tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab
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ONOFRI TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA<br />
me<strong>di</strong>ante le quali si possono fissare a supporti soli<strong>di</strong><br />
brevi segmenti <strong>di</strong> DNA (oligo o cDNA), il principale<br />
progresso che ha permesso il <strong>di</strong>ffondersi dei microarray<br />
come strumento <strong>di</strong> ricerca e <strong>di</strong> analisi, è la <strong>di</strong>sponibilità<br />
<strong>di</strong> enormi quantità <strong>di</strong> informazioni <strong>di</strong> sequenze<br />
genomiche; senza queste recenti acquisizioni, non<br />
sarebbe possibile infatti la sintesi né <strong>di</strong> cDNA specifico<br />
per ogni dato gene, né <strong>di</strong> oligonucleoti<strong>di</strong> con il<br />
necessario grado <strong>di</strong> specificità. Oggi sono <strong>di</strong>sponibili<br />
numerosi database de<strong>di</strong>cati, come quello gestito dal<br />
PSGC (www.potatogenome.net) o quelli della Cornell<br />
University (www.sgn.cornell.edu/) o della Wageningen<br />
University (https://cbsgdbase.wur.nl/).<br />
In seguito alla <strong>di</strong>sponibilità <strong>di</strong> un crescente numero<br />
<strong>di</strong> genomi <strong>di</strong> <strong>di</strong>versi organismi interamente<br />
sequenziati, molte aziende biotech hanno introdotto<br />
sul mercato chip commerciali, contenenti l’intero<br />
repertorio <strong>di</strong> geni <strong>di</strong> <strong>di</strong>versi organismi. Fra questi, il<br />
primo organismo vegetale interamente sequenziato<br />
(Arabidopsis thaliana) e <strong>di</strong> cui è stato prodotto un<br />
microarray commerciale (ATH1, da parte della Affymetryx)<br />
è stato presto seguito da altri, man mano<br />
che le tecnologie <strong>di</strong> nuova generazione (NGS) rendevano<br />
il sequenziamento massiccio sempre più efficiente,<br />
economico ed abbordabile anche da laboratori<br />
dotati <strong>di</strong> me<strong>di</strong>o budget.<br />
Applicazione dei microarray alla<br />
genomica funzionale <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
Già negli anni precedenti al completamento della<br />
prima sequenza genomica <strong>di</strong> <strong>patata</strong> (2010), l’estesa<br />
sintenia fra i genomi delle due più importanti<br />
Solanacee aveva consentito ai ricercatori <strong>di</strong> utilizzare<br />
alcune risorse sviluppate in seguito al sequenziamento<br />
del genoma <strong>di</strong> pomodoro, già portato a<br />
termine. Uno <strong>di</strong> questi strumenti, commercializzato<br />
da Affymetryx, il Gene Chip Tomato Array, contenente<br />
10.000 geni espressi ed annotati <strong>di</strong> pomodoro,<br />
è stato utilizzato dal gruppo del CRA.-CIN (Centro<br />
<strong>di</strong> Ricerca per le Colture Industriali) <strong>di</strong> Bologna che<br />
lavorava sul fenomeno dell’addolcimento dei tuberi<br />
in seguito a frigoconservazione, elaborando un<br />
algoritmo che era in grado <strong>di</strong> correggere in parte i<br />
mismatch <strong>di</strong> ibridazione dovuti alle <strong>di</strong>fferenze fra le<br />
sequenze <strong>di</strong> pomodoro e quelle <strong>di</strong> <strong>patata</strong> 7.<br />
L’aumento esponenziale del numero <strong>di</strong> sequenze<br />
omologhe <strong>di</strong> <strong>patata</strong> presenti nelle banche dati internazionali,<br />
ha portato tuttavia ben presto all’avvento<br />
<strong>di</strong> microarray omologhi, cioè costituiti da sequenze<br />
effettivamente <strong>di</strong> S. tuberosum, per stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> geno<strong>tipizzazione</strong><br />
e <strong>di</strong> genomica funzionale, utilizzando entrambe<br />
le tipologie <strong>di</strong> chip (a cDNA e ad oligo), a partire<br />
dal 2005. I primi microarray <strong>di</strong> <strong>patata</strong> sono stati a<br />
cDNA, inizialmente con poche migliaia <strong>di</strong> feature (le<br />
sequenze target fissate al vetrino e sulle quali avviene<br />
l’ibridazione), e miravano ad in<strong>di</strong>viduare i geni <strong>di</strong><br />
<strong>patata</strong> <strong>di</strong>fferenzialmente espressi durante lo sviluppo<br />
dei tuberi 8. Successivamente, per l’analisi degli<br />
eventi trascrizionali associati alla formazione del tubero,<br />
è stato utilizzato un’evoluzione <strong>di</strong> questo primo<br />
chip, un microarray ad oligo 60-mer, complementari<br />
a 44000 sequenze unigene <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, array che è stato<br />
denominato POCI (Potato Oligo Chip Initiative 9).<br />
Anche un gruppo inglese dello Scottish Crop Research<br />
Institute (SCRI), parte del consorzio PSGC, ha<br />
utilizzato il microarray POCI per un’analisi genomewide<br />
dei geni che influenzano la qualità dei tuberi,<br />
ed in particolare il sapore, la tessitura, il contenuto<br />
<strong>di</strong> carotenoi<strong>di</strong> e la <strong>precoci</strong>tà <strong>di</strong> maturazione 10. In<br />
questo lavoro, sono stati comparati due genotipi <strong>di</strong><br />
S. tuberosum appartenenti al gruppo Phureja, e due<br />
al gruppo Tuberosum, ottenuti in campo in due <strong>di</strong>verse<br />
annate. L’obiettivo era attribuire ai geni del<br />
gruppo Phureja o Tuberosum che mostravano maggiore<br />
variazione nel confronto, un possibile ruolo<br />
nel determinismo dei caratteri associabili alla qualità.<br />
In questo lavoro nella prima annata, 2075 geni<br />
risultarono significativamente regolati (meno del 5%<br />
delle sequenze rappresentate sul chip), e nella seconda<br />
questo numero scese a 1386 (circa il 3%).<br />
Questi dati mettono in evidenza la grande variazione<br />
che si riscontra quando si esamina il trascrittoma<br />
<strong>di</strong> materiale maturato in con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> pieno campo,<br />
e il fortissimo effetto dell’annata pur in presenza <strong>di</strong><br />
materiale geneticamente omogeneo. I geni consistentemente<br />
up-regolati nel gruppo Phureja rispetto<br />
al Tuberosum, risultarono 309, e 555 quelli down-regolati.<br />
Questi importanti dati portano a considerare<br />
quanto relativamente limitato sia il numero <strong>di</strong> geni<br />
che <strong>di</strong>stinguono due gruppi <strong>di</strong> accessioni (Phureja e<br />
Tuberosum), nonostante le gran<strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenze morfologiche<br />
e funzionali che le caratterizzano.<br />
Il lavoro che viene qui presentato, svolto nell’ambito<br />
del progetto TIPIPAPA (<strong>tipizzazione</strong> e <strong>caratterizzazione</strong><br />
<strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>precoci</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong> con l’impiego <strong>di</strong><br />
tecniche molecolari e spettroscopiche) ha cercato <strong>di</strong><br />
applicare per la prima volta un potente strumento per<br />
lo stu<strong>di</strong>o della trascrittomica della <strong>patata</strong>, il microarray<br />
POCI da circa 44000 sonde, alla <strong>caratterizzazione</strong><br />
del luogo <strong>di</strong> coltivazione (località e regione) <strong>di</strong> alcune<br />
14 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012