tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata ... - PbgLab
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VOLUME 24 - SUPPL 1 to No. 1 - MARCH 2012<br />
TIPIZZAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI VARIETÀ PRECOCI<br />
DI PATATA CON L’IMPIEGO DI TECNICHE MOLECOLARI<br />
E SPETTROSCOPICHE
MINERVA BIOTECNOLOGICA<br />
Vol. 24 Marzo 2012 Suppl. 1 al Numero 1<br />
1<br />
Presentazione<br />
Carputo D.<br />
TIPIZZAZIONE E CARATTERIZZAZIONE<br />
DI VARIETÀ PRECOCI DI PATATA<br />
CON L’IMPIEGO DI TECNICHE<br />
MOLECOLARI E SPETTROSCOPICHE<br />
INDICE<br />
3<br />
ARTICOLI ORIGINALI<br />
Utilizzazione <strong>di</strong> marcatori molecolari SSR e AFLP per l’identificazione varietale in <strong>patata</strong><br />
Villano C., Aversano R., Frusciante L., Garramone R., Iorizzo M., Carputo D.<br />
11<br />
Strumenti <strong>di</strong> genomica funzionale per la <strong>tipizzazione</strong> dell’origine <strong>di</strong> coltivazione della <strong>patata</strong><br />
Onofri C., Pacifico D., Ostano P., Mello-Grand M., Ghimenti C., Parisi B., Mandolino G.<br />
23<br />
Progettazione e sintesi <strong>di</strong> DNA ricombinante come standard per la determinazione quantitativa <strong>di</strong> ingre<strong>di</strong>enti<br />
geneticamente mo<strong>di</strong>ficati in alimenti<br />
Cirillo A., Del Gau<strong>di</strong>o S., Di Bernardo G., Gaglione F., Galderisi U., Cipollaro M.<br />
35<br />
La proteomica quale strumento <strong>di</strong> <strong>tipizzazione</strong> <strong>di</strong> cultivar <strong>precoci</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
Scelza R., Russo F., Gianfreda L., Rao M. A.<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA VII
INDICE<br />
43<br />
Stu<strong>di</strong>o dei metaboliti secondari <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>precoci</strong> <strong>di</strong> Solanum tuberosum<br />
Lepore L., Pesca M., De Tommasi N., Carputo D., Dal Piaz F.<br />
51<br />
Definizione <strong>di</strong> una firma “geochimico-mineralogica” dei suoli destinati alla produzione della <strong>patata</strong> precoce<br />
Vingiani S., Zampella M., Minieri L., Terribile F., Adamo P.<br />
61<br />
Indagine sullo stato fitosanitario delle produzioni <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>precoci</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong> da consumo<br />
Sigillo L., Serratore G., Spina V., Senape V., Bravi R.<br />
71<br />
Costi e benefici <strong>di</strong> un programma <strong>di</strong> tracciabilità per la filiera della <strong>patata</strong> precoce italiana<br />
Lombar<strong>di</strong> P., Caracciolo F., Cicia G., Cembalo L., Colantuoni F., D’amico M., Del Giu<strong>di</strong>ce T., Maraglino T., Menna C., Panico T.,<br />
Sannino G., Tosco D.<br />
VIII MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):1<br />
Presentazione<br />
D. CARPUTO<br />
Dipartimento <strong>di</strong> Scienze del Suolo, della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali<br />
Università degli Stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> Napoli Federico II, Napoli, Italia<br />
La tipicizzazione delle produzioni ha assunto oramai il ruolo <strong>di</strong> fattore produttivo vero e proprio, in<br />
quanto strumento per prevenire le fro<strong>di</strong>, garantire la sicurezza e valorizzare le produzioni. Essa consente<br />
<strong>di</strong> guidare il consumatore nelle scelte, <strong>di</strong> fornire un riferimento preciso sulla provenienza e/o sulla<br />
composizione <strong>di</strong> ciò che è acquistato, <strong>di</strong> effettuare azioni <strong>di</strong> prevenzione <strong>di</strong> tipo sanitario, <strong>di</strong> conoscere i movimenti<br />
commerciali e <strong>di</strong> avere riferimenti precisi sull’origine dei prodotti movimentati. Con il regolamento<br />
178/2002, l’Unione Europea ha stabilito in maniera chiara i principi e i requisiti generali della legislazione<br />
alimentare e ha altresì definito i concetti <strong>di</strong> tracciabilità e rintracciabilità. In coerenza con le politiche<br />
europee e nazionali, nel 2007 il MiPAAF ha finanziato il Progetto speciale triennale “Tipicizzazione e<br />
<strong>caratterizzazione</strong> <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>precoci</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong> con l’impiego <strong>di</strong> tecniche molecolari e spettroscopiche” (TIPI-<br />
PAPA). L’interesse delle istituzioni nazionali nei confronti della <strong>patata</strong>, e in particolare <strong>di</strong> quella precoceextrastagionale<br />
a ciclo vernino-primaverile, deriva dalla necessità <strong>di</strong> valorizzare e proteggere questo tipo <strong>di</strong><br />
produzione, che può essere molto remunerativo.<br />
Questo supplemento <strong>di</strong> Minerva Biotecnologica propone una sintesi dei risultati più significativi ottenuti<br />
dagli otto gruppi <strong>di</strong> ricerca che, con un approccio multi<strong>di</strong>sciplinare, hanno operato nell’ambito del Progetto<br />
TIPIPAPA. Per il raggiungimento dei suoi obiettivi il progetto si è avvalso <strong>di</strong> metodologie molecolari, proteomiche,<br />
chimiche e biochimiche avanzate che hanno consentito non solo la messa a punto <strong>di</strong> un sistema<br />
<strong>di</strong> tracciabilità integrato, affidabile e sicuro, ma anche la determinazione <strong>di</strong> importanti aspetti qualitativi<br />
legati alla produzione pataticola. Il progetto ha previsto anche lo screening dello stato fitopatologico degli<br />
areali <strong>di</strong> coltivazione tipici delle tre regioni nonché lo stu<strong>di</strong>o economico dei costi-benefici <strong>di</strong> un sistema <strong>di</strong><br />
tracciabilità nella filiera della <strong>patata</strong> extra-stagionale. Nel suo insieme questa raccolta <strong>di</strong> contributi costituisce<br />
un utile riferimento per tutti coloro che, da <strong>di</strong>fferenti punti <strong>di</strong> vista (ricerca sperimentale, commercializzazione,<br />
prevenzione fro<strong>di</strong>, etc.), operano nel settore. Dai risultati emerge fortemente l’opportunità <strong>di</strong><br />
approfon<strong>di</strong>re in futuro i meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> tracciabilità proposti allargandone l’impiego anche ad altre colture. Le<br />
strategie e gli approcci utilizzati nelle ricerche qui presentate potranno infatti essere estesi anche ad altre<br />
colture per le quali è necessario salvaguardare la territorialità, la tra<strong>di</strong>zionalità e la tipicità italiana.<br />
Nel presentare questo supplemento è d’obbligo ringraziare tutti quelli che hanno contribuito alla realizzazione<br />
<strong>di</strong> questo progetto: il MiPAAF, che ha finanziato TIPIPAPA; i Dr. A. Ierna e L. Tedone, che hanno<br />
collaborato alle attività <strong>di</strong> campionamento in Sicilia e in Puglia; le aziende agricole, che hanno fornito informazioni<br />
e i campioni <strong>di</strong> tuberi e suolo; un ringraziamento particolare, infine, ai tanti giovani ricercatori<br />
che hanno preso parte alle attività sperimentali delle singole unità <strong>di</strong> ricerca.<br />
Il Coor<strong>di</strong>natore del Progetto<br />
Domenico Carputo<br />
Autore corrisponderei contatto: D. Carputo, Dipartimento <strong>di</strong> Scienze del Suolo, della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Università<br />
degli Stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> Napoli Federico II, (DiSSPAPA), Via Università 100, 80055 Portici, Napoli, Italia. E-mail: carputo@unina.it<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 1
ARTICOLI ORIGINALI<br />
MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):3-10<br />
C. VILLANO, R. AVERSANO, L. FRUSCIANTE, R. GARRAMONE, M. IORIZZO, D. CARPUTO<br />
Obiettivo. La tracciabilità dei prodotti alimentari tramite<br />
la <strong>caratterizzazione</strong> varietale delle produzioni<br />
agricole è uno degli aspetti <strong>di</strong> maggior rilievo nel campo<br />
della valorizzazione del patrimonio agroalimentare<br />
italiano e della tutela del consumatore. Le moderne<br />
tecniche <strong>di</strong> biologia molecolare offrono strumenti analitici<br />
<strong>di</strong> grande efficacia nell’identificazione varietale.<br />
Tra i prodotti caratteristici dell’agricoltura italiana, la<br />
<strong>patata</strong> precoce, coltivata tipicamente in Campania, Puglia,<br />
Sicilia e Sardegna, riveste un ruolo <strong>di</strong> primaria<br />
importanza, ma è oggetto <strong>di</strong> fro<strong>di</strong> alimentari tramite il<br />
supplemento <strong>di</strong> materiale proveniente dall’Africa settentrionale<br />
o da Cipro. L’obiettivo <strong>di</strong> questa ricerca è<br />
stato l’ottenimento <strong>di</strong> un fingerprinting molecolare <strong>di</strong><br />
<strong>varietà</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong> comunemente utilizzate per la produzione<br />
extrastagionale.<br />
Meto<strong>di</strong>. Il materiale genomico è stato estratto dai tuberi<br />
<strong>di</strong> 22 <strong>varietà</strong>, raccolte nelle zone <strong>di</strong> origine, e analizzato<br />
con otto microsatelliti e cinque combinazioni<br />
<strong>di</strong> primer AFLP.<br />
Risultati. Dal confronto dei profili allelici è risultato<br />
che il numero minimo <strong>di</strong> loci SSR necessario per <strong>di</strong>stinguere<br />
le <strong>varietà</strong> analizzate è stato cinque (STI0032,<br />
STG0001, STI0012, STM5127 e STM1106). L’analisi<br />
AFLP, invece, ha permesso <strong>di</strong> in<strong>di</strong>viduare 83 frammenti<br />
specifici per le quattro <strong>varietà</strong> maggiormente coltivate<br />
nei cicli extrastagionali e, in particolare, 34 per<br />
Sieglinde, 23 per Spunta, 15 per Elvira e 11 per Agria.<br />
Conclusione. In conclusione, è stato possibile sviluppare<br />
nuovi marcatori molecolari specifici <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>di</strong><br />
<strong>patata</strong> precoce, utili per la tracciabilità molecolare e<br />
per garantire la veri<strong>di</strong>cità delle in<strong>di</strong>cazioni presenti<br />
sulle etichette dei prodotti.<br />
Parole chiave: Microsatelliti - Tracciabilità - Fingerprinting.<br />
Autore <strong>di</strong> contatto: D. Carputo, Dipartimento <strong>di</strong> Scienze del Suolo,<br />
della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Università degli<br />
Stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> Napoli Federico II, (DiSSPAPA), Via Università 100, 80055 Portici,<br />
Napoli, Italia. E-mail: carputo@unina.it<br />
Utilizzazione <strong>di</strong> marcatori molecolari SSR e AFLP<br />
per l’identificazione varietale in <strong>patata</strong><br />
Dipartimento <strong>di</strong> Scienze del Suolo, della Pianta,<br />
dell’Ambiente e delle Produzioni Animali<br />
Università degli Stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> Napoli Federico II, Napoli, Italia<br />
I n un contesto <strong>di</strong> produzioni standar<strong>di</strong>zzate per<br />
mercati sempre più <strong>di</strong> massa e globali, l’agricoltura<br />
è <strong>di</strong>ventata “anonima” e il consumatore non<br />
conosce né l’origine degli alimenti, né le imprese<br />
produttrici. La creazione <strong>di</strong> marchi <strong>di</strong> qualità da parte<br />
dell’Unione Europea si è rivelata uno strumento<br />
efficace per proteggere il patrimonio agroalimentare<br />
italiano e tutelare il consumatore nella conoscenza<br />
dei prodotti tipici con forte valenza territoriale<br />
e grande tra<strong>di</strong>zionalità. La tipicizzazione delle produzioni<br />
agricole, in tal senso, è uno degli aspetti <strong>di</strong><br />
maggior rilievo nel campo della valorizzazione dei<br />
prodotti alimentari, nonché della prevenzione delle<br />
fro<strong>di</strong> e della sicurezza alimentare 1. Essa è in<strong>di</strong>spensabile<br />
per qualsiasi politica <strong>di</strong> qualità, dalle produzioni<br />
a denominazione d’origine ai prodotti tra<strong>di</strong>zionali.<br />
Le produzioni <strong>di</strong> Qualità sono controllate a<br />
livello comunitario e nazionale. Fra le più importanti<br />
si possono ricordare le In<strong>di</strong>cazioni Geografiche<br />
(IGP) e le Denominazioni <strong>di</strong> Origine Protetta (DOP),<br />
regolamentate dal reg. CEE 2081/92, le Attestazioni<br />
<strong>di</strong> Specificità dal reg. CEE 2082/92 e i <strong>di</strong>sciplinari<br />
DOC/DOCG/IGT. L’Unione Europea ha messo in<br />
atto numerose iniziative finalizzate al miglioramento<br />
della tracciabilità delle produzioni agroalimentari.<br />
Le moderne tecniche <strong>di</strong> biologia molecolare offrono<br />
strumenti analitici <strong>di</strong> grande efficacia nell’identificazione<br />
<strong>di</strong> <strong>varietà</strong> ai fini della tracciabilità. In particolare,<br />
le tecniche basate sull’analisi del DNA presentano<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 3
VILLANO UTILIZZAZIONE DI MARCATORI MOLECOLARI SSR E AFLP PER L’IDENTIFICAZIONE VARIETALE IN PATATA<br />
molti vantaggi rispetto ai meto<strong>di</strong> tra<strong>di</strong>zionali basati<br />
sulla valutazione <strong>di</strong> caratteri morfologici e biochimici,<br />
soggetti all’influenza delle con<strong>di</strong>zioni ambientali<br />
e utilizzabili solo su prodotti non processati. Esse<br />
consentono <strong>di</strong> identificare i cosiddetti marcatori<br />
molecolari, sequenze <strong>di</strong> DNA che caratterizzano<br />
in modo inequivocabile un organismo. Basandosi<br />
<strong>di</strong>rettamente su <strong>di</strong>fferenze (polimorfismi) nella sequenza<br />
nucleoti<strong>di</strong>ca del DNA, i marcatori molecolari<br />
non presentano effetti epistatici o pleiotropici e<br />
non soffrono l’interferenza dell’ambiente. Essi sono<br />
<strong>di</strong>stribuiti lungo tutto il genoma e ciò permette <strong>di</strong><br />
<strong>di</strong>stinguere anche in<strong>di</strong>vidui geneticamente simili e<br />
fenotipicamente in<strong>di</strong>stinguibili. La maggior parte <strong>di</strong><br />
essi è basata sull’uso della tecnica denominata polymerase<br />
chain reaction (PCR), che consente <strong>di</strong> amplificare<br />
milioni <strong>di</strong> volte, e in poche ore, sequenze<br />
specifiche <strong>di</strong> DNA. La PCR è un processo esponenziale<br />
molto sensibile; generalmente un quantitativo<br />
necessario <strong>di</strong> prodotto amplificato è ottenuto dopo<br />
soli 30 cicli <strong>di</strong> amplificazione. Tra i marcatori maggiormente<br />
impiegati figurano gli AFLP (Amplified<br />
Fragment Length Polymorphism) e gli SSR (Simple<br />
Sequence Repeat), vantaggiosi nella <strong>caratterizzazione</strong><br />
varietale (fingerprinting) e in<strong>di</strong>viduale (genotyping)<br />
grazie all’elevato grado <strong>di</strong> polimorfismo in<br />
grado <strong>di</strong> essere rilevato da entrambi 2.<br />
Tra i prodotti dell’agricoltura italiana, la <strong>patata</strong> riveste<br />
un ruolo <strong>di</strong> primaria importanza. In Italia, grazie<br />
alle con<strong>di</strong>zioni ambientali riscontrabili in alcune<br />
aree costiere meri<strong>di</strong>onali, è possibile usufruire<br />
<strong>di</strong> una produzione <strong>di</strong> tuberi pressoché ininterrotta<br />
durante tutto l’anno <strong>di</strong>fferenziata in tre raccolti: <strong>patata</strong><br />
comune (da giugno a ottobre) e <strong>patata</strong> extrastagionale,<br />
che può essere bisestile (da <strong>di</strong>cembre a<br />
febbraio) o precoce (da marzo a giugno). La quota<br />
principale del prodotto nazionale è costituita dalla<br />
<strong>patata</strong> comune, molto <strong>di</strong>ffusa nelle regioni settentrionali,<br />
mentre tipica coltura remunerativa dell’Italia<br />
meri<strong>di</strong>onale è la <strong>patata</strong> precoce, coltivata soprattutto<br />
in Campania, Sicilia, Puglia e Sardegna per le sue<br />
peculiari esigenze climatiche. Queste quattro regioni<br />
italiane coltivano il 93% della superficie nazionale<br />
e danno luogo al 94% della produzione complessiva<br />
<strong>di</strong> <strong>patata</strong> precoce. Dagli anni Ottanta a oggi,<br />
la Sicilia ha aumentato le proprie superfici coltivate<br />
<strong>di</strong> circa il 50%, <strong>di</strong>ventando la regione leader nella<br />
coltivazione della <strong>patata</strong> precoce con i suoi quasi<br />
10000 ha, pari a metà dell’intera superficie nazionale.<br />
Le produzioni unitarie hanno manifestato un<br />
rilevante incremento passando da 16 t/h del triennio<br />
1987-1989 alle 21 t/h dell’ultimo triennio 2007-2009<br />
(dati ISTAT). La produzione extrastagionale precoce<br />
è considerata un prodotto tipico con caratteristiche<br />
qualitative peculiari, come il basso contenuto <strong>di</strong> sostanza<br />
secca. Essa ha anche caratteristiche culinarie<br />
speciali che hanno indotto il Ministero delle politiche<br />
agricole alimentari e forestali a inserire alcune<br />
<strong>di</strong> queste produzioni in un elenco <strong>di</strong> prodotti tipici<br />
(http://www.politicheagricole.it/flex/cm/pages/ServeBLOB.php/L/IT/IDPagina/202),<br />
tra essi la <strong>patata</strong><br />
novella Sieglinde <strong>di</strong> Galatina, della quale è in corso<br />
il riconoscimento della DOP da parte della’Associazione<br />
produttori “Patate <strong>di</strong> Galatina” con la sede<br />
nel comune <strong>di</strong> Alliste (LE). L’esigenza dell’identificazione<br />
varietale nasce anche dal fatto che nella<br />
produzione nazionale talvolta è presente materiale<br />
proveniente dall’Africa settentrionale o da Cipro.<br />
Per valorizzare e, allo stesso tempo, salvaguardare<br />
la produzione nazionale occorre dunque definire<br />
un sistema <strong>di</strong> tracciabilità affidabile, ossia capace <strong>di</strong><br />
fornire al consumatore le informazioni sul prodotto<br />
acquistato, tutelando, allo stesso tempo, i produttori<br />
pertinenti ai Consorzi <strong>di</strong> produzione tipica.<br />
Obiettivo <strong>di</strong> questa ricerca è stato quello <strong>di</strong> effettuare<br />
un fingerprinting molecolare <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
comunemente utilizzate per la produzione precoce.<br />
I marcatori utilizzati hanno permesso l’identificazione<br />
<strong>di</strong> alleli polimorfici tra le <strong>varietà</strong> analizzate,<br />
confermando la vali<strong>di</strong>tà degli strumenti genomici<br />
nell’autenticazione varietale.<br />
Materiali e meto<strong>di</strong><br />
Materiale vegetale<br />
Sono state utilizzate ventidue <strong>varietà</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, delle<br />
quali sette (Agata, Agria, Antea, Arinda, Elvira,<br />
Sieglinde e Spunta) raccolte presso tre<strong>di</strong>ci aziende<br />
agricole site in Campania, Puglia e Sicilia (Italia) e<br />
quin<strong>di</strong>ci (Arrow, Asterix, Ba<strong>di</strong>a, Bartina, Dayana,<br />
Elfe, Frisia, Inova, Liseta, Marabel, Primura, Terragold,<br />
Veronie, Vival<strong>di</strong> e Volumia) provenienti dalla<br />
banca del germoplasma del DiSSPAPA.<br />
Isolamento del DNA e analisi molecolari<br />
Per ciascuna <strong>varietà</strong>, il DNA è stato estratto da tre<br />
repliche biologiche <strong>di</strong> tuberi a maturità fisiologica<br />
previamente liofilizzati, seguendo il protocollo <strong>di</strong><br />
Wulff et al. 3 Il DNA totale è stato analizzato con otto<br />
4 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
UTILIZZAZIONE DI MARCATORI MOLECOLARI SSR E AFLP PER L’IDENTIFICAZIONE VARIETALE IN PATATA VILLANO<br />
microsatelliti <strong>di</strong> tipo SSR (Simple Sequence Repeats)<br />
(Tabella I), scelti dalla banca dati SSR <strong>di</strong> <strong>patata</strong> del<br />
Centro Internazionale della Patata (http://research.<br />
cip.cgiar.org/confluence/<strong>di</strong>splay/IPD/SSR+Marker).<br />
La reazione PCR è stata realizzata in un volume finale<br />
<strong>di</strong> 20 μL contenente 20 mM Tris pH 8.4, 50 mM<br />
KCl, 1,6 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTPs, 0,4 μM primer<br />
forward marcato 5’-Hex (esa-cloro-6-carbossifluoresceina)<br />
o 5’-Fam (6-carbossifluoresceina), 0,4 μM<br />
primer reverse, 1 unità <strong>di</strong> Taq polimerasi (Invitrogen<br />
Life Technologies) e 30 ng <strong>di</strong> DNA. Il ciclo <strong>di</strong><br />
amplificazione PCR utilizzato è stato realizzato seguendo<br />
le seguenti tre fasi: 1) cinque cicli <strong>di</strong> tipo<br />
touch down (con decremento della temperatura <strong>di</strong><br />
annealing <strong>di</strong> 1°C ad ogni ciclo <strong>di</strong> amplificazione) a<br />
94 °C per 45s, Ta °C + 5 °C per 60s, 72 °C per 30s;<br />
2) 30 cicli <strong>di</strong> amplificazione a 94 °C per 45s, Ta °C<br />
per 60s, 72 °C per 30s; 3) una fase <strong>di</strong> elongazione<br />
finale a 72 °C per 20 min. I profili SSR sono stati<br />
analizzati tramite elettroforesi capillare con il Genetic<br />
Analizer 3130 (Applied Biosystems) utilizzando<br />
il programma Peak Scanner versione 1.0 (Applied<br />
Biosystems). Per verificare la riproducibilità dei dati<br />
ottenuti, tutti gli esperimenti sono stati compiuti in<br />
triplicato. Le <strong>varietà</strong> Agria, Elvira Sieglinde e Spunta<br />
sono state sottoposte a geno<strong>tipizzazione</strong> anche<br />
me<strong>di</strong>ante l’AFLP Analysis System-I (Invitrogen Life<br />
Technologies), cui sono state apportate alcune mo<strong>di</strong>fiche.<br />
Il DNA genomico (125 ng) è stato <strong>di</strong>gerito<br />
in una miscela <strong>di</strong> reazione contenente due enzimi <strong>di</strong><br />
restrizione EcoRI e MseI. La miscela è stata incubata<br />
a 37 °C per una notte e, in seguito, a 70 °C per 15<br />
min per l’inattivazione delle endonucleasi <strong>di</strong> restrizione.<br />
Il DNA <strong>di</strong>gerito è stato miscelato agli adattatori<br />
oligonucleoti<strong>di</strong>ci EcoRI e MseI e alla T4 DNA ligasi<br />
(Invotrogen Life Technologies), quin<strong>di</strong> incubato per<br />
2 ore a 20°C. Per la reazione <strong>di</strong> pre-amplificazione,<br />
20 μl <strong>di</strong> ligato <strong>di</strong>luito 1:10 e primer <strong>di</strong> pre-amplifica-<br />
zione EcoRI e MseI sono stati sottoposti al seguente<br />
programma <strong>di</strong> amplificazione: 20 cicli a 94 °C per<br />
30s, 56 °C per 60s e 72 °C per 60s. I prodotti della<br />
reazione sono stati <strong>di</strong>luiti 1:30 con TE 1x. Per l’amplificazione<br />
selettiva la miscela <strong>di</strong> componenti <strong>di</strong> reazione<br />
(20 µl) è stata preparata utilizzando i primer<br />
EcoRI marcati con i fluorocromi Hex o Fam, 4,5 µl<br />
<strong>di</strong> primer MseI, 1U <strong>di</strong> Taq polimerasi, 20 mM Tris pH<br />
8.4, 50 mM KCl, 1,6 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTPs e 5<br />
µl <strong>di</strong> DNA pre-amplificato <strong>di</strong>luito 1:30. La reazione<br />
<strong>di</strong> amplificazione PCR ha previsto 1 ciclo <strong>di</strong> 94 °C<br />
per 30s, 65 °C per 30s, 72 °C per 60s, 12 cicli <strong>di</strong> tipo<br />
touch-down con decremento della temperatura <strong>di</strong><br />
annealing <strong>di</strong> 0.6 °C per ciclo, e 23 cicli a 94 °C per<br />
30s, 56 °C per 60s e 72 °C per 60s. Il prodotto della<br />
reazione d’amplificazione è stato <strong>di</strong>luito con un fattore<br />
<strong>di</strong> <strong>di</strong>luizione 1:5 e miscelato con il GeneScan<br />
500 ROX Size Standard (Applied Biosystem). Complessivamente,<br />
le amplificazioni selettive sono state<br />
condotte con cinque combinazioni <strong>di</strong> primer Eco-<br />
RI e MseI: E-ACT/M-CAT; E-ACT/M-CTT; E-AGC/M-<br />
CTT; E-AGC/M-CTA e E-AGC/M-CTG. I profili AFLP<br />
sono stati analizzati tramite elettroforesi capillare<br />
con Genetic Analizer 3130 (Applied Biosystems)<br />
utilizzando il programma Gene Mapper versione 4.0<br />
(Applied Biosystems).<br />
Analisi dei dati<br />
Tutte le <strong>varietà</strong> che hanno mostrato un unico allele<br />
SSR amplificato sono state considerate omozigoti<br />
per il locus corrispondente. Per ogni microsatellite<br />
sono stati in<strong>di</strong>viduati il numero <strong>di</strong> alleli effettivi,<br />
l’eterozigosità e il potere <strong>di</strong> <strong>di</strong>scriminazione. In particolare,<br />
l’eterozigosità (H) è stata calcolata me<strong>di</strong>ante<br />
la formula Neis 4:<br />
H=n*(n−1)*(1−∑P 2) i<br />
dove Pi è la frequenza dell’allele i e n è il numero <strong>di</strong><br />
Tabella I.
