tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab

ONOFRI TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA
pubblica nel 2010 la prima sequenza del genoma
di patata 4. Poiché sia il breeding sia l’analisi genetica
della patata sono rese difficili dal fatto che
per lo più le varietà commerciali sono tetraploidi
di recente origine, che la patata è una specie altamente
eterozigote e che tollera male l’inbreeding, il
PGSC ha deciso di ottenere le sequenze genomiche
a partire da materiali diploidi, in particolare ottenendo
la gran parte delle sequenze da un’accessione
doppio monoploide (DM) ottenuta tramite coltura di
antere e successivo raddoppiamento cromosomico
(e quindi omozigote a tutti i loci), appartenente al
gruppo Phureja di S. tuberosum, e successivamente
integrando in questa bozza sequenze ottenute da
una breeding line eterozigote ma anch’essa diplode,
e appartenente al gruppo tuberosum.
Infine, al lavoro di sequenziamento del genoma,
è stato affiancata, ed è in continuo sviluppo, un’indagine
di “deep transcriptome sequencing”: 31 Gb
di sequenziamento del trascrittoma, il cui RNA proveniva
da varie accessioni, e da tutti i tipi di tessuto,
stadi di sviluppo e condizioni ambientali di
stress biotico e abiotico. Ne sono risultati circa 39000
geni codificanti per proteine, i geni cioè che maggiormente
contribuiscono ai fenotipi cui sono particolarmente
interessati i breeder, presiedendo per
esempio alla sintesi di molecole che influenzano la
qualità dei tuberi quali glicoalcaloidi o carotenoidi;
oppure proteine che mediano resistenze a fattori di
stress, o strutturali, coinvolte nella consistenza, tessitura
e comportamento alla cottura del tubero, e così
via. Un dato interessante che è emerso dal sequenziamento
del trascrittoma di patata, è che oltre 9000
geni, cioè il 25% del totale, esibisce il fenomeno
dello “splicing alternativo”, in seguito al quale uno
stesso gene codifica per due o più isoforme proteiche.
Considerando che questi dati sono stati ottenuti
su genomi diploidi, si può supporre che le varietà
tetraploidi di patata, e le specie selvatiche di Solanum,
contengano un tasso di variabilità genetica
ancora sconosciuto e non sfruttato, ben al di là del
mero numero di geni identificati.
Si può prevedere che saranno moltissime le ricadute
del recente completamento di una bozza della
sequenza completa del genoma di patata 5. Oltre alla
possibilità di individuare per molti geni di rilevanza
agronomica varianti più o meno interessanti nel germoplasma
di Solanum, si potrà cominciare a comprendere
la base di caratteri di grande importanza
ma che sono fino ad oggi sfuggiti in parte all’analisi
genetica tradizionale a causa del loro determini-
smo multifattoriale. Si può inoltre prevedere che la
disponibilità della sequenza genomica della patata
porterà, ed in parte ha già portato, allo sviluppo di
strumenti nuovi per la ricerca e per il breeding.
Fra le ricadute della conoscenza della sequenza
del genoma di patata, c’è certamente poi l’identificazione
dei geni che codificano per proteine enzimatiche
o strutturali, della loro variazione nel germoplasma,
e la possibilità di studiarne il funzionamento in
relazione a situazioni specifiche della pianta, quale
lo stadio di sviluppo, l’organo, le condizioni ambientali,
l’attacco di patogeni, ecc. Questo immenso
campo di studi è oggi più alla portata dei ricercatori,
grazie alla disponibilità di “microarrays” sia commerciali
che ottenibili “su misura” da alcune fra le principali
aziende biotecnologiche mondiali.
I microarrays, strumento di
analisi del trascrittoma
I microarrays sono strumenti analitici high-throughput
(cioè che generano grandi quantità di informazioni
in maniera automatizzabile e informatizzata,
attraverso procedure spesso robotizzabili) e
genome-wide (cioè capaci di estrarre dati dall’intero
complemento di geni, o da una sostanziale frazione
di esso), la cui origine risale alla prima metà degli
anni ’90, quando furono sviluppati da Mark Schena
et al. alla Stanford University 6.
Si possono definire come matrici ordinate (ad es.
organizzato in colonne e file) di elementi microscopici
(ad es. brevi segmenti di DNA) posizionati su
un substrato solido e planare (ad es. vetrini), e che
consentono il binding specifico di geni o prodotti
genici (es. mRNA).
I primi esperimenti con microarray per lo studio
dell’espressione genica utilizzavano spot a cDNA, tipicamente
di lunghezza 500-2000 bp, che consente
forti segnali di ibridazione data la estesa complementarietà
con l’mRNA-sonda in soluzione marcato
con un fluorocromo. I microarray a oligonucleotidi,
invece, trovano applicazioni oltre che negli studi di
profiling dell’espressione genica, anche nella genotipizzazione.
Gli oligonucleotidi che vengono fissati
al vetrino sono di 15-70 bp, e ottenuti mediante sintesi
chimica; il segnale di ibridazione ha alta intensità
e specificità dopo ibridazione all’mRNA-sonda. Il
principio di funzionamento dei chip genici è schematizzato
in Figura 1.
Oltre allo sviluppo di tecniche fotolitografiche,
12 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012