tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab
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ONOFRI TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA<br />
Figura 2. — A) Il chip POCI della Agilent. Ogni vetrino è composto da 4 array rappresentanti 44000 sequenze <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, e può essere ibridato<br />
con un campione <strong>di</strong>verso; B) la ripartizione in categorie funzionali me<strong>di</strong>ante Gene Ontology delle sequenze rappresentate sul chip<br />
POCI.<br />
Il microarray POCI<br />
In questo lavoro è stato utilizzato un oligo microarray<br />
POCI 4x44K (Figura 2A), sviluppato dal PSGC<br />
e commercializzato a partire dal marzo 2010 da Agilent.<br />
È stato <strong>di</strong>segnato a partire da una collezione <strong>di</strong><br />
246.182 sequenze <strong>di</strong> <strong>patata</strong> <strong>di</strong>sponibili nella banche<br />
dati, e che sono state assemblate in 46345 unigenes.<br />
Nei casi in cui la funzione putativa delle sequenze<br />
presenti sul POCI sia nota, è <strong>di</strong>sponibile un’annotazione<br />
funzionale e una categorizzazione per processo<br />
biologico (Figura 2B).<br />
L’ibridazione dei campioni marcati sull’oligo glass<br />
array è avvenuta in rotazione (10 rpm), a temperatura<br />
controllata (65 °C) per 17 ore. I vetrini sono stati<br />
lavati seguendo la procedura <strong>di</strong> lavaggio Agilent e<br />
scannerizzati con lo scanner a doppio laser G2505B<br />
(Agilent Technologies).<br />
Per ogni esperimento è stato eseguito un replicato<br />
tecnico. L’intensità <strong>di</strong> fluorescenza per ogni singola<br />
sonda è stata rilevata, con l’intensità del segnale<br />
che risulta proporzionale alla quantità <strong>di</strong> RNA legata<br />
alla sonda. Per il nostro stu<strong>di</strong>o è stato impiegato il<br />
protocollo one-color assay che prevede per ogni array<br />
l’ibridazione <strong>di</strong> un unico campione marcato con<br />
un solo fluorocromo; ciò permette <strong>di</strong> confrontare<br />
l’espressione genica <strong>di</strong> un campione con quella <strong>di</strong><br />
vari campioni <strong>di</strong>versi e non con quella <strong>di</strong> un unico<br />
campione come nel caso del two-color assay. Ogni<br />
campione, tuttavia, è stato ibridato a due array <strong>di</strong><br />
due vetrini <strong>di</strong>versi, per valutare la riproducibilità ed<br />
ottenere valori me<strong>di</strong> che tengano conto dell’eventuale<br />
variabilità tecnica sui dati ottenuti.<br />
Analisi dei dati<br />
In seguito all’ibridazione e ai lavaggi, gli array<br />
POCI sono stati scansionati con lo scanner Agilent a<br />
doppio laser, versione B (G2505B, Agilent Technologies)<br />
Le immagini sono state analizzate utilizzando<br />
il software Feature Extraction (Agilent Technologies)<br />
versione 9.5.<br />
I dati grezzi sono stati processati con il software<br />
Bioconductor (www.bioconductor.org 11) nell’ambiente<br />
statistico R, applicando il metodo normexp<br />
per la correzione del background e quantile come<br />
metodo <strong>di</strong> normalizzazione tra gli array. Il pacchetto<br />
LIMMA (LInear Models for MicroArray data) è stato<br />
utilizzato per identificare i geni <strong>di</strong>fferenzialmente<br />
espressi nelle varie con<strong>di</strong>zioni, applicando un filtro<br />
sul logaritmo in base 2 del Fold Change (>1 per i<br />
geni up-regolati e ≤1 per i geni down-regolati) e sulla<br />
statistica B corretta per i test multipli (>2).<br />
I dati finali dell’intensità <strong>di</strong> fluorescenza <strong>di</strong> ogni<br />
16 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012