VILLANO UTILIZZAZIONE DI MARCATORI MOLECOLARI SSR E AFLP PER L’IDENTIFICAZIONE VARIETALE IN PATATA<br />
alleli. Il potere <strong>di</strong> <strong>di</strong>scriminazione (PD) per ogni locus<br />
è stato calcolato me<strong>di</strong>ante la seguente formula:<br />
PD=1−∑P i 2<br />
dove P i è la frequenza del genotipo i. I dati ottenuti<br />
dalla lettura dei profili elettroforetici sono stati<br />
immessi in una matrice binaria riportante per<br />
ciascun campione, l’assenza (0) e la presenza (1)<br />
dell’allele. Per la valutazione della <strong>di</strong>stanza genetica<br />
è stato utilizzato il coefficiente <strong>di</strong> Dice. La matrice<br />
<strong>di</strong> similarità è stata analizzata con il metodo UPG-<br />
MA (Unweighted Paired Group Method with Arithmetic<br />
mean) me<strong>di</strong>ante il software NTSYS-PC 5 e il<br />
dendrogramma corrispondente. Al fine <strong>di</strong> effettuare<br />
un’analisi esaustiva delle relazioni tassonomiche riscontrate<br />
tra le <strong>varietà</strong> esaminate è stata utilizzata la<br />
banca dati dei pe<strong>di</strong>gree <strong>di</strong> <strong>patata</strong> della Wageningen<br />
University & Research (http://www.plantbree<strong>di</strong>ng.<br />
wur.nl/potatope<strong>di</strong>gree/). I dati ottenuti dalla lettura<br />
dei profili elettroforetici AFLP sono stati immessi in<br />
una matrice binaria riportante nei <strong>di</strong>versi campioni,<br />
l’assenza (0) e la presenza (1) dei frammenti. La similarità<br />
tra i generici in<strong>di</strong>vidui i e j, è stata calcolata<br />
utilizzando la seguente formula:<br />
SMij=(a+d)/(a+b+c+d)<br />
in cui a è il numero <strong>di</strong> bande presenti in entrambi<br />
gli in<strong>di</strong>vidui, b è il numero <strong>di</strong> bande presenti in i ed<br />
assenti in j, c è il numero <strong>di</strong> bande presenti in j ed<br />
assenti in i, d in<strong>di</strong>ca il numero <strong>di</strong> bande assenti sia<br />
in i che in j 6.<br />
Risultati<br />
Il fingerprinting molecolare è stato condotto me<strong>di</strong>ante<br />
un set <strong>di</strong> otto microsatelliti <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, che han-<br />
no mostrato polimorfismo in tutti i loci considerati.<br />
In totale sono stati analizzati 40 alleli, con una me<strong>di</strong>a<br />
<strong>di</strong> 5±1,03 alleli per locus e 2,3±0,55 (me<strong>di</strong>a±errore<br />
standard) per <strong>varietà</strong>. Due alleli (172 bp e 298 bp<br />
ai loci STM1053 e STM5114, rispettivamente) sono<br />
stati riscontrati in tutte le ventidue <strong>varietà</strong> analizzate,<br />
altri due (132 e 190 bp ai loci STG0001 e STI0012)<br />
in due <strong>varietà</strong>, (Sieglinde e Spunta, rispettivamente)<br />
e i restanti trentasei alleli hanno mostrato un livello<br />
<strong>di</strong> polimorfismo variabile. In particolare, il locus che<br />
ha presentato il minor numero <strong>di</strong> alleli polimorfici<br />
(due) è stato STM1053, mentre quello che ne ha presentati<br />
<strong>di</strong> più (otto) è stato STG0001. La <strong>di</strong>mensione<br />
dei microsatelliti amplificati è stata compresa tra 107<br />
bp (STI0032) e 298 bp (STM5114). Il valore me<strong>di</strong>o<br />
dell’eterozigosità è stato 0,81±0,07, con il valore più<br />
basso (0,35) del locus STM1053 e il più alto (0,99)<br />
dei loci STM1106 e STM1052. Il PD è stato molto alto<br />
(≥0,95) in tutti i loci considerati, a rilevare un’alta<br />
capacità <strong>di</strong>scriminante complessiva per l’intero set<br />
<strong>di</strong> loci SSR saggiati (Tabella II). Il numero totale <strong>di</strong><br />
polimorfismi SSR osservati in ciascuna <strong>varietà</strong> analizzata<br />
è mostrato in Tabella III. Il numero <strong>di</strong> alleli<br />
identificati è variato da 15 (Bartina) a 22 (Agria)<br />
con una me<strong>di</strong>a <strong>di</strong> 18,4±0,96 per <strong>varietà</strong>. I gruppi<br />
<strong>di</strong> alleli amplificati in ciascuna <strong>varietà</strong> me<strong>di</strong>ante le<br />
otto coppie <strong>di</strong> primer SSR sono stati classificati in<br />
tipologie <strong>di</strong> profili, in<strong>di</strong>cate con le lettere dell’alfabeto<br />
latino (Tabella III): ai loci aventi alleli identici, è<br />
stata assegnata la stessa lettera. Tale sistema <strong>di</strong> classificazione<br />
ha permesso <strong>di</strong> in<strong>di</strong>viduare le coppie <strong>di</strong><br />
primer in grado <strong>di</strong> <strong>di</strong>scriminare univocamente una<br />
<strong>varietà</strong> dalle restanti grazie al suo specifico profilo<br />
allelico. Al locus STG001 sono stati osservati quin<strong>di</strong>ci<br />
profili (A-O), tre<strong>di</strong>ci in STI0012 (A-M), do<strong>di</strong>ci<br />
Tabella II.
UTILIZZAZIONE DI MARCATORI MOLECOLARI SSR E AFLP PER L’IDENTIFICAZIONE VARIETALE IN PATATA VILLANO<br />
Tabella III.
VILLANO UTILIZZAZIONE DI MARCATORI MOLECOLARI SSR E AFLP PER L’IDENTIFICAZIONE VARIETALE IN PATATA<br />
0.59 0.68 0.77 0.86 0.95<br />
Figura 1. — Dendrogramma costruito per le 22 <strong>varietà</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
precoce analizzate me<strong>di</strong>ante otto marcatori SSR.<br />
Liseta, Spunta, Frisia, Inova e Elvira. Tramite le analisi<br />
del pe<strong>di</strong>gree è stato possibile caratterizzare ogni<br />
<strong>varietà</strong> identificando progenitori in comune presenti<br />
tra le <strong>varietà</strong> coltivate. Nel primo cluster le due <strong>varietà</strong><br />
Veronie e Sieglinde presentano un unico progenitore<br />
in comune (Juli), e molti più progenitori<br />
comuni con le altre <strong>varietà</strong> appartenenti al secondo<br />
cluster. Nel primo sotto-gruppo del cluster 2, invece,<br />
non sono state evidenziate correlazioni genealogiche<br />
tranne che per Arinda, presente nel pedegree <strong>di</strong><br />
Primura come parentale. Nel secondo sotto-gruppo,<br />
invece, sono stati in<strong>di</strong>viduati parentali in comune tra<br />
Elfe e Marabel (Hansa) e tutti gli altri componenti<br />
presentano molti progenitori in comune, tra cui i più<br />
frequenti sono Saskia e Katah<strong>di</strong>n; le uniche <strong>varietà</strong><br />
che non si correlano al resto del gruppo sono Agria<br />
e Ba<strong>di</strong>a.<br />
Per quanto concerne l’analisi AFLP, è stato eseguito<br />
lo stu<strong>di</strong>o dei profili elettroforetici e il confronto<br />
degli elettroferogrammi per tutte le combinazioni <strong>di</strong><br />
primer selettivi. Per ognuna <strong>di</strong> essa sono stati in<strong>di</strong>viduati<br />
gli alleli totali amplificati, il cui numero è variato<br />
da 61 (E-ACT M-CAG) a 81 (E-ACT/M-CAT) e il<br />
numero <strong>di</strong> alleli polimorfici, variabile tra 26 (E-ACT/<br />
M-CAG) e 41 (E-ACT/M-CAT) (Tabella IV). L’analisi<br />
dei frammenti polimorfici ha permesso <strong>di</strong> identificare<br />
marcatori specifici per ognuna delle quattro <strong>varietà</strong><br />
analizzate: nel particolare, 34 frammenti specifici<br />
consentono <strong>di</strong> <strong>di</strong>scriminare Sieglinde, 23 Spunta, 15<br />
Elvira e 11 Agria.<br />
Discussione<br />
Il rispetto della normativa europea sull’etichettatura<br />
degli alimenti richiede che sia accertata l’identità dei<br />
prodotti al fine <strong>di</strong> prevenire casi <strong>di</strong> fro<strong>di</strong> dovute alla<br />
sostituzione <strong>di</strong> una parte del prodotto con un altro <strong>di</strong><br />
<strong>di</strong>versa origine. Tra i meto<strong>di</strong> analitici usati per l’autenticazione<br />
<strong>di</strong> specie animali o vegetali in prodotti<br />
alimentari, quelli basati sull’analisi del DNA hanno il<br />
vantaggio <strong>di</strong> essere sicuri e rapi<strong>di</strong> nell’accertamento<br />
Tabella IV.
UTILIZZAZIONE DI MARCATORI MOLECOLARI SSR E AFLP PER L’IDENTIFICAZIONE VARIETALE IN PATATA VILLANO<br />
dell’identità genetica. Nell’ambito della tracciabilità<br />
genetica dei materiali vegetali nella filiera agroalimentare,<br />
tra i marcatori maggiormente impiegati<br />
figurano gli AFLP e gli SSR. Gli AFLP sono stati utilizzati<br />
per l’autenticazione <strong>di</strong> molte specie vegetali tra<br />
cui Brassica 7, olivo 8, carciofo 9 e <strong>di</strong> materie prime<br />
<strong>di</strong> origine animale spesso utilizzate per l’adulterazione<br />
<strong>di</strong> prodotti alimentari 10. I microsatelliti, invece,<br />
sono stati applicati per la <strong>caratterizzazione</strong> varietale<br />
<strong>di</strong> altre specie vegetali come la vite 11, il noce 12 e il<br />
pomodoro 13. In ambito forense la geno<strong>tipizzazione</strong><br />
attraverso l’utilizzo <strong>di</strong> marcatori microsatelliti è ormai<br />
una prassi comune e ampiamente riconosciuta.<br />
In <strong>patata</strong>, <strong>di</strong>versi tipi <strong>di</strong> marcatori molecolari sono<br />
stati usati al fine <strong>di</strong> esaminare la <strong>di</strong>versità genetica<br />
o semplicemente per il fingerprinting varietale. Tra<br />
i tanti si annoverano gli RFLP 14, i RAPD 15, gli AFLP<br />
16, 17 e gli I-SSR 18. I marcatori molecolari utilizzati in<br />
questo lavoro sono stati scelti tra quelli ritenuti più<br />
affidabili per la <strong>caratterizzazione</strong> e l’identificazione<br />
delle cultivar, analizzabili con grande precisione<br />
me<strong>di</strong>ante tecniche semi-automatizzate e in grado <strong>di</strong><br />
produrre risultati affidabili e ripetibili nel tempo. I<br />
microsatelliti, in particolare, sono marcatori d’elezione<br />
per la tracciabilità genetica dei materiali vegetali<br />
nelle filiere agro-alimentari, grazie alla loro capacità<br />
<strong>di</strong> amplificare corti DNA-stampo, un requisito fondamentale<br />
per l’analisi del DNA estratto da matrici<br />
alimentari.<br />
Più <strong>di</strong> 200 SSR sono stati identificati partendo da<br />
sequenze nucleoti<strong>di</strong>che <strong>di</strong> <strong>patata</strong> contenenti motivi<br />
ripetuti. Milbourne et al. 19 hanno sviluppato 112<br />
marcatori SSR, la cui validazione su un set <strong>di</strong> sei<br />
genotipi <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, ha permesso <strong>di</strong> selezionarne 98<br />
altamente polimorfici. Feingold et al. 20, invece, hanno<br />
in<strong>di</strong>viduato 94 microsatelliti, 61 utilizzati per il<br />
mappaggio e 30 per la <strong>caratterizzazione</strong> genetica <strong>di</strong><br />
30 cultivar <strong>di</strong> patate. Con la pubblicazione del genoma<br />
completo <strong>di</strong> <strong>patata</strong> 21, il numero <strong>di</strong> sequenze<br />
contenenti motivi ripetuti è aumentato enormemente.<br />
L’ultimo riepilogo delle statistiche SSR del<br />
Solanaceae Genome Resource (http://solanaceae.<br />
plantbiology.msu.edu/analyses/ssr/summary) documenta<br />
10.000 sequenze con più <strong>di</strong> 16.000 SSR potenzialmente<br />
utili (ripetizioni <strong>di</strong> 2-6 nucleoti<strong>di</strong>) per<br />
lo stu<strong>di</strong>o della <strong>di</strong>versità genetica in <strong>patata</strong>. Tuttavia,<br />
questi SSR sono molto <strong>di</strong>versi in termini <strong>di</strong> qualità,<br />
posizione sul genoma e capacità <strong>di</strong> <strong>di</strong>scriminazione.<br />
Recentemente, Ghislain et al. 22 hanno descritto un<br />
nuovo ‘’Kit per l’accertamento dell’identità genetica<br />
<strong>di</strong> <strong>patata</strong>” costituito da 24 marcatori SSR in grado<br />
<strong>di</strong> <strong>di</strong>scriminare il 94% delle <strong>varietà</strong> sud americane<br />
(oltre 700). Tale kit è particolarmente utile per standar<strong>di</strong>zzare<br />
la selezione <strong>di</strong> SSR e per l’assegnazione<br />
delle <strong>di</strong>mensioni ai microsatelliti, permettendo, in tal<br />
modo, l’analisi comparativa <strong>di</strong> dati generati in modo<br />
in<strong>di</strong>pendente. Nel presente stu<strong>di</strong>o abbiamo usato 8<br />
dei 24 marcatori SSR messi a punto da Ghislain et<br />
al. 22, identificando profili allelici <strong>varietà</strong>-specifici utili<br />
per la loro autenticazione genetica. I valori elevati<br />
<strong>di</strong> eterozigosità riscontrati e il numero me<strong>di</strong>o <strong>di</strong> alleli<br />
per locus hanno <strong>di</strong>mostrato che il set <strong>di</strong> marcatori<br />
testato risulta estremamente efficiente nel <strong>di</strong>stinguere<br />
la collezione <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> esaminate. Valori simili<br />
sono stati riportati in letteratura da altri autori. In<br />
particolare, Milbourne et al. 23, in un lavoro <strong>di</strong> <strong>caratterizzazione</strong><br />
molecolare <strong>di</strong> 16 <strong>varietà</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong> me<strong>di</strong>ante<br />
17 SSR, hanno riportato un numero me<strong>di</strong>o <strong>di</strong><br />
alleli per locus <strong>di</strong> 5,7. Ghislain et al. 22, invece, hanno<br />
evidenziato 6,8 alleli per locus, in me<strong>di</strong>a, in un campione<br />
più ampio <strong>di</strong> genotipi (30 <strong>varietà</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
proveniente dal Sud America). Ruiz de Gallatera et<br />
al. 24, infine, hanno calcolato un numero me<strong>di</strong>o <strong>di</strong> alleli<br />
per locus più basso (3,24) in 19 ecotipi spagnoli<br />
<strong>di</strong> <strong>patata</strong>. L’oscillazione <strong>di</strong> tali valori è da ricondurre<br />
certamente alla base genetica delle <strong>varietà</strong> messe a<br />
confronto e alla capacità <strong>di</strong>scriminante dei loci saggiati.<br />
Quest’ultima, che è una misura della capacità<br />
informativa <strong>di</strong> un marcatore, nel presente stu<strong>di</strong>o si è<br />
attestato su valori molto alti, non scendendo mai al<br />
<strong>di</strong> sotto <strong>di</strong> 0,95. Tali valori si avvicinano a quelli riportati<br />
in letteratura, ove alcuni esempi simili riportano<br />
i valori del potere <strong>di</strong> <strong>di</strong>scriminazione oscillanti<br />
tra 0,64 e 0,97 25, da 0,79 a 0,91 26.<br />
Gli AFLP, ancora oggi, sono i marcatori molecolari<br />
più utilizzati per il fingerprinting e il genotyping<br />
molecolare nelle piante superiori. L’elevato grado <strong>di</strong><br />
polimorfismo che tali marcatori sono in grado <strong>di</strong> rilevare<br />
e la loro elevata riproducibilità, rendono gli<br />
AFLP uno strumento valido per l’autenticazione varietale<br />
non solo in <strong>patata</strong>. Meneghetti et al. 27, ad<br />
esempio, tramite l’uso <strong>di</strong> AFLP sono riusciti a <strong>di</strong>stinguere<br />
132 accessioni <strong>di</strong> 3 <strong>di</strong>fferenti cultivar <strong>di</strong> vite<br />
(Malvasia nera <strong>di</strong> Brin<strong>di</strong>si/Lecce, Negroamaro e Primitivo)<br />
e a correlare le loro origini geografiche alle<br />
<strong>di</strong>fferenze genetiche. In questa ricerca, me<strong>di</strong>ante le<br />
analisi AFLP sono state esaminate quattro <strong>varietà</strong> <strong>di</strong><br />
<strong>patata</strong>, scelte perché rappresentative della coltivazione<br />
extra-stagionale in Puglia, Sicilia e Campania.<br />
Le combinazioni AFLP utilizzate si sono rivelate efficienti<br />
e hanno permesso <strong>di</strong> in<strong>di</strong>viduare alleli polimorfici<br />
specifici in tutte le <strong>varietà</strong> prese in esame. La<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 9
VILLANO UTILIZZAZIONE DI MARCATORI MOLECOLARI SSR E AFLP PER L’IDENTIFICAZIONE VARIETALE IN PATATA<br />
creazione <strong>di</strong> marchi <strong>di</strong> qualità e la messa a punto <strong>di</strong><br />
nuove tecniche genomiche per la <strong>caratterizzazione</strong><br />
varietale possono essere uno strumento in<strong>di</strong>spensabile<br />
per proteggere la tipicità dei prodotti alimentari.<br />
In tale contesto, la tracciabilità genetica consente <strong>di</strong><br />
controllare un determinato materiale vegetale in tutta<br />
la sua filiera <strong>di</strong> produzione. Le indagini molecolari<br />
condotte sul pomodoro S. Marzano, sull’IGP Melannurca<br />
Campana, sull’Olio DOP <strong>di</strong> Collina <strong>di</strong> Brin<strong>di</strong>si,<br />
sul DOP Pane <strong>di</strong> Altamura 28 e sull’IGP Patata<br />
della Sila sono casi stu<strong>di</strong>o <strong>di</strong> tracciabilità molecolare<br />
<strong>di</strong> prodotti a denominazione d’origine. Questi sono<br />
solo una parte dei 142 prodotti italiani a Denominazione<br />
<strong>di</strong> Origine Protetta e degli 84 prodotti italiani<br />
ad In<strong>di</strong>cazione Geografica Protetta.<br />
Conclusioni<br />
In questa ricerca è stato possibile sviluppare marcatori<br />
molecolari SSR e AFLP specifici <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
precoce, confermando la vali<strong>di</strong>tà degli strumenti<br />
genomici nell’autenticazione varietale. Gli alleli SSR<br />
e AFLP potranno essere registrati in un database<br />
<strong>di</strong> marcatori molecolari per permettere lo sviluppo<br />
d’informazioni cumulative sul fingerprinting varietale<br />
in <strong>patata</strong>. I risultati ottenuti, inoltre, saranno un<br />
utile strumento per la certificazione genetica e la<br />
tracciabilità molecolare dei prodotti alimentari derivati<br />
dalla lavorazione della <strong>patata</strong>.<br />
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10 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):11-23<br />
Strumenti <strong>di</strong> genomica funzionale per la <strong>tipizzazione</strong><br />
dell’origine <strong>di</strong> coltivazione della <strong>patata</strong><br />
C. ONOFRI 1, D. PACIFICO 1, P. OSTANO 2, M. MELLO-GRAND 2, C. GHIMENTI 2, B. PARISI 1, G. MANDOLINO 1<br />
Obiettivo. È stata valutata la possibilità <strong>di</strong> utilizzare<br />
l’oligo glass array Agilent <strong>di</strong> Solanum tuberosum<br />
POCI (Potato Oligo Chip Initiative) 4X44 K (44000<br />
sonde presenti) per l’analisi comparativa del trascrittoma<br />
<strong>di</strong> tuberi maturi e dormienti <strong>di</strong> <strong>patata</strong> <strong>di</strong> <strong>di</strong>verse<br />
<strong>varietà</strong>, coltivate in <strong>di</strong>verse aree geografiche.<br />
Meto<strong>di</strong>. L’RNA totale è stato estratto dai tuberi liofilizzati<br />
<strong>di</strong> alcune <strong>varietà</strong> coltivate in specifiche località<br />
<strong>di</strong> Puglia e Sicilia. L’RNA è stato marcato con Cy3 e<br />
ibridato sull’array; in seguito a lettura me<strong>di</strong>ante scanner,<br />
i dati <strong>di</strong> ibridazione sono stati confrontati con altre<br />
<strong>varietà</strong>, località o regioni per ottenere una mappa<br />
genome-wide della up- o down-regolazione dei geni<br />
nelle <strong>di</strong>verse con<strong>di</strong>zioni comparate.<br />
Risultati. I dati sui tuberi raccolti nel 2008 sembrano<br />
in<strong>di</strong>care una forte preponderanza dell’effetto della<br />
<strong>varietà</strong> sulla modulazione dell’espressione genica,<br />
mentre gli effetti delle località esaminate, a parità <strong>di</strong><br />
<strong>varietà</strong>, sembrano molto limitati. Nel 2009 questi dati<br />
non sono stati confermati, mostrando anzi un forte<br />
effetto delle località sul numero e tipo <strong>di</strong> geni regolati.<br />
Conclusioni. La conclusione è che le variazioni dovute<br />
all’annata <strong>di</strong> coltivazione siano superiori a quelle dovute<br />
alla <strong>varietà</strong> e al luogo <strong>di</strong> coltivazione.<br />
Parole chiave: RNA - Solanum tuberosum - Microarray.<br />
La genomica della <strong>patata</strong><br />
La <strong>patata</strong> (Solanum tuberosum) fa parte della famiglia<br />
delle solanacee, insieme a numerose altre<br />
specie <strong>di</strong> grande rilevanza economica come il pomodoro,<br />
la melanzana, il tabacco e così via.<br />
Data la sua importanza – dopo riso e frumento è<br />
Autore <strong>di</strong> contatto: G. Mandolino, CRA - Centro <strong>di</strong> Ricerca per le<br />
Colture Industriali, via <strong>di</strong> Corticella 133, 40128 Bologna, Italia.<br />
E-mail: giuseppe.mandolino@entecra.it.<br />
1CRA – Centro <strong>di</strong> Ricerca per le Colture Industriali,<br />
Bologna, Italia<br />
2Fondazione Edo ed Elvo Tempia Valenta per la lotta<br />
contro i tumori – ONLUS, Biella, Italia<br />
la terza coltura nel mondo – la <strong>patata</strong> è stata oggetto<br />
<strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o sotto molti punti <strong>di</strong> vista, sia chimicoqualitativo<br />
sia genetico-molecolare.<br />
Già dalla fine degli anni ’80 sono state sviluppate<br />
mappe genetiche <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>di</strong>ploi<strong>di</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, basate<br />
su marcatori molecolari Restriction Fragment Length<br />
Polymorphism (RFLP), mappe poi implementate<br />
introducendo altri marcatori quali micro satelliti e<br />
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP).<br />
Lo sviluppo delle più recenti, ultra-dense mappe molecolari<br />
<strong>di</strong> <strong>patata</strong> 1 che hanno aperto la strada al sequenziamento<br />
dell’intero genoma, sono state inizialmente<br />
facilitate anche dalla elevatissima sintenia del<br />
genoma <strong>di</strong> <strong>patata</strong> con quello <strong>di</strong> pomodoro, che ha<br />
permesso <strong>di</strong> utilizzare marcatori comuni ad entrambe<br />
le specie ed effettuare stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> genomica comparativa<br />
su queste due specie sin dai primi anni ’90 2. Il sequenziamento<br />
completo del genoma <strong>di</strong> pomodoro, e<br />
lo sviluppo delle conseguenti risorse bioinformatiche<br />
e dei database che permettono lo sfruttamento delle<br />
