snack
salato, snack al mais, merendina alla frutta, pane di
soia, latte di soia) sono state reperite in negozi locali,
ad eccezione del mix shake e dei semi di soia
tostati, forniti da un agente di vendita.
Primer e sonde TaqMan
Le sequenze dei primer e delle sonde TaqMan
(ADH1, LE1, p35S, tNOS, mais Bt11, soia RR)
sono quelle riportate nella norma UNI EN ISO
21570:2005 12. Le sequenze dei primer e delle sonde
specifiche dell’evento transgenico EH92-527-1
sono suggerite dal protocollo di amplificazione
proposto dal Community Reference Laboratory
(CRL). I primer e le sonde TaqMan per l’amplificazione
del gene endogeno UDP-glucose pyrophosphorylase
(UGP-ase), per il gene codificante per
il tRNA della leucina (tRNA leu) e per la sequenza
codificante il terminatore del gene della nopalina
sintasi (tNOS) sono stati disegnati impiegando il
software Primer Express 5.0 (Applied Biosystems).
Il primer St527-r1- tail è stato progettato “ad hoc”
per la esecuzione della PCR overlapping.
Per la progettazione dei primer specifici per tLeu,
un gene plastidiale altamente conservato nelle specie
vegetali, sono state allineate sequenze di mais,
soia, colza, grano, riso, cotone e patata. La presenza
di diversi polimorfismi nella sequenza compresa tra
i primer ha impedito la progettazione di una sonda
e pertanto l’amplificazione in PCR Real time di tLeu
è stata effettuata impiegando, in alternativa, l’intercalante
aspecifico SYBR Green.
I primer e le sonde sono state preparate in parte
dalla ditta Eurofins MWG Operon, in parte dalla ditta
Life Technologies.
Metodi
EstrazionE dEl dna
Le matrici alimentari sono state polverizzate attraverso
l’uso di mortaio e pestello in presenza di
azoto liquido. L’estrazione del DNA è stata effettuata
impiegando un metodo basato sull’utilizzo del bromuro
di cetil-trimetilammonio (CTAB) secondo il
protocollo descritto in UNI EN ISO 21571:2005 13.
Tutte le estrazioni sono state condotte in duplica-
24 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012