tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab

MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):23-34
Progettazione e sintesi di DNA ricombinante
come standard per la determinazione quantitativa
di ingredienti geneticamente modificati in alimenti
A. CIRILLO, S. DEL GAUDIO, G. DI BERNARDO, F. GAGLIONE, U. GALDERISI, M. CIPOLLARO
L ’impiego di Organismi Geneticamente Modificati
(OGM) e di prodotti derivati da OGM nella catena
alimentare è sottoposto a precise regolamentazioni
in diversi paesi allo scopo di garantire la libertà
di scelta dei consumatori. L’Unione Europea
ha reso obbligatoria l’etichettatura dei cibi nei casi
in cui in essi sia presente una percentuale maggiore
dello 0.9% di ingredienti geneticamente modificati
(Reg.1829/2003) 1. Lo sviluppo di metodi affidabili
per la quantificazione di OGM assume pertanto un
ruolo sempre crescente.
L’amplificazione del DNA attraverso PCR real
time 2 (reazione a catena della polimerasi in tempo
reale) costituisce attualmente l’analisi di elezione
per la rilevazione di OGM nelle matrici alimentari
in quanto permette di sfruttare l’alta sensibilità
della metodica per ottenere la quantificazione del
contenuto di OGM 3.
Nelle reazioni di PCR real time, per la costruzione
delle curve di riferimento, vanno inclusi una serie
di calibratori che, di norma, sono costituiti dal DNA
estratto da farine ottenute dalle cultivar vegetali di
interesse, certificate dall’Istituto di Riferimento per
i Materiali e le Misure (IRMM, Belgio). L’impiego
di tali farine presenta, tuttavia, alcuni punti deboli:
innanzitutto la deperibilità dei materiali, il loro costo
e l’impossibilità di reperire materiale certificato
per tutti gli eventi geneticamente modificati (GM).
Come calibratori alternativi si possono impiegare
molecole di DNA ricombinante costituite da un vet-
Autore di contatto: G. Di Bernardo, Sezione di Biotecnologie e Biologia
Molecolare “A. Cascino”,Dipartimento di Medicina Sperimentale,
Seconda Università degli Studi di Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138
Napoli, Italia. E-mail: gianni.dibernardo@unina2.it
Sezione di Biotecnologie e Biologia Molecolare “A. Cascino”
Dipartimento di Medicina Sperimentale
Seconda Università degli Studi di Napoli, Napoli, Italia
tore plasmidico in cui sono integrate differenti sequenze
bersaglio quali le sequenze transgeniche e
quelle del gene endogeno di riferimento 4. L’impiego
di DNA ricombinante come standard rappresenta
un’interessante innovazione nell’ambito della certificazione
OGM. In letteratura sono, infatti, presenti
diversi lavori 4-7 che hanno come scopo la sintesi e
l’utilizzo di questi calibratori, testimoniando il notevole
interesse per questo argomento. Innanzitutto il
DNA plasmidico può essere prodotto in quantità illimitata
attraverso il clonaggio in cellule batteriche. Le
collaudate procedure di estrazione e conservazione
consentono di ottenere un DNA altamente purificato
e di poter costruire curve di calibrazione in un qualunque
intervallo di concentrazione. La possibilità
di effettuare un’analisi quantitativa anche nei casi
in cui non siano disponibili gli standard certificati
dall’IRMM costituisce il vantaggio maggiore offerto
da queste molecole.
In questo lavoro viene descritta la progettazione
e realizzazione di un calibratore plasmidico per la
quantificazione della patata EH92-527-1, unica varietà
di patata GM ammessa alla commercializzazione
in Europa, ottenuta dalla cultivar Prevalent, attraverso
l’introduzione del gene “GBSS” (granule bond
starch syntase protein), deputato alla produzione di
amilosio. La varietà contiene il 98% di amilopectina
ed il 2% di amilosio contro l’85% di amilopectina ed
il 15% di amilosio della cultivar tradizionale, pertan-
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