conoscenze acquisite su una pianta e la loro applicazione<br />
sistematica all’altra, ha ulteriormente accelerato<br />
i progressi della genomica della <strong>patata</strong> 3.<br />
Il genoma <strong>di</strong> <strong>patata</strong> è composto da 12 cromosomi,<br />
e la sua lunghezza (aploide) stimata è <strong>di</strong> circa 850<br />
milioni <strong>di</strong> paia <strong>di</strong> basi. Il Potato Genome Sequencing<br />
Consortium (PGSC), composto da 17 gruppi<br />
<strong>di</strong> ricerca appartenenti a 13 <strong>di</strong>versi paesi, ha reso<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 11
ONOFRI TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA<br />
pubblica nel 2010 la prima sequenza del genoma<br />
<strong>di</strong> <strong>patata</strong> 4. Poiché sia il bree<strong>di</strong>ng sia l’analisi genetica<br />
della <strong>patata</strong> sono rese <strong>di</strong>fficili dal fatto che<br />
per lo più le <strong>varietà</strong> commerciali sono tetraploi<strong>di</strong><br />
<strong>di</strong> recente origine, che la <strong>patata</strong> è una specie altamente<br />
eterozigote e che tollera male l’inbree<strong>di</strong>ng, il<br />
PGSC ha deciso <strong>di</strong> ottenere le sequenze genomiche<br />
a partire da materiali <strong>di</strong>ploi<strong>di</strong>, in particolare ottenendo<br />
la gran parte delle sequenze da un’accessione<br />
doppio monoploide (DM) ottenuta tramite coltura <strong>di</strong><br />
antere e successivo raddoppiamento cromosomico<br />
(e quin<strong>di</strong> omozigote a tutti i loci), appartenente al<br />
gruppo Phureja <strong>di</strong> S. tuberosum, e successivamente<br />
integrando in questa bozza sequenze ottenute da<br />
una bree<strong>di</strong>ng line eterozigote ma anch’essa <strong>di</strong>plode,<br />
e appartenente al gruppo tuberosum.<br />
Infine, al lavoro <strong>di</strong> sequenziamento del genoma,<br />
è stato affiancata, ed è in continuo sviluppo, un’indagine<br />
<strong>di</strong> “deep transcriptome sequencing”: 31 Gb<br />
<strong>di</strong> sequenziamento del trascrittoma, il cui RNA proveniva<br />
da varie accessioni, e da tutti i tipi <strong>di</strong> tessuto,<br />
sta<strong>di</strong> <strong>di</strong> sviluppo e con<strong>di</strong>zioni ambientali <strong>di</strong><br />
stress biotico e abiotico. Ne sono risultati circa 39000<br />
geni co<strong>di</strong>ficanti per proteine, i geni cioè che maggiormente<br />
contribuiscono ai fenotipi cui sono particolarmente<br />
interessati i breeder, presiedendo per<br />
esempio alla sintesi <strong>di</strong> molecole che influenzano la<br />
qualità dei tuberi quali glicoalcaloi<strong>di</strong> o carotenoi<strong>di</strong>;<br />
oppure proteine che me<strong>di</strong>ano resistenze a fattori <strong>di</strong><br />
stress, o strutturali, coinvolte nella consistenza, tessitura<br />
e comportamento alla cottura del tubero, e così<br />
via. Un dato interessante che è emerso dal sequenziamento<br />
del trascrittoma <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, è che oltre 9000<br />
geni, cioè il 25% del totale, esibisce il fenomeno<br />
dello “splicing alternativo”, in seguito al quale uno<br />
stesso gene co<strong>di</strong>fica per due o più isoforme proteiche.<br />
Considerando che questi dati sono stati ottenuti<br />
su genomi <strong>di</strong>ploi<strong>di</strong>, si può supporre che le <strong>varietà</strong><br />
tetraploi<strong>di</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, e le specie selvatiche <strong>di</strong> Solanum,<br />
contengano un tasso <strong>di</strong> variabilità genetica<br />
ancora sconosciuto e non sfruttato, ben al <strong>di</strong> là del<br />
mero numero <strong>di</strong> geni identificati.<br />
Si può prevedere che saranno moltissime le ricadute<br />
del recente completamento <strong>di</strong> una bozza della<br />
sequenza completa del genoma <strong>di</strong> <strong>patata</strong> 5. Oltre alla<br />
possibilità <strong>di</strong> in<strong>di</strong>viduare per molti geni <strong>di</strong> rilevanza<br />
agronomica varianti più o meno interessanti nel germoplasma<br />
<strong>di</strong> Solanum, si potrà cominciare a comprendere<br />
la base <strong>di</strong> caratteri <strong>di</strong> grande importanza<br />
ma che sono fino ad oggi sfuggiti in parte all’analisi<br />
genetica tra<strong>di</strong>zionale a causa del loro determini-<br />
smo multifattoriale. Si può inoltre prevedere che la<br />
<strong>di</strong>sponibilità della sequenza genomica della <strong>patata</strong><br />
porterà, ed in parte ha già portato, allo sviluppo <strong>di</strong><br />
strumenti nuovi per la ricerca e per il bree<strong>di</strong>ng.<br />
Fra le ricadute della conoscenza della sequenza<br />
del genoma <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, c’è certamente poi l’identificazione<br />
dei geni che co<strong>di</strong>ficano per proteine enzimatiche<br />
o strutturali, della loro variazione nel germoplasma,<br />
e la possibilità <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>arne il funzionamento in<br />
relazione a situazioni specifiche della pianta, quale<br />
lo sta<strong>di</strong>o <strong>di</strong> sviluppo, l’organo, le con<strong>di</strong>zioni ambientali,<br />
l’attacco <strong>di</strong> patogeni, ecc. Questo immenso<br />
campo <strong>di</strong> stu<strong>di</strong> è oggi più alla portata dei ricercatori,<br />
grazie alla <strong>di</strong>sponibilità <strong>di</strong> “microarrays” sia commerciali<br />
che ottenibili “su misura” da alcune fra le principali<br />
aziende biotecnologiche mon<strong>di</strong>ali.<br />
I microarrays, strumento <strong>di</strong><br />
analisi del trascrittoma<br />
I microarrays sono strumenti analitici high-throughput<br />
(cioè che generano gran<strong>di</strong> quantità <strong>di</strong> informazioni<br />
in maniera automatizzabile e informatizzata,<br />
attraverso procedure spesso robotizzabili) e<br />
genome-wide (cioè capaci <strong>di</strong> estrarre dati dall’intero<br />
complemento <strong>di</strong> geni, o da una sostanziale frazione<br />
<strong>di</strong> esso), la cui origine risale alla prima metà degli<br />
anni ’90, quando furono sviluppati da Mark Schena<br />
et al. alla Stanford University 6.<br />
Si possono definire come matrici or<strong>di</strong>nate (ad es.<br />
organizzato in colonne e file) <strong>di</strong> elementi microscopici<br />
(ad es. brevi segmenti <strong>di</strong> DNA) posizionati su<br />
un substrato solido e planare (ad es. vetrini), e che<br />
consentono il bin<strong>di</strong>ng specifico <strong>di</strong> geni o prodotti<br />
genici (es. mRNA).<br />
I primi esperimenti con microarray per lo stu<strong>di</strong>o<br />
dell’espressione genica utilizzavano spot a cDNA, tipicamente<br />
<strong>di</strong> lunghezza 500-2000 bp, che consente<br />
forti segnali <strong>di</strong> ibridazione data la estesa complementarietà<br />
con l’mRNA-sonda in soluzione marcato<br />
con un fluorocromo. I microarray a oligonucleoti<strong>di</strong>,<br />
invece, trovano applicazioni oltre che negli stu<strong>di</strong> <strong>di</strong><br />
profiling dell’espressione genica, anche nella geno<strong>tipizzazione</strong>.<br />
Gli oligonucleoti<strong>di</strong> che vengono fissati<br />
al vetrino sono <strong>di</strong> 15-70 bp, e ottenuti me<strong>di</strong>ante sintesi<br />
chimica; il segnale <strong>di</strong> ibridazione ha alta intensità<br />
e specificità dopo ibridazione all’mRNA-sonda. Il<br />
principio <strong>di</strong> funzionamento dei chip genici è schematizzato<br />
in Figura 1.<br />
Oltre allo sviluppo <strong>di</strong> tecniche fotolitografiche,<br />
12 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA ONOFRI<br />
CAMPIONE<br />
RIFERIMENTO<br />
Inferenza<br />
statistica<br />
Estrazione<br />
RNA o DNA<br />
Amplicazione<br />
e marcatura<br />
Ibridazione Scansione<br />
Processing<br />
dati<br />
Figura 1. — Schema del funzionamento del microarray con la tecnica “one-color” della Agilent.<br />
Ibridazione<br />
Analisi<br />
immagine<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 13
ONOFRI TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA<br />
me<strong>di</strong>ante le quali si possono fissare a supporti soli<strong>di</strong><br />
brevi segmenti <strong>di</strong> DNA (oligo o cDNA), il principale<br />
progresso che ha permesso il <strong>di</strong>ffondersi dei microarray<br />
come strumento <strong>di</strong> ricerca e <strong>di</strong> analisi, è la <strong>di</strong>sponibilità<br />
<strong>di</strong> enormi quantità <strong>di</strong> informazioni <strong>di</strong> sequenze<br />
genomiche; senza queste recenti acquisizioni, non<br />
sarebbe possibile infatti la sintesi né <strong>di</strong> cDNA specifico<br />
per ogni dato gene, né <strong>di</strong> oligonucleoti<strong>di</strong> con il<br />
necessario grado <strong>di</strong> specificità. Oggi sono <strong>di</strong>sponibili<br />
numerosi database de<strong>di</strong>cati, come quello gestito dal<br />
PSGC (www.potatogenome.net) o quelli della Cornell<br />
University (www.sgn.cornell.edu/) o della Wageningen<br />
University (https://cbsgdbase.wur.nl/).<br />
In seguito alla <strong>di</strong>sponibilità <strong>di</strong> un crescente numero<br />
<strong>di</strong> genomi <strong>di</strong> <strong>di</strong>versi organismi interamente<br />
sequenziati, molte aziende biotech hanno introdotto<br />
sul mercato chip commerciali, contenenti l’intero<br />
repertorio <strong>di</strong> geni <strong>di</strong> <strong>di</strong>versi organismi. Fra questi, il<br />
primo organismo vegetale interamente sequenziato<br />
(Arabidopsis thaliana) e <strong>di</strong> cui è stato prodotto un<br />
microarray commerciale (ATH1, da parte della Affymetryx)<br />
è stato presto seguito da altri, man mano<br />
che le tecnologie <strong>di</strong> nuova generazione (NGS) rendevano<br />
il sequenziamento massiccio sempre più efficiente,<br />
economico ed abbordabile anche da laboratori<br />
dotati <strong>di</strong> me<strong>di</strong>o budget.<br />
Applicazione dei microarray alla<br />
genomica funzionale <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
Già negli anni precedenti al completamento della<br />
prima sequenza genomica <strong>di</strong> <strong>patata</strong> (2010), l’estesa<br />
sintenia fra i genomi delle due più importanti<br />
Solanacee aveva consentito ai ricercatori <strong>di</strong> utilizzare<br />
alcune risorse sviluppate in seguito al sequenziamento<br />
del genoma <strong>di</strong> pomodoro, già portato a<br />
termine. Uno <strong>di</strong> questi strumenti, commercializzato<br />
da Affymetryx, il Gene Chip Tomato Array, contenente<br />
10.000 geni espressi ed annotati <strong>di</strong> pomodoro,<br />
è stato utilizzato dal gruppo del CRA.-CIN (Centro<br />
<strong>di</strong> Ricerca per le Colture Industriali) <strong>di</strong> Bologna che<br />
lavorava sul fenomeno dell’addolcimento dei tuberi<br />
in seguito a frigoconservazione, elaborando un<br />
algoritmo che era in grado <strong>di</strong> correggere in parte i<br />
mismatch <strong>di</strong> ibridazione dovuti alle <strong>di</strong>fferenze fra le<br />
sequenze <strong>di</strong> pomodoro e quelle <strong>di</strong> <strong>patata</strong> 7.<br />
L’aumento esponenziale del numero <strong>di</strong> sequenze<br />
omologhe <strong>di</strong> <strong>patata</strong> presenti nelle banche dati internazionali,<br />
ha portato tuttavia ben presto all’avvento<br />
<strong>di</strong> microarray omologhi, cioè costituiti da sequenze<br />
effettivamente <strong>di</strong> S. tuberosum, per stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> geno<strong>tipizzazione</strong><br />
e <strong>di</strong> genomica funzionale, utilizzando entrambe<br />
le tipologie <strong>di</strong> chip (a cDNA e ad oligo), a partire<br />
dal 2005. I primi microarray <strong>di</strong> <strong>patata</strong> sono stati a<br />
cDNA, inizialmente con poche migliaia <strong>di</strong> feature (le<br />
sequenze target fissate al vetrino e sulle quali avviene<br />
l’ibridazione), e miravano ad in<strong>di</strong>viduare i geni <strong>di</strong><br />
<strong>patata</strong> <strong>di</strong>fferenzialmente espressi durante lo sviluppo<br />
dei tuberi 8. Successivamente, per l’analisi degli<br />
eventi trascrizionali associati alla formazione del tubero,<br />
è stato utilizzato un’evoluzione <strong>di</strong> questo primo<br />
chip, un microarray ad oligo 60-mer, complementari<br />
a 44000 sequenze unigene <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, array che è stato<br />
denominato POCI (Potato Oligo Chip Initiative 9).<br />
Anche un gruppo inglese dello Scottish Crop Research<br />
Institute (SCRI), parte del consorzio PSGC, ha<br />
utilizzato il microarray POCI per un’analisi genomewide<br />
dei geni che influenzano la qualità dei tuberi,<br />
ed in particolare il sapore, la tessitura, il contenuto<br />
<strong>di</strong> carotenoi<strong>di</strong> e la <strong>precoci</strong>tà <strong>di</strong> maturazione 10. In<br />
questo lavoro, sono stati comparati due genotipi <strong>di</strong><br />
S. tuberosum appartenenti al gruppo Phureja, e due<br />
al gruppo Tuberosum, ottenuti in campo in due <strong>di</strong>verse<br />
annate. L’obiettivo era attribuire ai geni del<br />
gruppo Phureja o Tuberosum che mostravano maggiore<br />
variazione nel confronto, un possibile ruolo<br />
nel determinismo dei caratteri associabili alla qualità.<br />
In questo lavoro nella prima annata, 2075 geni<br />
risultarono significativamente regolati (meno del 5%<br />
delle sequenze rappresentate sul chip), e nella seconda<br />
questo numero scese a 1386 (circa il 3%).<br />
Questi dati mettono in evidenza la grande variazione<br />
che si riscontra quando si esamina il trascrittoma<br />
<strong>di</strong> materiale maturato in con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> pieno campo,<br />
e il fortissimo effetto dell’annata pur in presenza <strong>di</strong><br />
materiale geneticamente omogeneo. I geni consistentemente<br />
up-regolati nel gruppo Phureja rispetto<br />
al Tuberosum, risultarono 309, e 555 quelli down-regolati.<br />
Questi importanti dati portano a considerare<br />
quanto relativamente limitato sia il numero <strong>di</strong> geni<br />
che <strong>di</strong>stinguono due gruppi <strong>di</strong> accessioni (Phureja e<br />
Tuberosum), nonostante le gran<strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenze morfologiche<br />
e funzionali che le caratterizzano.<br />
Il lavoro che viene qui presentato, svolto nell’ambito<br />
del progetto TIPIPAPA (<strong>tipizzazione</strong> e <strong>caratterizzazione</strong><br />
<strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>precoci</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong> con l’impiego <strong>di</strong><br />
tecniche molecolari e spettroscopiche) ha cercato <strong>di</strong><br />
applicare per la prima volta un potente strumento per<br />
lo stu<strong>di</strong>o della trascrittomica della <strong>patata</strong>, il microarray<br />
POCI da circa 44000 sonde, alla <strong>caratterizzazione</strong><br />
del luogo <strong>di</strong> coltivazione (località e regione) <strong>di</strong> alcune<br />
14 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA ONOFRI<br />
Tabella I.
ONOFRI TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA<br />
Figura 2. — A) Il chip POCI della Agilent. Ogni vetrino è composto da 4 array rappresentanti 44000 sequenze <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, e può essere ibridato<br />
con un campione <strong>di</strong>verso; B) la ripartizione in categorie funzionali me<strong>di</strong>ante Gene Ontology delle sequenze rappresentate sul chip<br />
POCI.<br />
Il microarray POCI<br />
In questo lavoro è stato utilizzato un oligo microarray<br />
POCI 4x44K (Figura 2A), sviluppato dal PSGC<br />
e commercializzato a partire dal marzo 2010 da Agilent.<br />
È stato <strong>di</strong>segnato a partire da una collezione <strong>di</strong><br />
246.182 sequenze <strong>di</strong> <strong>patata</strong> <strong>di</strong>sponibili nella banche<br />
dati, e che sono state assemblate in 46345 unigenes.<br />
Nei casi in cui la funzione putativa delle sequenze<br />
presenti sul POCI sia nota, è <strong>di</strong>sponibile un’annotazione<br />
funzionale e una categorizzazione per processo<br />
biologico (Figura 2B).<br />
L’ibridazione dei campioni marcati sull’oligo glass<br />
array è avvenuta in rotazione (10 rpm), a temperatura<br />
controllata (65 °C) per 17 ore. I vetrini sono stati<br />
lavati seguendo la procedura <strong>di</strong> lavaggio Agilent e<br />
scannerizzati con lo scanner a doppio laser G2505B<br />
(Agilent Technologies).<br />
Per ogni esperimento è stato eseguito un replicato<br />
tecnico. L’intensità <strong>di</strong> fluorescenza per ogni singola<br />
sonda è stata rilevata, con l’intensità del segnale<br />
che risulta proporzionale alla quantità <strong>di</strong> RNA legata<br />
alla sonda. Per il nostro stu<strong>di</strong>o è stato impiegato il<br />
protocollo one-color assay che prevede per ogni array<br />
l’ibridazione <strong>di</strong> un unico campione marcato con<br />
un solo fluorocromo; ciò permette <strong>di</strong> confrontare<br />
l’espressione genica <strong>di</strong> un campione con quella <strong>di</strong><br />
vari campioni <strong>di</strong>versi e non con quella <strong>di</strong> un unico<br />
campione come nel caso del two-color assay. Ogni<br />
campione, tuttavia, è stato ibridato a due array <strong>di</strong><br />
due vetrini <strong>di</strong>versi, per valutare la riproducibilità ed<br />
ottenere valori me<strong>di</strong> che tengano conto dell’eventuale<br />
variabilità tecnica sui dati ottenuti.<br />
Analisi dei dati<br />
In seguito all’ibridazione e ai lavaggi, gli array<br />
POCI sono stati scansionati con lo scanner Agilent a<br />
doppio laser, versione B (G2505B, Agilent Technologies)<br />
Le immagini sono state analizzate utilizzando<br />
il software Feature Extraction (Agilent Technologies)<br />
versione 9.5.<br />
I dati grezzi sono stati processati con il software<br />
Bioconductor (www.bioconductor.org 11) nell’ambiente<br />
statistico R, applicando il metodo normexp<br />
per la correzione del background e quantile come<br />
metodo <strong>di</strong> normalizzazione tra gli array. Il pacchetto<br />
LIMMA (LInear Models for MicroArray data) è stato<br />
utilizzato per identificare i geni <strong>di</strong>fferenzialmente<br />
espressi nelle varie con<strong>di</strong>zioni, applicando un filtro<br />
sul logaritmo in base 2 del Fold Change (>1 per i<br />
geni up-regolati e ≤1 per i geni down-regolati) e sulla<br />
statistica B corretta per i test multipli (>2).<br />
I dati finali dell’intensità <strong>di</strong> fluorescenza <strong>di</strong> ogni<br />
16 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA ONOFRI<br />
campione ibridato su un array, nella procedura onecolor,<br />
possono essere utilizzati per <strong>di</strong>versi tipi <strong>di</strong><br />
confronto, ed espressi come fold change del campione<br />
scelto come ‘test’ rispetto al campione scelto<br />
come reference; nel nostro lavoro sono stati considerati<br />
geni <strong>di</strong>fferenzialmente espressi quelli per<br />
cui il valore <strong>di</strong> fold change era maggiore <strong>di</strong> 2 (geni<br />
up-regolati) o minore <strong>di</strong> -2 (geni down-regolati).<br />
È applicato un filtro anche alla statistica B corretta<br />
per test multipli (>2). I risultati, quin<strong>di</strong>, non sono<br />
espressi come valore assoluto dell’espressione genica,<br />
ma sempre come espressione relativa, fra coppie<br />
<strong>di</strong> campioni a confronto.<br />
Risultati<br />
In primo luogo va sottolineato che tutte le informazioni<br />
ottenibili sulla regolazione dei geni nei <strong>di</strong>versi<br />
confronti si riferiscono all’espressione genica in<br />
tuberi maturi, e dormienti. Secondariamente è stato<br />
osservato che un numero variabile da 34524 a 39533<br />
sonde del chip davano segnali positivi e significativamente<br />
al <strong>di</strong> sopra della soglia del background, numeri<br />
che corrispondono rispettivamente al 75-85% delle<br />
feature presenti sul vetrino. La relativa costanza <strong>di</strong><br />
questa percentuale nelle varie ibridazioni, nel corso<br />
delle prove <strong>di</strong> entrambi gli anni e per tutti i confronti,<br />
permette <strong>di</strong> ritenere il numero <strong>di</strong> geni valutato come<br />
<strong>di</strong>fferenzialmente espresso come affidabile. In altre<br />
parole, le forti fluttuazioni osservate nel numero <strong>di</strong><br />
geni <strong>di</strong>fferenzialmente espressi nei vari confronti effettuati,<br />
non possono essere ascritte a <strong>di</strong>versità importanti<br />
nell’efficienza <strong>di</strong> ibridazione <strong>di</strong> ciascun RNA al<br />
suo array. Questa informazione permette <strong>di</strong> valutare<br />
comparativamente in maniera affidabile tutte le coppie<br />
<strong>di</strong> confronti <strong>di</strong> seguito considerate.<br />
Confronto fra i campioni del 2008<br />
Nella Tabella II sono sintetizzate le statistiche dei<br />
confronti effettuati sui campioni 2008 fra alcune coppie<br />
<strong>di</strong> località e/o <strong>varietà</strong>. L’obiettivo <strong>di</strong> questo confronto<br />
<strong>di</strong> tipo quantitativo era verificare quale dei tre<br />
fattori considerati (<strong>varietà</strong>, regione e località) avesse<br />
l’effetto maggiore nel modulare l’espressione genica<br />
genome-wide, come osservabile me<strong>di</strong>ante l’array<br />
POCI. Dai dati del 2008, e senza ancora considerare<br />
quali geni vengano modulati, emergono alcune informazioni<br />
preliminari. In primo luogo, il massimo<br />
numero <strong>di</strong> geni <strong>di</strong>fferenzialmente espressi più <strong>di</strong> 2<br />
volte (up- o down-regolati), è stato in questa prima<br />
Tabella II.
