tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab

ONOFRI TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA
Figura 2. — A) Il chip POCI della Agilent. Ogni vetrino è composto da 4 array rappresentanti 44000 sequenze di patata, e può essere ibridato
con un campione diverso; B) la ripartizione in categorie funzionali mediante Gene Ontology delle sequenze rappresentate sul chip
POCI.
Il microarray POCI
In questo lavoro è stato utilizzato un oligo microarray
POCI 4x44K (Figura 2A), sviluppato dal PSGC
e commercializzato a partire dal marzo 2010 da Agilent.
È stato disegnato a partire da una collezione di
246.182 sequenze di patata disponibili nella banche
dati, e che sono state assemblate in 46345 unigenes.
Nei casi in cui la funzione putativa delle sequenze
presenti sul POCI sia nota, è disponibile un’annotazione
funzionale e una categorizzazione per processo
biologico (Figura 2B).
L’ibridazione dei campioni marcati sull’oligo glass
array è avvenuta in rotazione (10 rpm), a temperatura
controllata (65 °C) per 17 ore. I vetrini sono stati
lavati seguendo la procedura di lavaggio Agilent e
scannerizzati con lo scanner a doppio laser G2505B
(Agilent Technologies).
Per ogni esperimento è stato eseguito un replicato
tecnico. L’intensità di fluorescenza per ogni singola
sonda è stata rilevata, con l’intensità del segnale
che risulta proporzionale alla quantità di RNA legata
alla sonda. Per il nostro studio è stato impiegato il
protocollo one-color assay che prevede per ogni array
l’ibridazione di un unico campione marcato con
un solo fluorocromo; ciò permette di confrontare
l’espressione genica di un campione con quella di
vari campioni diversi e non con quella di un unico
campione come nel caso del two-color assay. Ogni
campione, tuttavia, è stato ibridato a due array di
due vetrini diversi, per valutare la riproducibilità ed
ottenere valori medi che tengano conto dell’eventuale
variabilità tecnica sui dati ottenuti.
Analisi dei dati
In seguito all’ibridazione e ai lavaggi, gli array
POCI sono stati scansionati con lo scanner Agilent a
doppio laser, versione B (G2505B, Agilent Technologies)
Le immagini sono state analizzate utilizzando
il software Feature Extraction (Agilent Technologies)
versione 9.5.
I dati grezzi sono stati processati con il software
Bioconductor (www.bioconductor.org 11) nell’ambiente
statistico R, applicando il metodo normexp
per la correzione del background e quantile come
metodo di normalizzazione tra gli array. Il pacchetto
LIMMA (LInear Models for MicroArray data) è stato
utilizzato per identificare i geni differenzialmente
espressi nelle varie condizioni, applicando un filtro
sul logaritmo in base 2 del Fold Change (>1 per i
geni up-regolati e ≤1 per i geni down-regolati) e sulla
statistica B corretta per i test multipli (>2).
I dati finali dell’intensità di fluorescenza di ogni
16 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012