tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab
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CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE<br />
to il tubero GM, contenendo una minore quantità<br />
<strong>di</strong> amilosio, si presta meglio alla lavorazione industriale.<br />
Il calibratore plasmi<strong>di</strong>co descritto in questo lavoro<br />
contiene in tandem due frammenti target (evento-specifico<br />
e specie-specifico) necessari per la determinazione<br />
quantitativa <strong>di</strong> EH92-527-1 attraverso<br />
la PCR real time. La costruzione del tandem è stata<br />
ottenuta utilizzando la tecnica della PCR overlapping<br />
4 che prevede l’uso <strong>di</strong> primer progettati ad<br />
hoc per ottenere ampliconi parzialmente complementari<br />
tra loro.<br />
Nell’ambito della tracciabilità dei prodotti OGM<br />
lungo la filiera produttiva è stato affrontato il problema<br />
della loro rilevabilità anche in prodotti lavorati.<br />
Infatti, mentre l’amplificazione del DNA estratto da<br />
matrici non lavorate (semi, foglie) o poco lavorate<br />
(sfarinati) non presenta particolari problemi, l’analisi<br />
dei prodotti lavorati risulta più <strong>di</strong>fficoltosa poiché<br />
i proce<strong>di</strong>menti meccanici, termici e chimici possono<br />
danneggiare il DNA causando idrolisi, depurinazione,<br />
cross-linking ed ossidazione 8. È stato anche<br />
<strong>di</strong>mostrato 9, 10 che i meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> estrazione possono<br />
avere un effetto significativo sulla resa e sulla qualità<br />
del DNA e che ciascuna matrice alimentare richiede,<br />
pertanto, l’in<strong>di</strong>viduazione del metodo <strong>di</strong> estrazione<br />
più appropriato o l’ottimizzazione <strong>di</strong> esso. La presenza<br />
<strong>di</strong> un DNA danneggiato e frammentato comporta<br />
una ridotta efficienza <strong>di</strong> amplificazione o, ad<strong>di</strong>rittura,<br />
l’impossibilità <strong>di</strong> rilevare le sequenze target<br />
quando si utilizzano ingre<strong>di</strong>enti processati o quando<br />
questi ingre<strong>di</strong>enti siano presenti in tracce. La strategia<br />
<strong>di</strong> preamplificazione, una tecnica <strong>di</strong> biologia<br />
molecolare che consente <strong>di</strong> aumentare la sensibilità<br />
della PCR Real time e conseguentemente il numero<br />
<strong>di</strong> target analizzabili in DNA estratti da alimenti<br />
lavorati 11 è stata applicata alla rilevazione <strong>di</strong> OGM<br />
in prodotti lavorati contenenti mais e/o soia con<br />
l’obiettivo <strong>di</strong> risolvere le problematiche su esposte.<br />
Materiali e meto<strong>di</strong><br />
Materiali<br />
Sono stati usati materiali <strong>di</strong> riferimento (Sigma-<br />
Aldrich St. Louis, UK) certificati dall’IRMM contenenti<br />
100% (ERM-BF421b) e 0% (ERM-BF421a) <strong>di</strong><br />
farina <strong>di</strong> <strong>patata</strong> EH92-527-1, 5% (ERM-BF412f), 1%<br />
(ERM-BF412d) e 0.1% (ERM-BF412b) <strong>di</strong> farina <strong>di</strong><br />
mais Bt11, 5% (ERM-BF410f), 1% (ERM-BF410d) e<br />
0.1% (ERM-BF410b) <strong>di</strong> farina <strong>di</strong> soia RR. I campioni<br />
<strong>di</strong> controllo (GeMSU09A, GeMSU09B, GeMSU22A<br />
e GeMSU22B) sono stati acquisiti presso il “Central<br />
Science Laboratory”, (UK) nell’ambito del circuito<br />
FAPAS (Proficiency testing schemes).<br />
Le matrici alimentari (farina <strong>di</strong> soia, polenta, snack<br />
salato, snack al mais, meren<strong>di</strong>na alla frutta, pane <strong>di</strong><br />
soia, latte <strong>di</strong> soia) sono state reperite in negozi locali,<br />
ad eccezione del mix shake e dei semi <strong>di</strong> soia<br />
tostati, forniti da un agente <strong>di</strong> ven<strong>di</strong>ta.<br />
Primer e sonde TaqMan<br />
Le sequenze dei primer e delle sonde TaqMan<br />
(ADH1, LE1, p35S, tNOS, mais Bt11, soia RR)<br />
sono quelle riportate nella norma UNI EN ISO<br />
21570:2005 12. Le sequenze dei primer e delle sonde<br />
specifiche dell’evento transgenico EH92-527-1<br />
sono suggerite dal protocollo <strong>di</strong> amplificazione<br />
proposto dal Community Reference Laboratory<br />
(CRL). I primer e le sonde TaqMan per l’amplificazione<br />
del gene endogeno UDP-glucose pyrophosphorylase<br />
(UGP-ase), per il gene co<strong>di</strong>ficante per<br />
il tRNA della leucina (tRNA leu) e per la sequenza<br />
co<strong>di</strong>ficante il terminatore del gene della nopalina<br />
sintasi (tNOS) sono stati <strong>di</strong>segnati impiegando il<br />
software Primer Express 5.0 (Applied Biosystems).<br />
Il primer St527-r1- tail è stato progettato “ad hoc”<br />
per la esecuzione della PCR overlapping.<br />
Per la progettazione dei primer specifici per tLeu,<br />
un gene plasti<strong>di</strong>ale altamente conservato nelle specie<br />
vegetali, sono state allineate sequenze <strong>di</strong> mais,<br />
soia, colza, grano, riso, cotone e <strong>patata</strong>. La presenza<br />
<strong>di</strong> <strong>di</strong>versi polimorfismi nella sequenza compresa tra<br />
i primer ha impe<strong>di</strong>to la progettazione <strong>di</strong> una sonda<br />
e pertanto l’amplificazione in PCR Real time <strong>di</strong> tLeu<br />
è stata effettuata impiegando, in alternativa, l’intercalante<br />
aspecifico SYBR Green.<br />
I primer e le sonde sono state preparate in parte<br />
dalla <strong>di</strong>tta Eurofins MWG Operon, in parte dalla <strong>di</strong>tta<br />
Life Technologies.<br />
Meto<strong>di</strong><br />
EstrazionE dEl dna<br />
Le matrici alimentari sono state polverizzate attraverso<br />
l’uso <strong>di</strong> mortaio e pestello in presenza <strong>di</strong><br />
azoto liquido. L’estrazione del DNA è stata effettuata<br />
impiegando un metodo basato sull’utilizzo del bromuro<br />
<strong>di</strong> cetil-trimetilammonio (CTAB) secondo il<br />
protocollo descritto in UNI EN ISO 21571:2005 13.<br />
Tutte le estrazioni sono state condotte in duplica-<br />
24 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012