ONOFRI TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA<br />
annata sorprendentemente limitato: 520 è stato il<br />
massimo numero osservato, per il confronto fra due<br />
<strong>varietà</strong>, Spunta e Sieglinde, entrambe coltivate in località<br />
Cozze, in Puglia. Anche il confronto varietale<br />
Spunta-Sieglinde in un’altra località, Margiotta, Puglia,<br />
risulta in 394 geni <strong>di</strong>fferenzialmente espressi in modo<br />
significativo ed al <strong>di</strong> sopra della soglia <strong>di</strong> 2 x. Dai<br />
dati del 2008 presi nel loro insieme, appare quin<strong>di</strong><br />
che le <strong>di</strong>fferenze fra <strong>varietà</strong> (sezione superiore della<br />
Tabella II) giustifichino la maggior parte della modulazione<br />
dell’espressione dei geni che si può osservare;<br />
minore il numero <strong>di</strong> geni modulati (40-219) che<br />
si osservano confrontando le stesse <strong>varietà</strong> coltivate<br />
in regioni <strong>di</strong>verse (sezione interme<strong>di</strong>a in Tabella II).<br />
Infine, l’effetto della località (a parità quin<strong>di</strong> <strong>di</strong> <strong>varietà</strong><br />
e regione considerata) appare praticamente trascurabile<br />
(anche se potenzialmente importante ai fini della<br />
<strong>caratterizzazione</strong> geografica del luogo <strong>di</strong> coltivazione),<br />
modulando soltanto 8-41 geni, a seconda delle<br />
località considerate, quin<strong>di</strong> meno dello 0,1% dei geni<br />
monitorati (sezione inferiore della Tabella II).<br />
Per valutare la possibilità <strong>di</strong> caratterizzare il luogo<br />
o la regione <strong>di</strong> coltivazione me<strong>di</strong>ante l’identificazione<br />
<strong>di</strong> uno specifico set <strong>di</strong> geni regolato rispetto ad<br />
una delle località utilizzate come riferimento, è utile<br />
avere una categorizzazione dei geni che mostrano<br />
significativa up- o down-regolazione nei vari confronti<br />
ed in<strong>di</strong>viduare un eventuale gruppo <strong>di</strong> geni<br />
costantemente regolati in <strong>di</strong>versi confronti, e la loro<br />
funzione putativa. I geni regolati nei vari confronti<br />
del 2008 sono perciò stato categorizzati in base ad<br />
una “gene ontology” predefinita, ed i risultati sono<br />
riassunti in Figura 3. Nel considerare la heat map <strong>di</strong><br />
cui è composta questa figura, non va <strong>di</strong>menticato<br />
che le zone rosse o ver<strong>di</strong> sono <strong>di</strong> fatto equivalenti,<br />
in quanto un gruppo <strong>di</strong> geni che viene definito<br />
come “up-regolato” in un confronto ad esempio fra<br />
Sieglinde rispetto a Spunta, si definirebbe “downregolato”<br />
confrontando Sieglinde rispetto a Spunta;<br />
in realtà anche le zone bianche corrispondono a<br />
categorie funzionali non interamente indotte o represse,<br />
ma in cui un numero pressappoco uguale <strong>di</strong><br />
geni è up- o down-regolato, ma pur sempre regolato.<br />
Di conseguenza, ciò che è rilevante in queste<br />
heat maps è la presenza <strong>di</strong> zone rosse (maggioranza<br />
<strong>di</strong> geni afferenti a quella categoria funzionale up-regolati)<br />
o ver<strong>di</strong> (maggioranza down-regolata nel confronto),<br />
ed in misura minore bianche (uguale quantità<br />
<strong>di</strong> geni indotti e repressi nella categoria), rispetto<br />
a quelle grigie (che segnalano mancata regolazione<br />
<strong>di</strong> praticamente tutti i geni <strong>di</strong> quella categoria).<br />
Come si può notare nella parte destra della tavola<br />
<strong>di</strong> Figura 3, dove sono riassunti i confronti fra località<br />
<strong>di</strong>verse delle stesse regioni e <strong>varietà</strong>, le classi<br />
metaboliche <strong>di</strong> geni che non variano sono la maggioranza<br />
(zone grigie). È interessante peraltro notare<br />
come in quasi tutti i confronti che riguardano due<br />
località, a parità <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> e regione, il gruppo <strong>di</strong><br />
geni afferenti al metabolismo secondario e alla risposta<br />
agli stress venga quasi sempre regolato, suggerendo<br />
che gli effetti maggiori della località siano<br />
soprattutto legati a situazioni contingenti <strong>di</strong> stress<br />
cui le colture si trovano a far fronte più che a fattori<br />
costitutivi. Ancora da notare il fatto che, come atteso,<br />
nel confronto fra le due <strong>varietà</strong> (sezione sinistra<br />
della tavola), siano sempre regolate quasi tutte le<br />
categorie, e nella maggior parte dei casi in maniera<br />
concorde in un senso o nell’altro (zone rosse e<br />
ver<strong>di</strong>), ed in una minoranza <strong>di</strong> casi in maniera <strong>di</strong>suguale,<br />
parte indotta e parte repressa (zone bianche).<br />
Solo nel confronto fra Spunta e Sieglinde in<br />
una specifica località, due categorie funzionali (<strong>di</strong><br />
cui una, Other, onnicomprensiva) non sono risultate<br />
regolate. In qualche modo, il fatto che la maggioranza<br />
dei geni sia significativamente regolata in tutte<br />
le categorie funzionali per entrambi in confronti fra<br />
<strong>varietà</strong>, rafforza la nozione che le <strong>di</strong>fferenze varietali<br />
sono risultate ben più importanti <strong>di</strong> quelle dovute<br />
all’ambiente <strong>di</strong> coltivazione. Inoltre, i geni che appaiono<br />
<strong>di</strong>fferenzialmente regolati fra le <strong>varietà</strong> (Tabella<br />
II) risultano uniformemente <strong>di</strong>stribuiti in tutte le categorie<br />
funzionali, mentre per esempio i geni collegati<br />
alla crescita cellulare e ai processi biosintetici,<br />
sono in quasi tutti i confronti fra regioni e località<br />
non regolati (righe 3 e 18 rispettivamente della heat<br />
map), come atteso da tuberi maturati contemporaneamente<br />
ed in con<strong>di</strong>zione <strong>di</strong> dormienza.<br />
Come si nota dalla Figura 3, sono anche molto numerosi<br />
i geni che vengono segnalati come regolati, ma<br />
che non trovano omologhi funzionali in nessuna banca<br />
dati (no hits found) oppure anche perché gli omologhi<br />
hanno funzione sconosciuta (not assigned). Il limite<br />
nell’uso <strong>di</strong> uno strumento come il microarray risiede<br />
nel fatto quin<strong>di</strong> che, pur essendo stato interamente<br />
sequenziato il genoma <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, la sua annotazione<br />
funzionale non è ancora completa. Di conseguenza, i<br />
dati ottenibili con questi confronti sono moltissimi, e<br />
richiederebbero <strong>di</strong> analizzare in dettaglio tutti questi<br />
geni sconosciuti ma potenzialmente importanti.<br />
L’analisi sui campioni 2008 si è poi rivolta ad in<strong>di</strong>viduare<br />
quali fossero specificatamente i geni che<br />
mostravano la regolazione maggiormente alterata in<br />
18 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA ONOFRI<br />
Figura 3. — A) “Heat map” delle classi <strong>di</strong> geni up-, down- e non regolati nei <strong>di</strong>versi confronti effettuati nel 2008; B) “Heat map” delle classi<br />
<strong>di</strong> geni up-, down- e non regolati nei <strong>di</strong>versi confronti effettuati nel 2009.<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 19
ONOFRI TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA<br />
senso positivo o negativo tra i confronti considerati,<br />
nell’ipotesi che l’attività <strong>di</strong> questi geni, se riproducibile<br />
fra le annate, possa fare da “marcatore” del<br />
luogo <strong>di</strong> coltivazione. Un’altra informazione <strong>di</strong> interesse<br />
è rappresentata da quali geni siano sempre<br />
regolati, ogni volta che si confrontano ad esempio<br />
<strong>di</strong>verse <strong>varietà</strong>, o <strong>di</strong>verse località, nell’ipotesi che ci<br />
siano marcatori “funzionali” costanti della <strong>varietà</strong> o<br />
del luogo <strong>di</strong> coltivazione. Questi geni che si sono<br />
mostrati <strong>di</strong>fferenzialmente espressi in tutti i confron-<br />
ti <strong>di</strong> un determinato tipo (es. fra <strong>varietà</strong>, fra regioni,<br />
o fra località) sono elencati, con la loro annotazione<br />
funzionale quando <strong>di</strong>sponibile, in Tabella III. Alcune<br />
in<strong>di</strong>cazioni possono essere <strong>di</strong> interesse preliminare,<br />
dato che alcuni geni <strong>di</strong>fferenzialmente regolati<br />
sono correlabili in parte con alcune caratteristiche<br />
qualitative del tubero. Così, in tutti e tre confronti fra<br />
regioni in cui la cv. Sieglinde è stata confrontata con<br />
quella coltivata in Puglia, si è sempre osservata la repressione<br />
del gene co<strong>di</strong>ficante per la endo-1,4-beta<br />
Tabella III.
TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA ONOFRI<br />
D-glucanasi, un enzima coinvolto nella sintesi e nel<br />
modellamento delle pareti cellulari, putativamente<br />
in grado <strong>di</strong> influenzare la consistenza e tessitura dei<br />
tuberi 12; nei confronti con la cv. Sieglinde coltivata<br />
a Sciali (Puglia), si è sistematicamente osservata,<br />
nelle altre località della stessa regione, un’induzione<br />
del gene per una putativa proteina AIM1, che gioca<br />
un ruolo nella beta-ossidazione degli aci<strong>di</strong> grassi e<br />
nello sviluppo dell’ aroma e del gusto dei tuberi 13.<br />
Sulla base <strong>di</strong> questi dati preliminari, si è poi considerato<br />
l’effetto, presumibilmente molto grande, delle<br />
annate <strong>di</strong> coltivazione sulla regolazione <strong>di</strong>fferenziale<br />
<strong>di</strong> questi geni e classi <strong>di</strong> geni. Sfortunatamente, le<br />
vere repliche biologiche fra il 2008 ed il 2009 sono<br />
state molto limitate, e i confronti fra annate hanno<br />
quin<strong>di</strong> solo un valore relativo.<br />
Confronto fra i campioni del 2009<br />
In Tabella II sono sintetizzati quantitativamente i<br />
risultati dei confronti che è stato possibile fare nel<br />
2009. Va sottolineato che nessuno dei confronti effettuati<br />
costituisce <strong>di</strong> fatto la replica esatta <strong>di</strong> quelli<br />
del 2008; ciò perché il materiale utilizzato in questo<br />
lavoro è quello effettivamente coltivato in aziende<br />
non sperimentali nei vari siti.<br />
Il confronto fra due <strong>varietà</strong> (le stesse utilizzate nel<br />
2008, anche se la località e la regione <strong>di</strong> coltura era<br />
<strong>di</strong>versa) mostra che 1070 geni sono <strong>di</strong>fferenzialmente<br />
espressi in maniera significativa. Questo numero<br />
è nettamente più alto <strong>di</strong> quello osservato nel 2008<br />
(457 in me<strong>di</strong>a) ma comunque dello stesso or<strong>di</strong>ne <strong>di</strong><br />
grandezza. Tuttavia, l’effetto dell’annata risulta preponderante<br />
rispetto ad ogni altra <strong>di</strong>fferenza; infatti,<br />
come si può vedere dalla Figura 3B, le categorie <strong>di</strong><br />
geni <strong>di</strong>fferenzialmente espressi fra le <strong>varietà</strong> a parità<br />
<strong>di</strong> località sono la maggioranza, come nel 2008, ma<br />
le classi non regolate non sono le stesse dell’annata<br />
precedente, il che suggerisce che la maggior parte<br />
delle up- o down-regolazioni che si osservano siano<br />
dovute a con<strong>di</strong>zioni contingenti quali presenza<br />
<strong>di</strong> stress localizzati o risposte a con<strong>di</strong>zioni ambientali<br />
<strong>di</strong>verse, più che a reali <strong>di</strong>fferenze strutturali che<br />
concorrano alla specificità della <strong>varietà</strong>. L’estrema<br />
<strong>di</strong>pendenza dell’ espressione genica da fattori legati<br />
all’annata è confermata dal numero <strong>di</strong> geni <strong>di</strong>fferenzialmente<br />
regolati nel confronto fra regioni (Tabella<br />
II), che nel 2008 erano in me<strong>di</strong>a appena 86, mentre<br />
nel 2009 risultano oltre 1300. Tale grande variazione<br />
può essere in parte ascritta al fatto che si stanno<br />
osservando confronti fra località per la maggioranza<br />
non ripetuti nei due anni; tuttavia anche nell’unico<br />
caso in cui si utilizza la stessa <strong>varietà</strong> (Spunta) per un<br />
confronto fra le stesse località e regioni nelle due annate<br />
(Cozze, Puglia vs. Cassibile, Sicilia, 2008 e 2009)<br />
la <strong>di</strong>fferenza nel numero <strong>di</strong> geni regolati è molto marcata<br />
(219 nel 2008 e 1991 nel 2009). Inoltre, come si<br />
osserva dalla Tabella II, l’effetto delle località, che nel<br />
2008 sembrava molto limitato, nel 2009 è al contrario<br />
quello che provoca un maggior numero <strong>di</strong> importanti<br />
regolazioni dell’espressione genica, come si può<br />
notare anche dall’assenza delle zone grigie (classi <strong>di</strong><br />
geni non regolate) nella sezione più a destra <strong>di</strong> Figura<br />
3B in confronto alla Figura 3A, dove erano invece<br />
la maggioranza. Nel 2009 rispetto al 2008, in sintesi,<br />
sembra aver avuto molta più importanza il fattore<br />
località nell’induzione/repressione <strong>di</strong> geni del tubero<br />
maturo. Questo è probabilmente legato a fattori<br />
climatici o epidemiologici, che quin<strong>di</strong> interferiscono<br />
pesantemente con la possibilità <strong>di</strong> in<strong>di</strong>viduare in maniera<br />
riproducibile geni o classi <strong>di</strong> geni regolati in<br />
risposta alle con<strong>di</strong>zioni locali <strong>di</strong> coltivazione.<br />
Conclusioni<br />
Dalle esperienze fatte con l’uso del microarray<br />
POCI 4X44K per l’analisi dell’espressione genica in<br />
tuberi maturi e dormienti <strong>di</strong> <strong>patata</strong>, si possono trarre<br />
alcune conclusioni preliminari ed alcuni suggerimenti<br />
sul possibile proseguimento del lavoro.<br />
In primo luogo, dal momento che l’effetto dell’annata<br />
è assolutamente preponderante su effetti strettamente<br />
genetici come quelli legati a <strong>di</strong>fferenze varietali,<br />
è evidente che per “calibrare” uno strumento<br />
basato sulla trascrittomica in grado <strong>di</strong> in<strong>di</strong>viduare<br />
caratteristiche legate al luogo <strong>di</strong> coltivazione, occorre<br />
analizzare dati per un numero <strong>di</strong> annate sufficiente<br />
a “neutralizzare” la variabilità legata a tale dato,<br />
non interessante ai fini della <strong>tipizzazione</strong>. Questo<br />
problema è particolarmente importante per l’analisi<br />
<strong>di</strong> espressione, in quanto altri livelli <strong>di</strong> analisi quali<br />
quella del metaboloma dei tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong> non risentono<br />
così tanto delle fluttuazioni ambientali, in<br />
quanto solo una limitata percentuale delle variazioni<br />
nei trascritti si traduce poi in un fenotipo finale<br />
variante e stabile a maturità; la maggior parte delle<br />
variazioni a livello <strong>di</strong> mRNA non ha infatti necessariamente<br />
effetti fenotipici e qualitativi visibili a livello<br />
<strong>di</strong> metaboliti. L’estrema sensibilità dell’analisi a<br />
livello trascrizionale, evidenziato anche dai risultati<br />
riportati, rende <strong>di</strong>fficilmente utilizzabile l’impiego <strong>di</strong><br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 21
ONOFRI TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA<br />
queste tecniche, tra<strong>di</strong>zionalmente utili in ricerche<br />
svolte in ambiente controllato, su materiali <strong>di</strong> campo,<br />
a meno <strong>di</strong> non aver svolto una prolungata analisi<br />
dell’effetto dell’annata sulla trascrizione genica.<br />
A parte i limiti <strong>di</strong> cui si è <strong>di</strong>scusso, è evidente che<br />
la stessa sensibilità che può costituire un problema,<br />
è anche una risorsa in quanto la massa <strong>di</strong> dati ottenibili<br />
per ciascuna con<strong>di</strong>zione analizzata (<strong>varietà</strong>, regione,<br />
località) costituisce un patrimonio <strong>di</strong> informazioni<br />
il cui accumulo nel tempo potrà davvero fornire<br />
un quadro interessantissimo della risposta, a livello<br />
dell’espressione genica, dei tuberi alle con<strong>di</strong>zioni ambientali<br />
nelle quali maturano. Basti considerare che<br />
per ogni coppia <strong>di</strong> confronti effettuati in questo lavoro,<br />
sono stati ottenuti dati relativi a circa 42000 geni<br />
<strong>di</strong> <strong>patata</strong>, molte delle quali a funzione ignota e potenzialmente<br />
importanti nella risposta all’ambiente della<br />
pianta. Una via per l’utilizzazione <strong>di</strong> questi dati è la<br />
costituzione <strong>di</strong> database <strong>di</strong> sequenze espresse nelle<br />
varie località il cui prodotto si voglia tipizzare; ma,<br />
soprattutto, la possibilità <strong>di</strong> incrociare ed integrare i<br />
dati <strong>di</strong> espressione come quelli qui descritti, con i<br />
dati relativi al profilo proteico e metabolico dei tuberi<br />
maturati nelle stesse con<strong>di</strong>zioni, in modo da costituire<br />
un profilo unico <strong>di</strong> ciascuna combinazione fra <strong>varietà</strong><br />
e luogo <strong>di</strong> origine del prodotto.<br />
Un altro elemento da prendere in considerazione<br />
per valutare l’analisi del trascrittoma me<strong>di</strong>ante microarray<br />
come elemento <strong>di</strong> <strong>caratterizzazione</strong> della<br />
<strong>patata</strong>, è che i confronti sono stati effettuati su tuberi<br />
maturi e dormienti; da notare che, almeno nel materiale<br />
del 2009, il numero <strong>di</strong> geni <strong>di</strong>fferenzialmente<br />
espressi è stato comparabile a quello riportato da<br />
Ducreux et al. (2008), ma che in ogni caso il numero<br />
<strong>di</strong> geni che mostra regolazione è piuttosto basso<br />
rispetto al numero <strong>di</strong> sequenze rappresentate sul<br />
microarray (intorno al 4-5% al massimo). Questo è<br />
probabilmente dovuto al fatto che si sono esaminati<br />
tuberi dormienti, e che forse per questo specifico<br />
livello <strong>di</strong> analisi, una fase pre-maturità, durante la<br />
quale il tubero in sviluppo potrebbe essere maggiormente<br />
influenzato da specifiche con<strong>di</strong>zioni ambientali,<br />
potrebbe essere più in<strong>di</strong>cata <strong>di</strong> un’analisi dei<br />
trascritti <strong>di</strong> un tubero ormai entrato in dormienza.<br />
Questa ulteriore possibilità andrà monitorata nel lavoro<br />
futuro, confrontando una stessa <strong>varietà</strong> in due<br />
<strong>di</strong>verse località, ben caratterizzate nelle loro <strong>di</strong>fferenze<br />
climatiche ambientali e pedologiche, in almeno<br />
2 o 3 fasi dello sviluppo del tubero prima della<br />
maturazione; è possibile che la regolazione <strong>di</strong> geni<br />
che governano l’accrescimento ed il riempimento<br />
del tubero, ovviamente esclusi dall’analisi effettuata<br />
su tuberi maturi, possa fornire in<strong>di</strong>cazioni più utili ai<br />
fini <strong>di</strong> una <strong>caratterizzazione</strong> geografica.<br />
L’analisi <strong>di</strong> espressione genica fornisce dunque un<br />
prezioso supporto ad altre modalità <strong>di</strong> analisi del<br />
prodotto tubero, ma la sua complessità è tale da<br />
richiedere attente indagini preliminari, ripetute in<br />
molte annate ed in <strong>di</strong>verse e ben caratterizzate con<strong>di</strong>zioni<br />
ambientali.<br />
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13. Fischer RL, Bennett AB. Role of cell wall hydrolases in fruit ripening.<br />
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1991;42:675-703.<br />
Finanziamenti.—Lavoro svolto con il finanziamento del MiPAF per il<br />
progetto TIPIPAPA (Tipicizzazione e <strong>caratterizzazione</strong> <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>precoci</strong><br />
<strong>di</strong> <strong>patata</strong> con l’impiego <strong>di</strong> tecniche molecolari e spettroscopiche).<br />
22 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):23-34<br />
Progettazione e sintesi <strong>di</strong> DNA ricombinante<br />
come standard per la determinazione quantitativa<br />
<strong>di</strong> ingre<strong>di</strong>enti geneticamente mo<strong>di</strong>ficati in alimenti<br />
A. CIRILLO, S. DEL GAUDIO, G. DI BERNARDO, F. GAGLIONE, U. GALDERISI, M. CIPOLLARO<br />
L ’impiego <strong>di</strong> Organismi Geneticamente Mo<strong>di</strong>ficati<br />
(OGM) e <strong>di</strong> prodotti derivati da OGM nella catena<br />
alimentare è sottoposto a precise regolamentazioni<br />
in <strong>di</strong>versi paesi allo scopo <strong>di</strong> garantire la libertà<br />
<strong>di</strong> scelta dei consumatori. L’Unione Europea<br />
ha reso obbligatoria l’etichettatura dei cibi nei casi<br />
in cui in essi sia presente una percentuale maggiore<br />
dello 0.9% <strong>di</strong> ingre<strong>di</strong>enti geneticamente mo<strong>di</strong>ficati<br />
(Reg.1829/2003) 1. Lo sviluppo <strong>di</strong> meto<strong>di</strong> affidabili<br />
per la quantificazione <strong>di</strong> OGM assume pertanto un<br />
ruolo sempre crescente.<br />
L’amplificazione del DNA attraverso PCR real<br />
time 2 (reazione a catena della polimerasi in tempo<br />
reale) costituisce attualmente l’analisi <strong>di</strong> elezione<br />
per la rilevazione <strong>di</strong> OGM nelle matrici alimentari<br />
in quanto permette <strong>di</strong> sfruttare l’alta sensibilità<br />
della meto<strong>di</strong>ca per ottenere la quantificazione del<br />
contenuto <strong>di</strong> OGM 3.<br />
Nelle reazioni <strong>di</strong> PCR real time, per la costruzione<br />
delle curve <strong>di</strong> riferimento, vanno inclusi una serie<br />
<strong>di</strong> calibratori che, <strong>di</strong> norma, sono costituiti dal DNA<br />
estratto da farine ottenute dalle cultivar vegetali <strong>di</strong><br />
interesse, certificate dall’Istituto <strong>di</strong> Riferimento per<br />
i Materiali e le Misure (IRMM, Belgio). L’impiego<br />
<strong>di</strong> tali farine presenta, tuttavia, alcuni punti deboli:<br />
innanzitutto la deperibilità dei materiali, il loro costo<br />
e l’impossibilità <strong>di</strong> reperire materiale certificato<br />
per tutti gli eventi geneticamente mo<strong>di</strong>ficati (GM).<br />
Come calibratori alternativi si possono impiegare<br />
molecole <strong>di</strong> DNA ricombinante costituite da un vet-<br />
Autore <strong>di</strong> contatto: G. Di Bernardo, Sezione <strong>di</strong> Biotecnologie e Biologia<br />
Molecolare “A. Cascino”,Dipartimento <strong>di</strong> Me<strong>di</strong>cina Sperimentale,<br />
Seconda Università degli Stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138<br />
Napoli, Italia. E-mail: gianni.<strong>di</strong>bernardo@unina2.it<br />
Sezione <strong>di</strong> Biotecnologie e Biologia Molecolare “A. Cascino”<br />
Dipartimento <strong>di</strong> Me<strong>di</strong>cina Sperimentale<br />
Seconda Università degli Stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> Napoli, Napoli, Italia<br />
tore plasmi<strong>di</strong>co in cui sono integrate <strong>di</strong>fferenti sequenze<br />
bersaglio quali le sequenze transgeniche e<br />
quelle del gene endogeno <strong>di</strong> riferimento 4. L’impiego<br />
<strong>di</strong> DNA ricombinante come standard rappresenta<br />
un’interessante innovazione nell’ambito della certificazione<br />
OGM. In letteratura sono, infatti, presenti<br />
<strong>di</strong>versi lavori 4-7 che hanno come scopo la sintesi e<br />
l’utilizzo <strong>di</strong> questi calibratori, testimoniando il notevole<br />
interesse per questo argomento. Innanzitutto il<br />
DNA plasmi<strong>di</strong>co può essere prodotto in quantità illimitata<br />
attraverso il clonaggio in cellule batteriche. Le<br />
collaudate procedure <strong>di</strong> estrazione e conservazione<br />
consentono <strong>di</strong> ottenere un DNA altamente purificato<br />
e <strong>di</strong> poter costruire curve <strong>di</strong> calibrazione in un qualunque<br />
intervallo <strong>di</strong> concentrazione. La possibilità<br />
<strong>di</strong> effettuare un’analisi quantitativa anche nei casi<br />
in cui non siano <strong>di</strong>sponibili gli standard certificati<br />
dall’IRMM costituisce il vantaggio maggiore offerto<br />
da queste molecole.<br />
In questo lavoro viene descritta la progettazione<br />
e realizzazione <strong>di</strong> un calibratore plasmi<strong>di</strong>co per la<br />
quantificazione della <strong>patata</strong> EH92-527-1, unica <strong>varietà</strong><br />
<strong>di</strong> <strong>patata</strong> GM ammessa alla commercializzazione<br />
in Europa, ottenuta dalla cultivar Prevalent, attraverso<br />
l’introduzione del gene “GBSS” (granule bond<br />
starch syntase protein), deputato alla produzione <strong>di</strong><br />
amilosio. La <strong>varietà</strong> contiene il 98% <strong>di</strong> amilopectina<br />
ed il 2% <strong>di</strong> amilosio contro l’85% <strong>di</strong> amilopectina ed<br />
il 15% <strong>di</strong> amilosio della cultivar tra<strong>di</strong>zionale, pertan-<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 23
CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE<br />
to il tubero GM, contenendo una minore quantità<br />
<strong>di</strong> amilosio, si presta meglio alla lavorazione industriale.<br />
Il calibratore plasmi<strong>di</strong>co descritto in questo lavoro<br />
contiene in tandem due frammenti target (evento-specifico<br />
e specie-specifico) necessari per la determinazione<br />
quantitativa <strong>di</strong> EH92-527-1 attraverso<br />
la PCR real time. La costruzione del tandem è stata<br />
ottenuta utilizzando la tecnica della PCR overlapping<br />
4 che prevede l’uso <strong>di</strong> primer progettati ad<br />
hoc per ottenere ampliconi parzialmente complementari<br />
tra loro.<br />
Nell’ambito della tracciabilità dei prodotti OGM<br />
lungo la filiera produttiva è stato affrontato il problema<br />
della loro rilevabilità anche in prodotti lavorati.<br />
Infatti, mentre l’amplificazione del DNA estratto da<br />
matrici non lavorate (semi, foglie) o poco lavorate<br />
(sfarinati) non presenta particolari problemi, l’analisi<br />
dei prodotti lavorati risulta più <strong>di</strong>fficoltosa poiché<br />
i proce<strong>di</strong>menti meccanici, termici e chimici possono<br />
danneggiare il DNA causando idrolisi, depurinazione,<br />
cross-linking ed ossidazione 8. È stato anche<br />
<strong>di</strong>mostrato 9, 10 che i meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> estrazione possono<br />
avere un effetto significativo sulla resa e sulla qualità<br />
del DNA e che ciascuna matrice alimentare richiede,<br />
pertanto, l’in<strong>di</strong>viduazione del metodo <strong>di</strong> estrazione<br />
più appropriato o l’ottimizzazione <strong>di</strong> esso. La presenza<br />
<strong>di</strong> un DNA danneggiato e frammentato comporta<br />
una ridotta efficienza <strong>di</strong> amplificazione o, ad<strong>di</strong>rittura,<br />
l’impossibilità <strong>di</strong> rilevare le sequenze target<br />
quando si utilizzano ingre<strong>di</strong>enti processati o quando<br />
questi ingre<strong>di</strong>enti siano presenti in tracce. La strategia<br />
<strong>di</strong> preamplificazione, una tecnica <strong>di</strong> biologia<br />
molecolare che consente <strong>di</strong> aumentare la sensibilità<br />
della PCR Real time e conseguentemente il numero<br />
<strong>di</strong> target analizzabili in DNA estratti da alimenti<br />
lavorati 11 è stata applicata alla rilevazione <strong>di</strong> OGM<br />
in prodotti lavorati contenenti mais e/o soia con<br />
l’obiettivo <strong>di</strong> risolvere le problematiche su esposte.<br />
Materiali e meto<strong>di</strong><br />
Materiali<br />
Sono stati usati materiali <strong>di</strong> riferimento (Sigma-<br />
Aldrich St. Louis, UK) certificati dall’IRMM contenenti<br />
100% (ERM-BF421b) e 0% (ERM-BF421a) <strong>di</strong><br />
farina <strong>di</strong> <strong>patata</strong> EH92-527-1, 5% (ERM-BF412f), 1%<br />
(ERM-BF412d) e 0.1% (ERM-BF412b) <strong>di</strong> farina <strong>di</strong><br />
mais Bt11, 5% (ERM-BF410f), 1% (ERM-BF410d) e<br />
0.1% (ERM-BF410b) <strong>di</strong> farina <strong>di</strong> soia RR. I campioni<br />
<strong>di</strong> controllo (GeMSU09A, GeMSU09B, GeMSU22A<br />
e GeMSU22B) sono stati acquisiti presso il “Central<br />
Science Laboratory”, (UK) nell’ambito del circuito<br />
FAPAS (Proficiency testing schemes).<br />
Le matrici alimentari (farina <strong>di</strong> soia, polenta, snack<br />
salato, snack al mais, meren<strong>di</strong>na alla frutta, pane <strong>di</strong><br />
soia, latte <strong>di</strong> soia) sono state reperite in negozi locali,<br />
ad eccezione del mix shake e dei semi <strong>di</strong> soia<br />
tostati, forniti da un agente <strong>di</strong> ven<strong>di</strong>ta.<br />
Primer e sonde TaqMan<br />
Le sequenze dei primer e delle sonde TaqMan<br />
(ADH1, LE1, p35S, tNOS, mais Bt11, soia RR)<br />
sono quelle riportate nella norma UNI EN ISO<br />
21570:2005 12. Le sequenze dei primer e delle sonde<br />
specifiche dell’evento transgenico EH92-527-1<br />
sono suggerite dal protocollo <strong>di</strong> amplificazione<br />
proposto dal Community Reference Laboratory<br />
(CRL). I primer e le sonde TaqMan per l’amplificazione<br />
del gene endogeno UDP-glucose pyrophosphorylase<br />
(UGP-ase), per il gene co<strong>di</strong>ficante per<br />
il tRNA della leucina (tRNA leu) e per la sequenza<br />
co<strong>di</strong>ficante il terminatore del gene della nopalina<br />
sintasi (tNOS) sono stati <strong>di</strong>segnati impiegando il<br />
software Primer Express 5.0 (Applied Biosystems).<br />
Il primer St527-r1- tail è stato progettato “ad hoc”<br />
per la esecuzione della PCR overlapping.<br />
Per la progettazione dei primer specifici per tLeu,<br />
un gene plasti<strong>di</strong>ale altamente conservato nelle specie<br />
vegetali, sono state allineate sequenze <strong>di</strong> mais,<br />
soia, colza, grano, riso, cotone e <strong>patata</strong>. La presenza<br />
<strong>di</strong> <strong>di</strong>versi polimorfismi nella sequenza compresa tra<br />
i primer ha impe<strong>di</strong>to la progettazione <strong>di</strong> una sonda<br />
e pertanto l’amplificazione in PCR Real time <strong>di</strong> tLeu<br />
è stata effettuata impiegando, in alternativa, l’intercalante<br />
aspecifico SYBR Green.<br />
I primer e le sonde sono state preparate in parte<br />
dalla <strong>di</strong>tta Eurofins MWG Operon, in parte dalla <strong>di</strong>tta<br />
Life Technologies.<br />
Meto<strong>di</strong><br />
EstrazionE dEl dna<br />
Le matrici alimentari sono state polverizzate attraverso<br />
l’uso <strong>di</strong> mortaio e pestello in presenza <strong>di</strong><br />
azoto liquido. L’estrazione del DNA è stata effettuata<br />
impiegando un metodo basato sull’utilizzo del bromuro<br />
<strong>di</strong> cetil-trimetilammonio (CTAB) secondo il<br />
protocollo descritto in UNI EN ISO 21571:2005 13.<br />
Tutte le estrazioni sono state condotte in duplica-<br />
24 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO<br />
to. La concentrazione del DNA è stata determinata<br />
impiegando lo spettrofotometro Nanodrop ND1000<br />
(Thermo Scientific, Wilmington, DE). L’integrità del<br />
DNA estratto è stata verificata me<strong>di</strong>ante corsa elettroforetica<br />
su gel <strong>di</strong> agarosio all’1% in TE (Tris-EDTA).<br />
rEalizzazionE dEl calibratorE plasmi<strong>di</strong>co: pcr ovErlapping<br />
Amplificazione del DNA da farina <strong>di</strong> <strong>patata</strong> con<br />
primer specie-specifici ed evento specifici.<br />
Le reazioni <strong>di</strong> amplificazione dei frammenti target<br />
nella prima fase della PCR sono state condotte impiegando<br />
100ng <strong>di</strong> DNA estratto da farina <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
100% OGM in un volume totale <strong>di</strong> 25 µl <strong>di</strong> una solu-<br />
zione 3 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH<br />
9.0, 0.1% Triton X-100, 200 µM dNTP e 2.5 U <strong>di</strong> AmpliTaq<br />
Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems)<br />
(Figura 1).<br />
Il primer St527-r1- tail è costituito, a partire<br />
dall’estremità 5’, da 12 nucleoti<strong>di</strong> complementari ad<br />
un tratto dell’estremità 5’ del primer UGPf e con<strong>di</strong>vide<br />
poi la sequenza dei primi 15 nucleoti<strong>di</strong> del primer<br />
st 527-r, in modo tale che l’amplicone ottenuto<br />
con i primer Event 527 bf1 e St527-r1-tail contenga<br />
una sequenza complementare all’amplicone ottenuto<br />
con i primer UGPf e UGPr.<br />
Dopo una fase <strong>di</strong> denaturazione iniziale del DNA<br />
a 95 °C per 6 minuti, i 35 cicli <strong>di</strong> amplificazione<br />
prevedono una fase <strong>di</strong> denaturazione a 95 °C per 45<br />
Figura 1. — Schema semplificativo della reazione <strong>di</strong> PCR overlapping. In una prima reazione <strong>di</strong> PCR vengono amplificati separatamente<br />
il frammento evento-specifico e quello specie-specifico. In una seconda reazione <strong>di</strong> PCR i prodotti della prima amplificazione vengono<br />
miscelati in eguale quantità e sottoposti ad amplificazione. Il risultato è l’integrazione in tandem dei due ampliconi. Il riquadro rappresenta<br />
uno sta<strong>di</strong>o interme<strong>di</strong>o della seconda reazione <strong>di</strong> PCR in cui le estremità 3’ delle molecole ibride sono estese dalla Taq DNA polimerasi.<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 25
CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE<br />
secon<strong>di</strong>, una fase <strong>di</strong> annealing ed estensione a 60°C<br />
per 45 secon<strong>di</strong>.<br />
Le sequenze dei primer (evento-specifici) Event<br />
527 bf1 e St527-r1- tail, dei primer (specie-specifici)<br />
UGPf e UGPr <strong>di</strong>retti contro una porzione del gene<br />
UGP-ase e le relative concentrazioni d’uso sono riportate<br />
in Tabella I, pannello A.<br />
Blunt en<strong>di</strong>ng degli ampliconi.<br />
Il trattamento con la T4 DNA polimerasi è stato<br />
condotto in un volume totale <strong>di</strong> 100 µl <strong>di</strong> una soluzione<br />
165 mM tris-acetato pH 7.9, 330 mM so<strong>di</strong>o<br />
acetato, 50 mM DTT, 100 µM dNTP, 10 U T4 DNA<br />
polimerasi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in presena<br />
<strong>di</strong> 3µl <strong>di</strong> prodotto <strong>di</strong> PCR. La miscela è stata incubata<br />
a 11°C per 15 minuti, in ghiaccio per 2 minuti<br />
ed incubata a 75°C per 10 minuti per l’inattivazione<br />
dell’enzima.<br />
Integrazione in tandem dei frammenti specie-specifici<br />
ed evento specifici.<br />
La reazione <strong>di</strong> amplificazione della seconda fase<br />
della PCR overlapping è stata condotta in un volume<br />
totale <strong>di</strong> 25 µl <strong>di</strong> una soluzione 1,5 mM MgCl 2, 50 mM<br />
KCl, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 0,1% Triton X-100, 200<br />
µM dNTP, 0.2 µM <strong>di</strong> ciascun primer (Event 527bf1 ed<br />
UGPr), 2,5 U <strong>di</strong> AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied<br />
Biosystems) in presenza <strong>di</strong> 0,5 µl del prodotto <strong>di</strong><br />
PCR ottenuto per l’amplificazione del gene endogeno<br />
UGP-ase e 0,5 µl del prodotto <strong>di</strong> PCR evento-specifico<br />
dopo trattamento con T4 DNA polimerasi. Dopo una<br />
fase <strong>di</strong> denaturazione iniziale del DNA a 95 °C per 6<br />
minuti, i 40 cicli <strong>di</strong> amplificazione prevedono una fase<br />
<strong>di</strong> denaturazione a 95 °C per 45 secon<strong>di</strong>, una fase <strong>di</strong><br />
annealing ed estensione a 60 °C per 45 secon<strong>di</strong>.<br />
La <strong>di</strong>mensione attesa dell’amplicone è <strong>di</strong> 196 bp.<br />
tabElla i. — Sequenze dei primer e delle sonde utilizzate per la realizzazione del calibratore plasmi<strong>di</strong>co (Pannello A) e per la<br />
preamplificazione (Pannello B). Da sinistra a destra troviamo il target, il nome del primer e della sonda, le sequenze, le concentrazioni<br />
d’uso e le <strong>di</strong>mensioni attese dell’amplicone.<br />
Target<br />
Pannello A<br />
Primer e sonda Sequenza Concentrazione (nM)<br />
Dimensione<br />
dell’amplicone<br />
UGP-ase UGP f 5’-TGGCCTCTGTGGTGGACAA-3’ 900<br />
UGPr 5’-TCTCTTCACATGTCCAAACCATCT-3’ 300<br />
62<br />
UGP probe 5’-VIC-CTGAGGGAAGCGAGACT-BHQ-3’ 100<br />
Evento EH92-527-1 Event 527 bf1 5’-GTGTCAAAACACAATTTACAGCA-3’ 900<br />
St527-r1 5’-TCCCTTAATTCTCCGCTCATGA-3’ 900<br />
134<br />
St527-S1 5’-FAM-AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-TAMRA-3’ 160<br />
Pannello B<br />
St527-r1- tail 5’-CCACAGAGGCCATCCCTTATTCTCCG-3’ 100 196<br />
Leu tRNA tLeu F 5’-TCCAAATTCAGAGAAACCCTGG-3’ 200 180 bp<br />
tLeu R 5’-GCTAAGCAATCTTGTCGAAGGT-3’ 200<br />
ADH1 ADH F3 5’-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3’ 300 134 bp<br />
ADH R4 5’-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3’ 300<br />
ADH1-MDO 5’-FAM-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-TAMRA-3’ 200<br />
LE1 GM1-F 5’-CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC-3’ 600 74 bp<br />
GM1-R 5’-GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC-3’ 600<br />
Sonda GM1 5’-FAM-CTTCACCTTCTATGCCCCTGACAC-TAMRA-3’ 120<br />
p35S 35S-F 5’-GCCTCTGCCGACAGTGGT-3’ 300 82 bp<br />
35S-R 5’-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’ 900<br />
35S-TMP 5’-FAM-CAAAGATGGACCCCCACCCAC-TAMRA-3’ 100<br />
tNOS tNOS-F 5’-CAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAG-3’ 300 98 bp<br />
tNOS-R 5’-TTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAG-3’ 300<br />
Sonda tNOS 5’-FAM-TCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-TAMRA-3’ 120<br />
Evento Bt11 Bt11 3JF 5’-GCGGAACCCCTATTTGTTTA-3’ 750 70 bp<br />
Bt11 3JR 5’-TCCAAGAATCCCTCCATGAG-3’ 750<br />
Bt11 3JFT 5’-FAM-AAATACATTCAAATATGTATCCGCTCA-TAMRA-3’ 250<br />
Costrutto RR RR1-F 5’-CATTTGGAGAGGACACGCTGA-3’ 600 74 bp<br />
RR1-R 5’-GAGCCATGTTGTTAATTTGTGCC-3’ 600<br />
Sonda RR1 5’-FAM-CAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTC-TAMRA-3’ 120<br />
26 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO<br />
clonaggio dEl costrutto in cEllulE battErichE<br />
Gli ampliconi ibri<strong>di</strong> ottenuti dalla PCR overlapping<br />
sono stati integrati nel plasmide pCR 2.1 attraverso<br />
l’uso del kit TA Cloning Kit (Invitrogen), clonati<br />
in cellule batteriche chimicamente competenti<br />
<strong>di</strong> E. coli “One Shot Top 10 Chemically Competent<br />
E. coli” (Invitrogen) secondo le in<strong>di</strong>cazioni del fornitore<br />
e piastrate su un terreno <strong>di</strong> coltura selettivo<br />
contenente ampicillina (Sigma-Aldrich). Le colonie<br />
ottenute sono state sottoposte a mini preparazione<br />
plasmi<strong>di</strong>ca utilizzando il kit Nucleo Spin Plasmid<br />
(Macherey-Nagel, Düren, Germany) secondo le<br />
istruzioni del fornitore. 800 ng <strong>di</strong> DNA plasmi<strong>di</strong>co<br />
sono stati sequenziati utilizzando il kit “CEQ 8000<br />
dye terminator cycle sequencing with quick start kit’’<br />
protocol” (Beckman Coulter Fullerton, CA) utilizzando<br />
il sequenziatore automatico CEQ8000 (Beckman<br />
Coulter).<br />
linEarizzazionE dEl calibratorE plasmi<strong>di</strong>co<br />
La <strong>di</strong>gestione <strong>di</strong> 1 µg <strong>di</strong> plasmide viene condotta<br />
in un volume totale <strong>di</strong> 25 µl <strong>di</strong> una soluzione<br />
100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2,<br />
1 mM DTT in presenza <strong>di</strong> 20 U dell’enzima <strong>di</strong> restrizione<br />
BssHII e 20 U dell’enzima <strong>di</strong> restrizione BglII.<br />
La miscela è stata incubata a 37 °C per 2 ore e la<br />
presenza <strong>di</strong> DNA <strong>di</strong>gerito è stata verificata con una<br />
corsa elettroforetica su gel <strong>di</strong> agarosio all’ 1,2 %.<br />
prEamplificazionE<br />
La procedura sperimentale <strong>di</strong> preamplificazione<br />
come in<strong>di</strong>cato da Del Gau<strong>di</strong>o et al., (2009) è stata<br />
eseguita utilizzando 9 pmol <strong>di</strong> ciascun primer (Tabella<br />
I, pannello B) per ottenere una pooled mix.<br />
Le con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> reazione prevedono la preamplificazione<br />
<strong>di</strong> 200 ng <strong>di</strong> DNA in un volume totale <strong>di</strong> 50<br />
µl, contenente 25 µl <strong>di</strong> TaqMan PreAmp Master Mix<br />
(Applied Biosystems) e 6.25 µl <strong>di</strong> pooled mix. La reazione<br />
condotta in un termociclatore Veriti (Applied<br />
Biosystems), prevede una fase <strong>di</strong> denaturazione del<br />
DNA a 95 °C per 10 minuti, seguita da 10 cicli <strong>di</strong> amplificazione<br />
così costituiti: denaturazione del DNA a<br />
95 °C per 15 secon<strong>di</strong>, 4 minuti a 60 °C per annealing<br />
ed estensione. I prodotti della preamplificazione<br />
sono stati <strong>di</strong>luiti 1:5 con il buffer 1X Tris-EDTA ed<br />
usati come stampo per le successive PCR Real time.<br />
Per ciascun target la PCR real time è stata condotta<br />
in triplicato sia su campioni preamplificati che non<br />
preamplificati, utilizzando il termociclatore DNA Engine<br />
Opticon 2 MJ Research (Biorad). Sia per la reazione<br />
con SYBR Green sia con sonde TaqMan, 5 µl<br />
<strong>di</strong> DNA sono stati amplificati in un volume totale <strong>di</strong><br />
reazione <strong>di</strong> 25 µl con primer specifici per il target <strong>di</strong><br />
interesse alle con<strong>di</strong>zioni descritte in Del Gau<strong>di</strong>o et<br />
al. (2009) 11.<br />
Raccolta ed analisi dei dati<br />
Le curve <strong>di</strong> calibrazione sono state costruite <strong>di</strong>luendo<br />
serialmente il DNA estratto dalla farina al<br />
5% <strong>di</strong> mais Bt11, ottenendo 258 129, 65, 16 e 5 ng<br />
<strong>di</strong> DNA corrispondenti a 4734, 2366, 1184, 296, 98<br />
copie della sequenza transgenica e 94676, 47340,<br />
23680, 5920, 1960 copie del genoma <strong>di</strong> mais per<br />
reazione 14.<br />
Il DNA estratto dalla farina al 5% <strong>di</strong> soia RR è<br />
stato <strong>di</strong>luito serialmente ottenendo 100, 50, 12.5, 4.2<br />
ed 1.4 ng <strong>di</strong> DNA corrispondenti a 4425, 2212, 533,<br />
184, 61 copie della sequenza transgenica e 88495,<br />
44248, 11062, 3687, 1229 copie del genoma <strong>di</strong> soia<br />
per reazione.<br />
Le curve <strong>di</strong> calibrazione per la quantificazione<br />
dell’evento EH92-527-1 sono state costruite utilizzando<br />
DNA estratto da farina al 100% <strong>di</strong> OGM <strong>di</strong>luito<br />
in rapporto 1:10 in DNA estratto da farina <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
0% OGM al fine <strong>di</strong> ottenere un campione <strong>di</strong> DNA<br />
al 10%. I campioni a percentuale nota <strong>di</strong> EH92-527-1<br />
pari a 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% sono stati ottenuti miscelando<br />
quantità opportune <strong>di</strong> DNA estratto da farina<br />
al 100% con DNA estratto da farina <strong>di</strong> <strong>patata</strong> 0%.<br />
Per la costruzione della curva <strong>di</strong> riferimento sono<br />
state eseguite <strong>di</strong>luizioni in H2O bi<strong>di</strong>stillata pari a<br />
200, 66.6, 22.2, 7.04, 2.46, 1 ng <strong>di</strong> DNA corrispondenti<br />
a 11111, 3704, 1234, 411, 137, 46 copie della<br />
sequenza transgenica e 111111, 37036, 12346, 4115,<br />
1372, 457 copie del genoma <strong>di</strong> <strong>patata</strong> per reazione.<br />
Le curve <strong>di</strong> calibrazione utilizzando il calibratore<br />
plasmi<strong>di</strong>co sono state eseguite <strong>di</strong>luendo il DNA plasmi<strong>di</strong>co<br />
<strong>di</strong>gerito al fine <strong>di</strong> ottenere 107, 106, 105, 104, 103, 102, 50, 25 copie della sequenza transgenica ed<br />
endogena per reazione. 5 µl <strong>di</strong> ciascuna <strong>di</strong>luzione<br />
sono stati utilizzati in una reazione condotta in 25 µl<br />
<strong>di</strong> soluzione 1X TaqMan Universal PCR Master Mix,<br />
utilizzando primer e sonde alle concentrazioni d’uso<br />
in<strong>di</strong>cate in Tabella III.<br />
I valori <strong>di</strong> Ct in funzione del log10 del numero<br />
<strong>di</strong> molecole sono stati utilizzati per determinare il<br />
contenuto <strong>di</strong> OGM del campione incognito come<br />
rapporto espresso in percentuale tra il numero <strong>di</strong><br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 27
CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE<br />
molecole del transgene ed il numero <strong>di</strong> molecole<br />
del gene endogeno. Per ciascun valore è stata riportata<br />
la me<strong>di</strong>a, la deviazione standard (SD) e la<br />
deviazione standard relativa (RSD o CV). Per la determinazione<br />
del LOD (limite <strong>di</strong> rilevamento) si è<br />
proceduto calcolando il più basso numero <strong>di</strong> copie<br />
corrispondenti ad un RSD≤33%. Per la determinazione<br />
del LOQ (limite <strong>di</strong> quantificazione) si è proceduto<br />
calcolando il più basso numero <strong>di</strong> copie corrispondenti<br />
ad un RSD≤25%.<br />
L’efficienza <strong>di</strong> amplificazione è stata determinata<br />
amplificando <strong>di</strong>luzioni seriali del DNA me<strong>di</strong>ante la<br />
seguente formula: 10 (-1/slope)-1.<br />
L’analisi statistica è stata effettuata con l’ausilio del<br />
software GraphPad (Prism 5). Per analizzare le <strong>di</strong>fferenze<br />
significative tra i campioni preamplificati e<br />
non preamplificati, è stato eseguito il test ANOVA<br />
a due code: un valore <strong>di</strong> probabilità P
PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO<br />
tabElla ii. — Valori <strong>di</strong> pendenza, efficienza <strong>di</strong> amplificazione, coefficiente <strong>di</strong> correlazione, LOD e LOQ delle rette <strong>di</strong> calibrazione<br />
per la sequenza endogena (UGPase) e transgenica (EH92-527-1) relativi ad esperimenti <strong>di</strong> Real-time PCR in cui il plasmide<br />
linearizzato è stato utilizzato come calibratore.<br />
UGPase EH92-527-1<br />
Pendenza Efficienza R2 Pendenza Efficienza R2 -3,36 98,43 0,99 -3,70 86,32 0,99<br />
-3,51 92,70 0,99 -3,69 86,64 0,99<br />
-3,57 90,59 0,99 -3,68 86,95 0,99<br />
-3,46 94,54 0,98 -3,60 89,57 0,98<br />
-3,55 91,30 0,99 -3,65 87,92 0,99<br />
LOD 6 LOD 21<br />
LOQ 33 LOQ 148<br />
tabElla iii. — Valori misurati del contenuto percentuale <strong>di</strong> EH92-527-1 nei campioni a concentrazione nota ottenuti impiegando<br />
il calibratore plasmi<strong>di</strong>co. In tabella sono riportati: il valore atteso corrispondente al contenuto percentuale noto <strong>di</strong> OGM<br />
nei campioni analizzati; il valore misurato e la deviazione standard relativa (RSD); il fattore <strong>di</strong> calibrazione calcolato come<br />
rapporto tra il valore misurato ed il valore atteso; il valore misurato corretto ottenuto dal rapporto tra il valore misurato ed il<br />
fattore <strong>di</strong> calibrazione e la deviazione standard relativa ad esso associato.<br />
Valore atteso<br />
(%)<br />
Valore misurato<br />
(%)<br />
RSD (%)<br />
basato sull’impiego del CTAB è risultato quello più<br />
efficace tra tutti quelli utilizzati per l’estrazione <strong>di</strong><br />
DNA dalle matrici alimentari in esame (dati non mostrati).<br />
L’amplificabilità dei DNA estratti con questo<br />
metodo dalle matrici <strong>di</strong> interesse è stata valutata me<strong>di</strong>ante<br />
l’amplificazione del gene tRNA leu. Risultati<br />
positivi sono stati ottenuti per tutti i campioni in<br />
esame come mostrato in Tabella IV.<br />
Per quanto riguarda l’in<strong>di</strong>viduazione <strong>di</strong> OGM, è<br />
stata dapprima effettuata l’amplificazione delle sequenze<br />
specie-specifiche, quali ADH1 per il mais<br />
e LE1 per la soia i cui risultati sono riassunti nella<br />
Tabella IV: quattro campioni contenevano DNA <strong>di</strong><br />
mais (polenta, snack salato, snack al mais, mix shake),<br />
cinque contenevano DNA <strong>di</strong> soia (farina <strong>di</strong> soia,<br />
mix shake, semi <strong>di</strong> soia tostati, pane <strong>di</strong> soia, latte <strong>di</strong><br />
soia) e solo uno conteneva il DNA <strong>di</strong> entrambe le<br />
specie vegetali (mix shake). La sequenza del promotore<br />
35S è stata rilevata in cinque campioni (farina<br />
<strong>di</strong> soia, polenta, mix shake, pane <strong>di</strong> soia, latte <strong>di</strong><br />
soia) mentre il terminatore NOS è stato rilevato in<br />
tre campioni (mix shake, pane <strong>di</strong> soia, latte <strong>di</strong> soia).<br />
Fattore <strong>di</strong><br />
calibrazione<br />
Valore misurato<br />
corretto (%)<br />
0,1 3,800 x 10 -6 20,789 3,8 x 10 -5 5,430 x 10 -4 29,466<br />
0,5 0,004 4,040 0,008 0,500 3,968<br />
1 0,017 55,704 0,017 2,125 55,718<br />
2 0,009 13,793 0,005 1,225 11,673<br />
5 0,034 42,353 0,007 4,881 42,041<br />
Me<strong>di</strong>a 27,336 0,007 28,573<br />
I campioni <strong>di</strong> snack salato, snack al mais e semi <strong>di</strong><br />
soia tostati, pur contenendo mais, soia o entrambe<br />
le specie, sono risultati negativi all’amplificazione<br />
del promotore 35S e del terminatore NOS.<br />
Per quanto riguarda le matrici alimentari contenenti<br />
soia gli estratti risultati positivi alla fase <strong>di</strong> screening<br />
(mix shake, pane <strong>di</strong> soia, latte <strong>di</strong> soia) sono<br />
stati sottoposti ad una PCR costrutto-specifica che<br />
prevedeva l’amplificazione della regione <strong>di</strong> giunzione<br />
tra il promotore 35S e la sequenza del Chloroplast<br />
Transit Peptide (CTP) che precede la sequenza<br />
del gene EPSPS presente nella soia Roundup Ready.<br />
I risultati (Tabella IV) in<strong>di</strong>cano che le matrici in<br />
esame contengono effettivamente soia transgenica<br />
derivante dall’evento <strong>di</strong> trasformazione GTS 40-3-2<br />
(Roundup Ready), regolarmente autorizzato nell’ambito<br />
dell’UE.<br />
Per la specie Zea mays l’identificazione è stata<br />
limitata all’evento Bt11. Gli estratti risultati positivi<br />
all’analisi <strong>di</strong> screening (polenta e shake mix) sono<br />
stati saggiati impiegando una coppia <strong>di</strong> primer ed<br />
una sonda specifici per la regione <strong>di</strong> giunzione tra<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 29<br />
RSD<br />
(%)
CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE<br />
tabElla iv. — Sono riportati me<strong>di</strong>a, deviazione standard e coefficiente <strong>di</strong> variazione dei valori <strong>di</strong> Ct ottenuti dall’amplificazione<br />
<strong>di</strong> sette geni target, I. — campioni preamplificati rispetto ai non preamplificati mostrano una riduzione altamente significativa<br />
(p< 0,0001) del valore <strong>di</strong> Ct in un intervallo tra 3,03 e 7,45.<br />
leu tRNA adh1 le1<br />
Matrice<br />
Non<br />
non<br />
Non<br />
Preamplificato preamplificato Preamplificato preamplificato Preamplificato preamplificato<br />
Farina <strong>di</strong> soia 16,52±0,14 0,85% 19,54±1,05<br />
- - 22,30±0,23 27,48±0,30<br />
5,37%<br />
1,03%<br />
1,09%<br />
Polenta 12,22±0,01 16,06±0,47 19,57±0,32 25,69±0,33<br />
- -<br />
0,13%<br />
2,92%<br />
1,63%<br />
1,28%<br />
Snack salato 12,68±0,02 17,49±0,09 29,08±0,16 34,65±0,67<br />
- -<br />
0,16%<br />
0,52%<br />
0,57%<br />
1,93%<br />
Snack al mais 11,49±0,22 14,44±0,30 20,09±0,13 25,23±0,74<br />
- -<br />
1,91%<br />
2,10%<br />
0,64%<br />
2,91%<br />
Meren<strong>di</strong>na alla 14,83±0,50 19,46±0,62<br />
- - - -<br />
frutta<br />
3,37%<br />
3,19%<br />
Mix shake 18,17±0,14 22,70±0,84 29,04±0,38 34,37±0,50 20,33±0,34 25,86±0,37<br />
0,76%<br />
3,7%<br />
1,30%<br />
1,47%<br />
1,67%<br />
1,43%<br />
semi <strong>di</strong> soia tostati 19,31±0,38 22,79±0,17<br />
- - 19,48±0,14 25,32±0,38<br />
1,97%<br />
0,74%<br />
0,72%<br />
1,50%<br />
Pane <strong>di</strong> soia 13,25±0,35 17,42±0,41<br />
- - 22,75±0,40 28,37±0,23<br />
2,66%<br />
2,36%<br />
1,75%<br />
0,81%<br />
Latte <strong>di</strong> soia 14,62±0,35 19,48±0,82<br />
- - 18,63±0,30 24,67±0,22<br />
2,41%<br />
4,2%<br />
1,61%<br />
0,89%<br />
l’estremità 3’ del costrutto ed il genoma della pianta<br />
ospite ottenendo risultato positivo solo per il DNA<br />
estratto da polenta.<br />
Tutte le reazioni <strong>di</strong> amplificazione in PCR Real<br />
time sono state condotte sia sui campioni preamplificati<br />
che non preamplificati ed i risultati sono stati<br />
confrontati per verificare l’applicabilità della tecnica<br />
ed in<strong>di</strong>viduarne gli effettivi vantaggi. I parametri che<br />
sono stati considerati sono: la sensibilità, la linearità,<br />
la precisione, l’efficienza e l’accuratezza.<br />
La Tabella IV riporta i valori me<strong>di</strong>, la deviazione<br />
standard (SD) e la deviazione standard relativa (CV)<br />
dei valori <strong>di</strong> Ct. I campioni preamplificati, rispetto a<br />
quelli non preamplificati, hanno mostrato un significativo<br />
miglioramento dei valori <strong>di</strong> Ct (P
PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO<br />
p35S tNOS mais Bt11 RR soia<br />
Non<br />
non<br />
non<br />
non<br />
Preamplificato preamplificato Preamplificato preamplificato preamplificato preamplificato preamplificato preamplificato<br />
31,00±0,00 36,25±1,06<br />
- - NT NT - -<br />
-<br />
2,92%<br />
29,83±0,02 34,85±0,32<br />
- - 32,50±0,30 39,45±0,60 NT NT<br />
0,07%<br />
0,92%<br />
0,92%<br />
1,5%<br />
- - - - NT NT NT NT<br />
- - - - NT NT NT NT<br />
- - - - NT NT NT NT<br />
33,84±0,40 38,38±0,44 35,55±0,07 38,76±1,07<br />
- - 34,88±0,08 40,15±0,30<br />
1,20%<br />
1,15%<br />
0,20%<br />
2,76%<br />
0,23% 0,75%<br />
- - - - NT NT NT NT<br />
34,38±1,12<br />
3,26%<br />
23,05±0,22<br />
0,95%<br />
37,29±0,52<br />
1,39%<br />
28,10±0,46<br />
1,64%<br />
Discussione<br />
31,67±0,15<br />
0,47%<br />
30,63±1,30<br />
4,24%<br />
38,22±0,59<br />
1,54%<br />
38,08±1,02<br />
2,69%<br />
tabElla v. — Efficienze <strong>di</strong> amplificazione dei <strong>di</strong>versi campioni e target.<br />
L’impiego <strong>di</strong> DNA ricombinante come standard<br />
rappresenta un’interessante innovazione nell’ambito<br />
della certificazione OGM. La sua progettazione, realizzazione<br />
ed applicazione presenta tre fasi critiche:<br />
a) clonaggio della sequenza GM desiderata; b) accuratezza<br />
delle <strong>di</strong>luizioni del plasmide; c) verifica che<br />
il calibratore plasmi<strong>di</strong>co si comporti in maniera equivalente<br />
a quello costituito da DNA genomico (commutabilità)<br />
5. Per quanto riguarda il primo parametro,<br />
i risultati ottenuti dal sequenziamento dell’inserto<br />
NT NT 32,53±0,14<br />
0,43%<br />
NT NT 32,71±0,24<br />
0,75%<br />
38,36±0,61<br />
1,59%<br />
38,59±0,25<br />
0,65%<br />
Campione<br />
Preamp,<br />
Leu tRNA<br />
Non-preamp, Preamp,<br />
ADH1<br />
Non-preamp, Preamp,<br />
LE1<br />
Non-preamp,<br />
Farina <strong>di</strong> soia 0,49 0,66 - - 0,92 0,66<br />
Polenta 0,79 1,00 0,81 0,69 - -<br />
Snack salato 0,91 1,00 0,87 0,91 - -<br />
Snack al mais 0,87 1,00 0,90 0,90 - -<br />
Meren<strong>di</strong>na<br />
alla frutta<br />
0,76 0,99 - - - -<br />
Mix shake 0,44 1,10 1,03 1,15 0,90 0,87<br />
Semi <strong>di</strong> soia tostati 0,55 0,80 - - 0,77 0,76<br />
Pane <strong>di</strong> soia 0,70 1,09 - - 0,91 0,84<br />
Latte <strong>di</strong> soia 0,83 1,11 - - 0,93 0,94<br />
integrato nel plasmide pCR2.1 hanno confermato il<br />
corretto clonaggio della sequenza GM. Per quanto<br />
riguarda la seconda fase un calibratore plasmi<strong>di</strong>co<br />
che contenga entrambi i target (evento-specifico e<br />
specie-specifico) necessari per la quantificazione garantisce<br />
un errore minore nelle <strong>di</strong>luizioni.<br />
Infine, per verificare che il calibratore plasmi<strong>di</strong>co<br />
si comporti in maniera equivalente a quello costituito<br />
da DNA genomico è necessario valutare una serie<br />
<strong>di</strong> requisiti che prendono in esame l’applicabilità e<br />
la commutabilità.<br />
Per la verifica della applicabilità del protocollo <strong>di</strong><br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 31
CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE<br />
tabElla vi. — Risultati dell’analisi quantitativa condotta su DNA estratto da prodotti lavorati, materiali <strong>di</strong> riferimento certificati<br />
(IRMM) e provenienti da proficiency test (FAPAS). I risultati sono espressi come percentuale <strong>di</strong> OGM±deviazione standard e<br />
coefficiente <strong>di</strong> variazione (%). Il valore del limite <strong>di</strong> quantificazione (LOQ) per il mais Bt11 e la soia RR è, rispettivamente, pari<br />
a 0.07% e 0.05%.<br />
OGM Matrice<br />
DNA<br />
preamplificato<br />
mais Bt11 Polenta 0,12±0,02<br />
19,32<br />
0,1% mais Bt11 (IRMM) 0,07±0,01<br />
12,13<br />
1% mais Bt11 (IRMM) 0,66±0,20<br />
30,29<br />
FAPAS GeMSU09A (farina <strong>di</strong> mais + Bt11) 1,42±0,36<br />
25,26<br />
quantificazione <strong>di</strong> EH92-527-1 nei prodotti alimentari<br />
sono stati valutati i requisiti minimi, Minimum<br />
Performance Requirements, che un buon metodo<br />
analitico per la rivelazione <strong>di</strong> OGM basato sulla PCR<br />
Real time deve sod<strong>di</strong>sfare 15. Essi comprendono <strong>di</strong>versi<br />
aspetti tra i quali:<br />
— la specificità (il metodo deve essere eventospecifico);<br />
— l’efficienza <strong>di</strong> amplificazione (il coefficiente<br />
angolare della retta <strong>di</strong> taratura o slope, proporzionale<br />
all’efficienza <strong>di</strong> amplificazione, deve essere<br />
compreso nel seguente intervallo <strong>di</strong> valori: -3.1
PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO<br />
La verifica della commutabilità del metodo che<br />
utilizza il calibratore plasmi<strong>di</strong>co è stata realizzata<br />
effettuando esperimenti <strong>di</strong> quantificazione <strong>di</strong> campioni<br />
a percentuale nota <strong>di</strong> EH92-527-1. I dati riportati<br />
in Tabella III in<strong>di</strong>cano che nell’ambito del range<br />
considerato si evidenziano significative deviazioni<br />
del contenuto percentuale <strong>di</strong> OGM rispetto al valore<br />
atteso, accompagnati da una RSD superiore al<br />
25%. È stato calcolato un fattore <strong>di</strong> calibrazione 12<br />
che in<strong>di</strong>ca la variazione del valore misurato rispetto<br />
a quello noto. Anche in questo caso la RSD mostra<br />
valori superiori al 25%.<br />
I risultati <strong>di</strong> commutabilità contrastano quin<strong>di</strong> con<br />
i dati <strong>di</strong> efficienza, R 2, LOD e range <strong>di</strong>namico. Le <strong>di</strong>screpanze<br />
osservate possono essere dovute ad errori<br />
<strong>di</strong> accuratezza nella preparazione dei campioni a<br />
percentuale nota <strong>di</strong> EH52-927-1. La preparazione <strong>di</strong><br />
campioni a percentuali note è inevitabile in quanto<br />
la farina a concentrazione nota <strong>di</strong> riferimento da cui<br />
essi sono ottenuti è <strong>di</strong>sponibile in commercio solo<br />
alla percentuale del 100%.<br />
La strategia attuata per il rilevamento <strong>di</strong> OGM<br />
è basata su uno screening iniziale per le due più<br />
comuni sequenze <strong>di</strong> regolazione (promotore 35S e<br />
terminatore Nos) associato all’amplificazione <strong>di</strong> sequenze<br />
specie-specifiche per mais e soia. Infine, sulla<br />
base dei risultati <strong>di</strong> screening, la strategia prevede<br />
amplificazioni costrutto e/o evento specifiche per<br />
identificare e quantificare la soia Roundup Ready<br />
(RRS) ed il mais Bt11. Come già accennato abbiamo<br />
applicato a tutte le fasi della strategia <strong>di</strong> rilevamento<br />
una procedura <strong>di</strong> preamplificazione basata sull’utilizzo<br />
del reagente TaqMan ® PreAmp Master Mix<br />
(Applied Biosystems) e <strong>di</strong> una miscela <strong>di</strong> coppie <strong>di</strong><br />
primer e sonde specifiche per i marcatori da analizzare.<br />
In questo contesto la tecnologia <strong>di</strong> preamplificazione<br />
ha aumentato la sensibilità della reazione <strong>di</strong><br />
amplificazione in PCR Real time.<br />
L’efficienza della PCR deve essere valutata per eseguire<br />
una determinazione quantitativa atten<strong>di</strong>bile del<br />
contenuto <strong>di</strong> OGM 16. La riduzione dell’efficienza <strong>di</strong><br />
amplificazione <strong>di</strong> tRNA leu nei campioni preamplificati<br />
rispetto ai non preamplificati potrebbe essere legata<br />
ad una possibile interazione dei primer all’interno<br />
della pooled mix utilizzata nella reazione <strong>di</strong> preamplificazione.<br />
Una spiegazione alternativa è stata fornita<br />
da Coudry e collaboratori (dati non pubblicati) che<br />
hanno evidenziato una riduzione dell’amplificazione<br />
dei geni altamente espressi in campioni <strong>di</strong> cDNA preamplificati.<br />
e questo potrebbe essere vero anche per<br />
geni ad alto numero <strong>di</strong> copie come tRNA leu.<br />
Conclusioni<br />
I vantaggi offerti dall’uso <strong>di</strong> calibratori plasmi<strong>di</strong>ci<br />
sono molteplici e testimoniati da <strong>di</strong>versi lavori<br />
presenti in letteratura. In particolare, accanto<br />
alla quantità illimitata <strong>di</strong> tali molecole che si può<br />
ottenere, esse offrono la possibilità <strong>di</strong> effettuare<br />
un’analisi quantitativa anche nei casi in cui non<br />
siano <strong>di</strong>sponibili i calibratori certificati dall’IRMM.<br />
La loro realizzazione e soprattutto la loro applicazione<br />
alla quantificazione <strong>di</strong> OGM in DNA estratto<br />
da matrici alimentare presenta, però, non poche<br />
<strong>di</strong>fficoltà.<br />
I dati ottenuti in questo lavoro <strong>di</strong>mostrano che i<br />
risultati <strong>di</strong> quantificazione ottenuti con un calibratore<br />
plasmi<strong>di</strong>co non risultano sempre commutabili<br />
con quelli ottenuti con l’uso <strong>di</strong> un calibratore a<br />
DNA genomico, anche se nell’ambito dei Minimum<br />
Performance Requirements <strong>di</strong>versi parametri, quali<br />
efficienza, R 2 e LOD vengono sod<strong>di</strong>sfatti.<br />
La tecnologia <strong>di</strong> preamplificazione ha aumentato<br />
la sensibilità della reazione <strong>di</strong> amplificazione in PCR<br />
Real time, risultando utile in particolare per i target<br />
presenti in basso numero <strong>di</strong> copie aumentando inoltre<br />
il numero <strong>di</strong> target analizzabili in DNA estratti da<br />
alimenti lavorati.<br />
I risultati ottenuti con la reazione <strong>di</strong> preamplificazione<br />
in<strong>di</strong>cano che essa non influisce sull’affidabilità<br />
del dato quantitativo, suggerendo che tale strategia<br />
possa trovare interessanti applicazioni in tutti quei<br />
campi che richiedono analisi quantitative me<strong>di</strong>ante<br />
PCR Real time.<br />
Riassunto<br />
La rilevazione e la quantificazione degli organismi geneticamente<br />
mo<strong>di</strong>ficati (OGM) negli alimenti viene effettuata me<strong>di</strong>ante<br />
la Reazione a Catena della Polimerasi in Tempo reale<br />
(PCR Real time). L’impiego <strong>di</strong> tale tecnica è con<strong>di</strong>zionata da<br />
due fattori critici: la scelta <strong>di</strong> calibratori adeguati e un DNA<br />
<strong>di</strong> qualità e quantità adeguate. In questo lavoro sono descritti<br />
esperimenti relativi all’applicabilità <strong>di</strong> un calibratore plasmi<strong>di</strong>co<br />
come standard per la determinazione quantitativa della<br />
<strong>patata</strong> EH92-527-1. Inoltre, vengono presentati risultati ottenuti<br />
applicando la tecnica <strong>di</strong> preamplificazione al DNA estratto<br />
da alimenti lavorati per migliorare la sensibilità della PCR real<br />
time ed aumentare il numero <strong>di</strong> target analizzabili.<br />
Parole chiave: Reazione a catena della polimerasi in tempo<br />
reale - DNA, recombinant - Organismi geneticamente mo<strong>di</strong>ficati.<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 33
CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE<br />
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method and sample matrix on quantification of genetically mo<strong>di</strong>fied<br />
organisms. BMC Biotechnol 2006;6:37.<br />
Ringraziamenti. — Questo lavoro è de<strong>di</strong>cato alla memoria del Prof.<br />
Antonino Cascino.<br />
Finanziamenti. — Questo progetto è stato finanziato dal Ministero<br />
delle Politiche Agricole e Forestali (MIPAF) Progetto Speciale MI-<br />
PAF: “Tipicizzazione e <strong>caratterizzazione</strong> <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>precoci</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
con l’impiego <strong>di</strong> tecniche molecolari e spettroscopiche” (2008-2011)<br />
a M.C.<br />
34 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
La <strong>tipizzazione</strong> in campo alimentare è uno degli<br />
aspetti <strong>di</strong> maggior rilievo nell’ambito della prevenzione<br />
delle fro<strong>di</strong>, della sicurezza e della valorizzazione<br />
degli alimenti. Tra i prodotti dell’agricoltura<br />
italiana, la <strong>patata</strong> riveste un ruolo molto importante,<br />
soprattutto per quel che riguarda la produzione<br />
extra-stagionale o “precoce” (ciclo invernale-primaverile),<br />
molto apprezzata dai consumatori nazionali<br />
e nord-europei. Tale produzione, tuttavia, è talvolta<br />
contaminata da materiale proveniente dal nord<br />
Africa o da Cipro, da zone quin<strong>di</strong> che non sono<br />
quelle tipiche della produzione <strong>di</strong> <strong>patata</strong> extrastagionale<br />
(Campania, Sicilia, Puglia) e che non sono<br />
sottoposte ad appropriati controlli <strong>di</strong> qualità e sicurezza.<br />
Pertanto, il presente lavoro si propone <strong>di</strong><br />
in<strong>di</strong>viduare marcatori proteici per alcune <strong>varietà</strong> <strong>di</strong><br />
<strong>patata</strong> precoce (Solanum tuberosum L.) coltivate<br />
nel Sud Italia me<strong>di</strong>ante l’impiego <strong>di</strong> metodologie<br />
proteomiche. La proteomica, infatti, può aumentare<br />
la possibilità <strong>di</strong> descrivere le proprietà nutrizionali,<br />
biologiche, conformazionali e <strong>di</strong> interazioni funzionali<br />
delle proteine alimentari ampliando la possibilità<br />
<strong>di</strong> “definizione <strong>di</strong> qualità” <strong>di</strong> prodotti destinati<br />
all’alimentazione.<br />
I proteomi ottenuti per ciascuna <strong>varietà</strong> hanno messo<br />
in evidenza una grande abbondanza <strong>di</strong> patatine,<br />
gruppo <strong>di</strong> glicoproteine aventi funzione <strong>di</strong> conservazione<br />
e <strong>di</strong>fesa. Sono state rilevate <strong>di</strong>fferenze significative<br />
tra <strong>di</strong>verse cv e nell’ambito della stessa<br />
cv proveniente da <strong>di</strong>verse regioni non in termini <strong>di</strong><br />
numero, ma <strong>di</strong> intensità <strong>di</strong> spot, quin<strong>di</strong> <strong>di</strong> espres-<br />
Autore <strong>di</strong> contatto: M. A. Rao, Dipartimento <strong>di</strong> Scienze del Suolo,<br />
della Pianta dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Università degli<br />
Stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> Napoli Federico II, Portici, Napoli, Italia.<br />
E-mail mariarao@unina.it<br />
MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):35-42<br />
La proteomica quale strumento <strong>di</strong> <strong>tipizzazione</strong><br />
<strong>di</strong> cultivar <strong>precoci</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
R. SCELZA, F. RUSSO, L. GIANFREDA, M. A. RAO<br />
Dipartimento <strong>di</strong> Scienze del Suolo, della Pianta,<br />
dell’Ambiente e delle Produzioni Animali<br />
Università degli Stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> Napoli Federico II, Portici<br />
Napoli, Italia<br />
sione <strong>di</strong> proteine. Analisi <strong>di</strong> spettrometria <strong>di</strong> massa<br />
saranno necessarie per identificare le proteine in<strong>di</strong>viduate.<br />
Parole-chiave:
SCELZA LA PROTEOMICA<br />
La composizione nutrizionale degli alimenti può<br />
essere influenzata dalla <strong>di</strong>versità dei territori, per<br />
cui il prodotto tra<strong>di</strong>zionale tipizzato assume un<br />
ruolo fondamentale per la sostenibilità salutistica e<br />
sanitaria, sia per l’uomo che per l’animale, nonché<br />
per il territorio stesso, con riflessi positivi anche<br />
sulla sostenibilità economica. Inoltre, la <strong>tipizzazione</strong><br />
in campo alimentare è uno degli aspetti <strong>di</strong><br />
maggior rilievo nell’ambito della prevenzione delle<br />
fro<strong>di</strong>, della sicurezza e della valorizzazione degli<br />
alimenti 2.<br />
La proteomica rappresenta dunque un prezioso<br />
strumento per la <strong>caratterizzazione</strong> alimentare <strong>di</strong><br />
uno specifico territorio. È, infatti, possibile ottenere<br />
delle vere e proprie impronte (fingerprinting) <strong>di</strong><br />
mappe bi<strong>di</strong>mensionali polipepti<strong>di</strong>che dei prodotti<br />
tra<strong>di</strong>zionali tipizzati, che vengono poi registrate<br />
come immagini in banche dati e che possono essere<br />
utilizzate, nelle analisi <strong>di</strong> tracciabilità, per verificare<br />
la presenza <strong>di</strong> alcuni parametri <strong>di</strong> tipicità e <strong>di</strong><br />
salubrità nel prodotto in esame 3.<br />
Tra i prodotti dell’agricoltura italiana la <strong>patata</strong> riveste<br />
un ruolo molto importante, soprattutto per quel<br />
che riguarda la produzione extrastagionale 4-6. Le<br />
con<strong>di</strong>zioni climatiche <strong>di</strong> alcune aree costiere dell’Italia<br />
meri<strong>di</strong>onale (Campania, Sicilia e Puglia) e la nota<br />
capacità <strong>di</strong> adattamento della <strong>patata</strong> a con<strong>di</strong>zioni non<br />
ottimali <strong>di</strong> temperatura, ra<strong>di</strong>azione solare e fotoperiodo,<br />
permettono <strong>di</strong> realizzare due cicli <strong>di</strong> coltivazione<br />
extrastagionali: uno autunno-vernino-primaverile<br />
e l’altro estivo-autunno-vernino, temporalmente <strong>di</strong>fferenti<br />
da quello or<strong>di</strong>nario primaverile-estivo. Con il<br />
primo ciclo si ottiene la classica e affermata produzione<br />
precoce (denominata anche primaticcia o novella),<br />
realizzata tra marzo e giugno. Con il ciclo estivoautunnale<br />
si realizza, invece, la produzione invernale<br />
o <strong>di</strong> secondo raccolto o bisestile, che in questi anni<br />
ha visto aumentare la propria importanza relativa, in<br />
virtù soprattutto della favorevole e interessante <strong>di</strong>slocazione<br />
temporale delle raccolte, che consente la<br />
commercializzazione della <strong>patata</strong> durante tutto l’anno.<br />
Le patate extrastagionali sono molto apprezzate<br />
dai consumatori nazionali e nord-europei, anche<br />
se, talvolta, tale produzione è contaminata da<br />
materiale proveniente dal nord Africa o da Cipro,<br />
da zone quin<strong>di</strong> che non sono quelle tipiche della<br />
produzione <strong>di</strong> <strong>patata</strong> extrastagionale e che non<br />
sono sottoposte ad appropriati controlli <strong>di</strong> qualità<br />
e sicurezza.<br />
Pertanto, lo scopo del presente lavoro è la carat-<br />
terizzazione proteomica <strong>di</strong> alcune <strong>varietà</strong> <strong>di</strong> patate<br />
extrastagionali (Spunta, Arinda, Antea, Agria, Agata,<br />
Sieglinde) provenienti dal sud Italia, in particolare<br />
da Campania, Puglia e Sicilia, al fine <strong>di</strong> identificare<br />
eventuali marcatori proteici legati al luogo <strong>di</strong> provenienza<br />
del prodotto.<br />
Materiali e meto<strong>di</strong><br />
Preparazione del campione<br />
Dopo la raccolta, un campione <strong>di</strong> 500 g <strong>di</strong> tuberi<br />
è stato prelevato in maniera casuale, eliminando<br />
quelli con evidenti attacchi fitopatologici. I tuberi<br />
selezionati sono stati lavati prima in acqua corrente<br />
per eliminare tracce <strong>di</strong> suolo, poi in acqua deionizzata,<br />
e quin<strong>di</strong> asciugati con carta assorbente. Ciascun<br />
tubero è stato tagliato ortogonalmente rispetto<br />
alla sua lunghezza maggiore in otto sezioni, <strong>di</strong> cui<br />
sono state scartate le due sezioni apicali 7. Le sei<br />
sezioni più interne sono state poi rapidamente tagliate<br />
in cubetti e questi ultimi mescolati con quelli<br />
provenienti da altri tuberi dello stesso campione,<br />
sottoposti allo stesso trattamento (Figura 1).<br />
Sono stati prelevati 200 g <strong>di</strong> cubetti e subito<br />
congelati per immersione in azoto liquido fino al<br />
raggiungimento dell’equilibrio termico. I campioni<br />
sono stati poi trasferiti e conservati temporaneamente<br />
a -80 °C, liofilizzati, e infine ridotti in polvere<br />
con un blender in acciaio e conservati a -20 °C.<br />
Estrazione della frazione proteica<br />
I tuberi liofilizzati sono stati sottoposti a prove<br />
<strong>di</strong> estrazione della frazione proteica al fine <strong>di</strong> in<strong>di</strong>viduare<br />
una procedura che risultasse efficace nella<br />
visualizzazione del loro intero corredo proteico.<br />
Per l’analisi 2-D la preparazione del campione rappresenta<br />
un fattore critico, soprattutto nel caso <strong>di</strong><br />
tessuti vegetali dove si riscontra un basso rapporto<br />
quantità <strong>di</strong> proteine/volume <strong>di</strong> estrazione e un’alta<br />
concentrazione <strong>di</strong> sostanze interferenti quali pigmenti,<br />
enzimi proteolitici, carboidrati, ecc.<br />
Sono stati selezionati due meto<strong>di</strong> tra quelli maggiormente<br />
riportati in letteratura in cui era previsto<br />
l’impiego <strong>di</strong> fenolo o <strong>di</strong> so<strong>di</strong>o dodecilsolfato<br />
(SDS) 3.<br />
Per quanto riguarda il metodo <strong>di</strong> estrazione con<br />
fenolo, il tubero liofilizzato (0,25 g) è stato omogeneizzato<br />
con 4 ml <strong>di</strong> tampone <strong>di</strong> estrazione (sac-<br />
36 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 20125
LA PROTEOMICA SCELZA<br />
Figura 1. — Preparazione dei tuberi.<br />
carosio 0,7 M, EDTA 50 mM, KCl 0,1 M, tiourea<br />
10 mM, TRIS 0,5 M, PMSF 2 mM, DTT 50 mM) e<br />
incubato per 10 minuti in ghiaccio. L’omogenato è<br />
stato poi centrifugato (15 min a 13000 g e 4 °C) e il<br />
surnatante è stato sottoposto a una nuova estrazione<br />
con 5 ml <strong>di</strong> una soluzione <strong>di</strong> fenolo tamponata a<br />
pH 8 me<strong>di</strong>ante agitazione a 1800 rpm per 10 minuti<br />
a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione<br />
(10 minuti a 6000 g), un’ulteriore estrazione è stata<br />
eseguita sulla fase fenolica con 5 ml del tampone<br />
<strong>di</strong> estrazione me<strong>di</strong>ante agitazione a 1800 rpm per<br />
10 minuti e centrifugazione nuovamente come già<br />
descritto. Il tampone è stato rimosso e la precipitazione<br />
delle proteine contenute nella fase fenolica è<br />
stata ottenuta me<strong>di</strong>ante aggiunta <strong>di</strong> 20 ml <strong>di</strong> acetato<br />
<strong>di</strong> ammonio in metanolo 0,1 M, con tempo <strong>di</strong> reazione<br />
<strong>di</strong> 16 ore a -20 °C e centrifugazione a 20000<br />
g per 20 minuti a 4 °C.<br />
Il precipitato è stato lavato due volte con 4 ml <strong>di</strong><br />
una soluzione fredda <strong>di</strong> ammonio acetato in metanolo<br />
0,1 M e una volta con una soluzione fredda<br />
<strong>di</strong> <strong>di</strong>tiotreitolo (DTT) 10 mM in acetone. Il pellet<br />
così lavato è stato essiccato all’aria per 30 minuti<br />
a temperatura ambiente e poi solubilizzato in 1 ml<br />
<strong>di</strong> tampone <strong>di</strong> reidratazione (urea 5 M, tiourea 2M,<br />
CHAPS 2% p/v, C 7BzO 2% p/v, DTT 20 mM, TCEP-<br />
HCl 5 mM) per le analisi successive.<br />
La procedura prevista nel metodo <strong>di</strong> estrazione<br />
con SDS è pressoché simile: il tubero liofilizzato<br />
(0,25 g) è stato miscelato ed incubato a 65 °C per<br />
10 minuti con 2 ml <strong>di</strong> tampone <strong>di</strong> lisi (SDS 4% p/v,<br />
saccarosio 5% p/v, polivinilpirrolidone (PVP) 10%<br />
p/v, DTT 0,3% p/v, fosfato <strong>di</strong> so<strong>di</strong>o 20 mM a pH<br />
7). L’omogenato è stato raffreddato per 15 minuti<br />
in ghiaccio prima della centrifugazione (15 minuti<br />
a 15000 g e 4 °C). Il surnatante è stato centrifugato<br />
una seconda volta prima della precipitazione ottenuta<br />
me<strong>di</strong>ante l’aggiunta <strong>di</strong> 8 ml <strong>di</strong> una soluzione<br />
fredda <strong>di</strong> 10 mM DTT in acetone, con tempo <strong>di</strong> reazione<br />
<strong>di</strong> 16 ore, e della successiva centrifugazione a<br />
20000 g per 20 minuti a 4 °C. Il precipitato proteico<br />
è stato lavato 2 volte con DTT 10 mM in acetone<br />
e poi essiccato all’aria per 30 minuti a temperatura<br />
ambiente prima <strong>di</strong> essere solubilizzato in 1 ml <strong>di</strong><br />
tampone <strong>di</strong> reidratazione per le analisi successive.<br />
Determinazione della concentrazione proteica<br />
La concentrazione proteica è stata valutata me<strong>di</strong>ante<br />
il 2-D Quant Kit (GE Healthcare) utilizzando<br />
una soluzione <strong>di</strong> sieroalbumina 2 mg ml-1 per la<br />
costruzione della retta <strong>di</strong> taratura. Le analisi sono<br />
state eseguite in triplicato.<br />
Analisi elettroforetica<br />
Gli estratti proteici sono stati sottoposti dapprima<br />
ad elettroforesi mono<strong>di</strong>mensionale SDS-PAGE per<br />
verificare l’avvenuta estrazione. Le proteine presenti<br />
nel campione, precedentemente solubilizzato in<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 37
SCELZA LA PROTEOMICA<br />
tampone riducente SDS, sono state separate su gel<br />
al 10% <strong>di</strong> poliacrilammide secondo il metodo Laemmli<br />
8.<br />
Dopo<strong>di</strong>ché è stata eseguita l’analisi 2-D. L’isoelettrofocalizzazione<br />
(IEF) è stata effettuata utilizzando<br />
IPG strip <strong>di</strong> 17 cm, pH 4-7 (Bio-Rad) sulle<br />
quali sono stati caricati circa 500 µg <strong>di</strong> proteine.<br />
Dopo la reidratazione attiva delle strip a 50 V per<br />
12 h, la focalizzazione è stata eseguita me<strong>di</strong>ante<br />
una PROTEAN ® IEF Cell, (Bio-Rad) utilizzando le<br />
seguenti con<strong>di</strong>zioni: da 0 a 500 V in 1 h, da 500 a<br />
1000 V in 8 h, da 1000 a 5000 V in 3 h, da 5000 a<br />
10000 V fino ad un massimo <strong>di</strong> 60000 V/h. Prima<br />
kD<br />
250<br />
150<br />
100<br />
75<br />
50<br />
37<br />
St<br />
CN<br />
P1<br />
P2<br />
P3<br />
25<br />
20<br />
Volume caricato: 20 μL<br />
Campione: Agria (AG-C A 1)<br />
S1<br />
S2<br />
Acrilammide 10%<br />
St = standard molecolari<br />
CN = controllo negativo<br />
P1 = Estr. fenolica rep. 1<br />
P2 = Estr. fenolica rep. 2<br />
P3 = Estr. fenolica rep. 3<br />
S1 = Estr. con SDS rep. 1<br />
S2 = Estr. con SDS rep. 2<br />
S3 = Estr. con SDS rep. 3<br />
Figura 2. — Gel SDS-PAGE degli estratti proteici della cv Agria,<br />
ottenuti con i <strong>di</strong>versi meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> estrazione.<br />
Protein (mg·g -1 )<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
Agria<br />
Agria<br />
Spunta<br />
Spunta<br />
S3<br />
Antea<br />
Antea<br />
Figura 4. — Contenuto proteico delle cv <strong>di</strong> <strong>patata</strong> raccolte nelle tre Regioni italiane.<br />
Antea<br />
Arinda<br />
Arinda<br />
Arinda<br />
della seconda <strong>di</strong>mensione le strip sono stare equilibrate<br />
per 15 minuti in 3 ml <strong>di</strong> tampone <strong>di</strong> equilibrazione<br />
(urea 6 M, SDS 2%, Tris-HCl 0,375 M pH 8,8,<br />
glicerolo 20%) contenente DTT 130 mM e successivamente<br />
per 15 minuti in 3 ml <strong>di</strong> tampone <strong>di</strong> equilibrazione<br />
contenente 135 mM iodoacetammide. Per<br />
la seconda <strong>di</strong>mensione sono stati preparati gel al<br />
12% <strong>di</strong> poliacrilammide. La seconda <strong>di</strong>mensione è<br />
stata realizzata a 12 mA/gel per 30 minuti e 24 mA/<br />
gel per 6 h me<strong>di</strong>ante una PROTEAN ® II XL Multi-<br />
Cells, (Bio-Rad).<br />
La scansione dei gel, colorati con Coomassie<br />
colloidale G-250 9, è stata eseguita me<strong>di</strong>ante den-<br />
Figura 3. — Gel SDS-PAGE preparati con <strong>di</strong>versi volumi degli<br />
estratti proteici della cv Agria, ottenuti con i <strong>di</strong>versi meto<strong>di</strong> <strong>di</strong><br />
estrazione.<br />
38 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 20125<br />
kD<br />
250<br />
150<br />
100<br />
75<br />
50<br />
37<br />
25<br />
20<br />
St<br />
CN<br />
P1<br />
S1 P1 S1 P1 S1 P1 S1<br />
Volume caricato: 2.5 μL 5 μL 10 μL 15 μL<br />
Campione: Agria (AG-C A 1)<br />
Sieglinde<br />
Sieglinde<br />
Sieglinde<br />
Sieglinde<br />
Spunta<br />
Spunta<br />
Elvira<br />
Elvira<br />
Acrilammide 10%<br />
St = standard molecolari<br />
CN = controllo negativo<br />
P1 = Estr. fenolica<br />
S1 = Estr. con SDS<br />
Campagnia Sicilia Puglia<br />
Sieglinde<br />
Sieglinde<br />
Sieglinde
LA PROTEOMICA SCELZA<br />
sitometro GS-800 (Bio-Rad) e l’acquisizione delle<br />
immagini è stata realizzata utilizzando il software<br />
PDQuest (Bio-Rad).<br />
Le corse elettroforetiche mono- e bi-<strong>di</strong>mensionali<br />
sono stati eseguite in duplicato.<br />
Risultati<br />
Confronto dei meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> estrazione<br />
I meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> estrazione proteica basati, rispettivamente,<br />
sull’uso <strong>di</strong> fenolo e <strong>di</strong> SDS sono stati testati<br />
sulla cv Agria. Per verificare l’efficienza estrattiva<br />
dei due meto<strong>di</strong> messi a confronto, i campioni ottenuti<br />
dalle due <strong>di</strong>verse estrazioni sono stati sottoposti<br />
ad analisi elettroforetica mono<strong>di</strong>mensionale<br />
SDS-PAGE. Dai risultati ottenuti è emerso che<br />
nel campione <strong>di</strong> tubero erano presenti proteine <strong>di</strong><br />
<strong>di</strong>verso peso molecolare e che il metodo basato<br />
sull’uso <strong>di</strong> fenolo è risultato più efficiente (Figura<br />
2). In particolare quest’ultimo ha mostrato una<br />
maggiore efficienza nell’estrazione <strong>di</strong> proteine ad<br />
alto peso molecolare (75 e 100 kD), mentre quello<br />
basato sull’utilizzo <strong>di</strong> SDS è risultato più efficiente<br />
per le proteine a più basso peso molecolare (
SCELZA LA PROTEOMICA<br />
Tabella I.
LA PROTEOMICA SCELZA<br />
tato da Delaplace et al. 3, ha permesso <strong>di</strong> estrarre<br />
una maggior quantità <strong>di</strong> proteine e <strong>di</strong> ottenere gel<br />
<strong>di</strong> migliore qualità. La concentrazione <strong>di</strong> proteine<br />
riscontrata nelle cv siciliane oggetto <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o (Antea,<br />
Arinda e Spunta) è risultata maggiore rispetto a<br />
quelle campane e pugliesi, probabilmente a causa<br />
<strong>di</strong> fattori ambientali. Infatti la temperatura durante<br />
la crescita della pianta, le origini geografiche, la<br />
data <strong>di</strong> raccolta ed il tempo <strong>di</strong> conservazione possono<br />
influenzare le proprietà della <strong>patata</strong> 11-14. La<br />
quantità <strong>di</strong> proteine misurata nei tuberi oggetto <strong>di</strong><br />
stu<strong>di</strong>o è stata comunque maggiore rispetto a quella<br />
riportata in letteratura, pari a 1,55 g per 100 g<br />
<strong>di</strong> <strong>patata</strong> liofilizzata 15. Questo risultato potrebbe<br />
essere spiegato dalla non preventiva eliminazione<br />
del periderma (o buccia) dai tuberi analizzati, dal<br />
momento che la buccia è la frazione che contiene<br />
la maggior concentrazione <strong>di</strong> proteine 16.<br />
Le frazioni proteiche estratte dai tuberi provenienti<br />
dalle <strong>di</strong>verse regioni oggetto <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o sono<br />
state analizzate me<strong>di</strong>ante elettroforesi 2D per meglio<br />
evidenziare il profilo proteico dei tuberi e<br />
per in<strong>di</strong>viduare eventuali marcatori molecolari. Le<br />
proteine del tubero <strong>di</strong> <strong>patata</strong> possono essere classificate<br />
in tre gruppi: le patatine, gli inibitori delle<br />
proteasi e altre proteine 17. I primi due gruppi<br />
rappresentano la frazione principale delle proteine<br />
della <strong>patata</strong>. Le varie isoforme sono legate ad attività<br />
enzimatiche e <strong>di</strong> inibizione che potrebbero<br />
avere rilevanza fisiologica 10. Le patatine, in particolare,<br />
considerate il principale gruppo <strong>di</strong> proteine <strong>di</strong><br />
conservazione e <strong>di</strong>fesa della <strong>patata</strong>, rappresentano<br />
un gruppo <strong>di</strong> glicoproteine con peso molecolare<br />
nell’intervallo <strong>di</strong> 40-45 kDa e il 40% <strong>di</strong> tutte le proteine<br />
solubili presenti nei tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong> 18. Da<br />
quanto riportato in letteratura le patatine sembrano<br />
essere coinvolte nelle attività <strong>di</strong> alcuni enzimi, quali<br />
esterasi degli aci<strong>di</strong> grassi, aciltransferasi e acil idrolasi<br />
lipi<strong>di</strong>ca 19-21.<br />
Nei proteomi delle <strong>di</strong>verse cv analizzate il gruppo<br />
delle patatine è risultato essere sempre presente<br />
e sempre molto espresso rispetto al totale delle<br />
proteine rilevate. Proteine a più basso peso molecolare<br />
(72 kD) che, in accordo con quanto riportato da<br />
Lehesranta et al. 7, sarebbero proteine coinvolte nel<br />
metabolismo dei fenoli e nel loro deposito nei tuberi.<br />
Conclusioni<br />
Alla luce dei risultati ottenuti l’analisi proteomica<br />
dei tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong> può essere considerata un<br />
buono strumento per in<strong>di</strong>viduare marker molecolari<br />
che possano essere utili all’identificazione e alla<br />
<strong>tipizzazione</strong> dei tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong>. Ciò nonostante il<br />
contributo <strong>di</strong> una successiva analisi <strong>di</strong> spettrometria<br />
<strong>di</strong> massa che permette l’identificazione delle<br />
proteine presenti nei gel elettroforetici 2D si rende<br />
necessario e può rafforzare la vali<strong>di</strong>tà e l’applicabilità<br />
delle tecniche proteomiche.<br />
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15. Carillo P, Cacace D, de Rosa M, De Martino E, Cozzolino C, Nac-<br />
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of potato powder. Int J Food Sci Technol 2007;44:145-51.<br />
16. Barel G, Ginzberg I. Potato skin proteome in enriched with<br />
plant defence components. J Exp Bot 2008;59:3347-57.<br />
17. Pots AM, Gruppen H, van Diepenbeek R, van der Lee JJ, van<br />
Boekel MAJS, Wijngaards G et al. The effect of storage of whole<br />
potatoes of three cultivars on the patatin and protease inhibitor<br />
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TOF mass spectrometry. J Sci Food Agric 1999;79:1557-64.<br />
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from Archidendron ellipticum seeds: purification, characterization,<br />
and kinetic properties. Phytochemistry 2006;67:232-41.<br />
20. De Leo F, Volpicella M, Licciulli F, Liuni S, Gallerani R, Ceci LR.<br />
PLANT-PIs: a database for plant protease inhibitors and their<br />
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haemosorbents based on proteinase inhibitor. I. Synthesis and<br />
properties. Biomaterials 1993;14:51-6.<br />
Finanziamenti.—La ricerca è stata finanziata dal MiPAF, Progetto<br />
speciale “Tipizzazione e <strong>caratterizzazione</strong> <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>precoci</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
con l’impiego <strong>di</strong> tecniche molecolari e spettroscopiche”.<br />
Pervenuto il 12 <strong>di</strong>cembre 2011.<br />
Accettato il 19 marzo 2012.<br />
42 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 20125
Obiettivo. Negli ultimi anni si è osservato un crescente<br />
interesse alle proprietà nutraceutiche degli alimenti.<br />
Poiché il tubero <strong>di</strong> <strong>patata</strong> (Solanum tuberosum) rappresenta<br />
la terza coltura alimentare destinata al consumo<br />
umano, abbiamo condotto uno stu<strong>di</strong>o volto alla<br />
valutazione del contenuto in metaboliti secondari in<br />
tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong> precoce appartenenti a <strong>di</strong>versi cultivar<br />
e cresciuti in <strong>di</strong>verse aree geografiche e su <strong>di</strong>fferenti<br />
terreni.<br />
Meto<strong>di</strong>. A questo scopo, abbiamo messo a punto tecniche<br />
analitiche che consentissero lo stu<strong>di</strong>o qualiquantitativo<br />
<strong>di</strong> numerosi composti, minimizzando i<br />
trattamenti pre-analitici fonte <strong>di</strong> problemi <strong>di</strong> affidabilità.<br />
Abbiamo così identificato e quantizzato i metaboliti<br />
maggioritari: acido ascorbico, tirosina, caffeoil<br />
spermina, triptofano, acido-3-O-caffeoil-5-O-feruloilchinico,<br />
bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil spermina, acido clorogenico<br />
e neoclorogenico, ammide dell’acido ferulico, bis<br />
e tris-<strong>di</strong>idro-caffeoil-spermi<strong>di</strong>na, rutina, apigenina,<br />
glicoalcaloi<strong>di</strong> (α-solanina e α-chaconina), kaemferolo-<br />
3-O-rutinoside e quercetina <strong>di</strong>metil-etere.<br />
Risultati. I metaboliti più abbondanti nei tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
precoce sono l’acido clorogenico e l’acido ascorbico.<br />
In particolare, la <strong>patata</strong> precoce è risultata più<br />
ricca <strong>di</strong> quest’ultimo metabolita rispetto alla <strong>patata</strong><br />
comune; metaboliti come flavonoi<strong>di</strong>, derivati poliammi<strong>di</strong>ci<br />
e triptofano sono risultati presenti in bassissime<br />
quantità.<br />
Conclusioni. L’analisi del contenuto in glicoalcaloi<strong>di</strong><br />
dei tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong> precoce stu<strong>di</strong>ati ha permesso <strong>di</strong><br />
<strong>di</strong>mostrare che questi metaboliti sono presenti a concentrazioni<br />
molto più basse dei limiti critici. L’analisi<br />
statistica dei risultati ottenuti ha consentito <strong>di</strong> in<strong>di</strong>viduare<br />
le proprietà metabolomiche preponderanti<br />
nei cultivar stu<strong>di</strong>ati, ma anche <strong>di</strong> osservare come le<br />
caratteristiche chimiche del terreno sui quali i <strong>di</strong>versi<br />
Autore <strong>di</strong> contatto: F. Dal Piaz, Dipartimento <strong>di</strong> Scienze Farmaceutiche<br />
e Biome<strong>di</strong>che, Università <strong>di</strong> Salerno, via Ponte Don Melillo, 84084<br />
Fisciano, Salerno, Italia. E-mail: fdalpiaz@unisa.it<br />
MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):43-50<br />
Stu<strong>di</strong>o dei metaboliti secondari<br />
<strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>precoci</strong> <strong>di</strong> Solanum tuberosum<br />
L. LEPORE 1, M. PESCA 1, N. DE TOMMASI 1, D. CARPUTO 2, F. DAL PIAZ 1<br />
1Dipartimento <strong>di</strong> Scienze Farmaceutiche e Biome<strong>di</strong>che<br />
Università <strong>di</strong> Salerno, Fisciano, Salerno, Italia<br />
2Dipartimento <strong>di</strong> Scienze del Suolo della Pianta<br />
dell’Ambiente e delle Produzioni Animali (DISSPAPA)<br />
Università <strong>di</strong> Napoli Federico II, Portici, Napoli, Italia<br />
tuberi sono stati coltivati hanno un effetto chiaro e<br />
riproducibile sul loro contenuto in alcuni metaboliti<br />
secondari.<br />
Parole chiave: Metaboliti secondari - Solanum tuberosum -<br />
Polifenoli - Glicoalcaloi<strong>di</strong>.<br />
Il tubero <strong>di</strong> <strong>patata</strong> (Solanum tuberosum) segue solo<br />
il riso e il grano in importanza mon<strong>di</strong>ale, come coltura<br />
alimentare destinata al consumo umano. Oltre<br />
ad avere un alto valore nutrizionale, le patate, come<br />
altri vegetali, accumulano una serie <strong>di</strong> metaboliti secondari,<br />
tra cui composti polifenolici e glicoalcaloi<strong>di</strong>,<br />
come mezzo <strong>di</strong> <strong>di</strong>fesa da insulti sia biotici che abiotici.<br />
In particolare i polifenoli sono riconosciuti come<br />
importanti componenti in grado <strong>di</strong> esercitare effetti<br />
positivi sulla salute dell’uomo 1, 2, mentre i glicoalca-<br />
loi<strong>di</strong> della <strong>patata</strong> sono noti per la loro tossicità<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 43<br />
3, 4.<br />
L’interesse per lo stu<strong>di</strong>o del contenuto in metaboliti<br />
secondari della <strong>patata</strong> precoce nasce dalla crescente<br />
attenzione posta negli ultimi anni alle proprietà<br />
nutraceutiche e anti-nutraceutiche degli alimenti 5.<br />
Nel presente lavoro sono state messe a punto tecniche<br />
estrattive e analitiche al fine <strong>di</strong> identificare e<br />
quantizzare i metaboliti secondari più abbondanti<br />
nei tuberi <strong>di</strong> alcune cultivar <strong>di</strong> <strong>patata</strong> precoce. I<br />
metaboliti identificati e successivamente quantizzati
LEPORE STUDIO DEI METABOLITI SECONDARI DI VARIETà PRECOCI DI SolANUm tUBeroSUm<br />
sono stati: acido ascorbico, tirosina, caffeoil spermina,<br />
triptofano, acido-3-O-caffeoil-5-O-feruloil-chinico,<br />
bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil spermina, acido clorogenico<br />
e neoclorogenico, ammide dell’acido ferulico, bis e<br />
tris-<strong>di</strong>idro-caffeoil-spermi<strong>di</strong>na, rutina, apigenina, glicoalcaloi<strong>di</strong><br />
(α-solanina e α-chaconina), kaemferolo-<br />
3-O-rutinoside, quercetina <strong>di</strong>metil-etere. I metaboliti<br />
più abbondanti nei tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong> precoce sono risultati<br />
l’acido clorogenico, e l’acido ascorbico (vitamina<br />
C) 6. Di quest’ultimo metabolita la <strong>patata</strong> precoce<br />
risulta più ricca rispetto alla <strong>patata</strong> comune (30 mg/<br />
kg vs. 15 mg/kg), mentre metaboliti come flavonoi<strong>di</strong>,<br />
derivati poliammi<strong>di</strong>ci e triptofano sono risultati presenti<br />
in bassissime quantità. L’analisi del contenuto in<br />
glicoalcaloi<strong>di</strong> dei tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong> precoce stu<strong>di</strong>ati ha<br />
permesso <strong>di</strong> <strong>di</strong>mostrare che questi metaboliti sono<br />
presenti a concentrazioni molto più basse dei limiti<br />
critici. Correlando la provenienza geografica e il<br />
contenuto metabolico delle cultivar stu<strong>di</strong>ate, è stato<br />
possibile dedurre che all’interno della stessa cultivar<br />
stu<strong>di</strong>ate, coltivata in regioni <strong>di</strong>fferenti, le <strong>di</strong>fferenze<br />
nel tenore <strong>di</strong> metaboliti secondari sono significative.<br />
Materiali e meto<strong>di</strong><br />
materiale vegetale<br />
Sono stati analizzati tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong> precoce delle<br />
cultivar Arinda, Sieglinde, Spunta prelevati da <strong>di</strong>fferenti<br />
zone <strong>di</strong> coltivazione nelle regioni Puglia e<br />
Sicilia (Tabella I).<br />
estrazione<br />
L’estrazione è stata effettuata secondo il metodo<br />
riportato da Shakya et al. (2006) 1-12. I tuberi sono<br />
stati lavati con acqua deionizzata senza asportarne<br />
la buccia, asciugati e tagliati longitu<strong>di</strong>nalmente in<br />
otto parti uguali scartando le due estremità. In seguito<br />
sono stati ridotti in cubetti e, per evitare reazioni<br />
<strong>di</strong> degradazione enzimatica, sono stati imme<strong>di</strong>atamente<br />
congelati in azoto liquido e liofilizzati.<br />
Solo dopo la completa <strong>di</strong>sidratazione, il campione<br />
è stato ridotto in polvere fine me<strong>di</strong>ante l’uso <strong>di</strong> un<br />
omogeneizzatore. I campioni polverizzati sono stati<br />
conservati a -20 °C, al buio, fino all’uso. Sono stati<br />
pesati 400 mg <strong>di</strong> liofilizzato e messi in eppendorf da<br />
2 ml con 0,9 ml <strong>di</strong> buffer <strong>di</strong> (50% v/v <strong>di</strong> MeOH, 50%<br />
v/v <strong>di</strong> H 2O, con 2,5% <strong>di</strong> acido metafosforico e 1 mM<br />
<strong>di</strong> EDTA). Le eppendorf contenenti il campione <strong>di</strong>sperso<br />
nel buffer <strong>di</strong> estrazione sono state agitate con<br />
vortex per 1 minuto circa, sottoposte a sonicazione<br />
per 15 minuti, a bassa temperatura e alla massima<br />
potenza <strong>di</strong>sponibile. Dopo la sonicazione, le eppendorf<br />
sono state nuovamente agitate con vortex per<br />
1 minuto circa, poi centrifugate per 7 minuti, a 4 ºC,<br />
a 13000 rpm.<br />
Il surnatante è stato prelevato e trasferito in altre<br />
eppendorf. Il pellet rimanente è stato riestratto con<br />
0,6 ml del buffer <strong>di</strong> estrazione, sonicato e centrifugato.<br />
Della soluzione dei due surnatanti sono stati<br />
prelevati 200 µl, congelati a -80 ºC per 15 minuti e<br />
seccati in Speed Vac (Eppendorf, Amburgo, Germania)<br />
a temperatura ambiente, per due ore.<br />
Tabella I. — Siti <strong>di</strong> campionamento delle <strong>di</strong>fferenti aree <strong>di</strong> coltivazione nelle regioni Puglia e Sicilia.<br />
Campione Sigla Siti <strong>di</strong> campionamento Data raccolta<br />
Arinda (Sicilia) 09-AR-S-A1-3 Torre Milocca (SR) 2009<br />
Arinda (Sicilia) 09-AR-S-E1-3 Carruba-Riposto (CT) 21/05/2009<br />
Arinda (Sicilia) 09-AR-S-G1-3 Giar<strong>di</strong>naccio-Montef. S. Giorgio (ME) 22/05/2009<br />
Sieglinde (Puglia) 09-SG-P-C1-3 Cisternella (LE) 25/05/2009<br />
Sieglinde (Puglia) 09-SG-P-D1-3 San Fer<strong>di</strong>nando (BAT) 26/05/2009<br />
Sieglinde (Puglia) 09-SG-P-C-COM Puglia 2009<br />
Sieglinde (Sicilia) 09-SG-S-F2-3 Scala- Torregrotta (ME) 22/05/2009<br />
Sieglinde (Sicilia) 09-SG-S-I-GIARRE Giarre (CT) 2009<br />
Sieglinde (Sicilia) 09-SG-S-L-ISPICA Ispica (RG) 2009<br />
Sieglinde (Sicilia) 09-SG-S-H-MARSALA Marsala (TP) 2009<br />
Spunta (Puglia) 09-SP-P-A1-3 Chianchi (LE) 25/05/2009<br />
Spunta (Puglia) 09-SP-P-I1-3 Mola <strong>di</strong> Bari-Cozze (BA) 2009<br />
Spunta (Puglia) 09-SP-S-B1-3 Cassibile (SR) 21/05/2009<br />
Spunta (Puglia) 09-SP-S-C1-3 Acireale-Scura (CT) 21/05/2009<br />
44 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
STUDIO DEI METABOLITI SECONDARI DI VARIETà PRECOCI DI SolANUm tUBeroSUm LEPORE<br />
Analisi HPlC-DAD<br />
Le analisi sono state realizzate usando un HPLC-<br />
DAD Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Palo<br />
Alto, CA, USA), costituito da una pompa binaria (G-<br />
1312A), un auto-campionatore (G-1329A), un degassatore<br />
(G-1322A) e un rivelatore a serie <strong>di</strong> <strong>di</strong>o<strong>di</strong><br />
(1315D). I solventi usati sono il metanolo (ottenuto<br />
da Romil, Cambridge, UK),) per la fase B e l’acqua<br />
milliQ (preparata usando un Millipore, Bedford, MA,<br />
USA). Gli standard sono stati acquistati da Extrasynthese<br />
(Lione, Francia), e Sigma Aldrich (Milano, Italia).<br />
Le analisi sono state effettuate utilizzando una<br />
colonna monolitica Onyx (50x2 mm C18, Phemomenex,<br />
Italia), velocità <strong>di</strong> flusso utilizzata 0,600 ml/min,<br />
lunghezza d’onda selezionata 280 nm. I campioni<br />
sono stati iniettati in triplicato.<br />
Il gra<strong>di</strong>ente utilizzato è stato: da 0 a 1 min, 100%<br />
<strong>di</strong> tampone A (H2O + 0,01% acido trifluoroacetico);<br />
da 1 a 6,7 min, 0-30% <strong>di</strong> tampone B (MeOH Merck);<br />
da 6,7 a 11,7 min, 30-70% <strong>di</strong> B; da 11,7 a 14,56, 70-<br />
90% <strong>di</strong> B; da 14,56 a 18, 90% <strong>di</strong> B, con un post-time<br />
<strong>di</strong> 4 minuti. L’identificazione dei picchi cromatografici<br />
è stata effettuata me<strong>di</strong>ante analisi <strong>di</strong> spettrometria<br />
<strong>di</strong> massa. Gli standard sono stati preparati alla<br />
concentrazione <strong>di</strong> 0,05 mg/ml. La quantificazione<br />
dei composti fenolici, aminoaci<strong>di</strong> e acido ascorbico,<br />
è stata effettuata nelle medesime con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong><br />
analisi dell’estratto. Sono state costruite le curve <strong>di</strong><br />
calibrazione degli standard acido ascorbico, tirosina,<br />
triptofano, acido ferulico, acido caffeico, acido clorogenico,<br />
rutina e quercetina. L’acido neoclorogenico è<br />
stata valutato come equivalente <strong>di</strong> acido clorogenico.<br />
I derivati dell’acido caffeico (caffeoil spermina, bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil<br />
spermina, tris-<strong>di</strong>idro caffeoil spermi<strong>di</strong>na)<br />
sono stati stu<strong>di</strong>ati come equivalenti <strong>di</strong> acido caffeico.<br />
Gli standard sono stati preparati a una concentrazione<br />
stock <strong>di</strong> 10 mg/ml in metanolo, eccetto la tirosina<br />
e triptofano preparate ad una concentazione 10 mg/<br />
ml 0,1 N HCl 7. Sono state effettuate iniettate a <strong>di</strong>versi<br />
volumi <strong>di</strong> iniezione (da avere 0,1 µg, 0,5 µg, 1<br />
µg, 1,5 µg, 2 µg, 3 µg). Riportando in grafico le aree<br />
dei picchi cromatografici inn funzione delle rispettive<br />
concentrazioni, è stata ottenuta una curva <strong>di</strong> calibrazione<br />
con almeno 6 punti per ogni standard, utile per<br />
quantizzare i metaboliti.<br />
Analisi lC-mS<br />
Le analisi LC-MS/MS sono state eseguite con uno<br />
strumento <strong>di</strong> Q-TOF Premier (Waters, Milford, MA,<br />
USA), dotato <strong>di</strong> una sorgente electrospray, accoppiato<br />
ad un HPLC Alliance 2695 (Waters).<br />
Il tuning e la calibrazione dello strumento sono state<br />
effettuate utilizzando uno standard puro <strong>di</strong> Solanina<br />
([M+H] += m/z 869,07). I campioni sono stati sciolti in<br />
1,5 ml <strong>di</strong> acqua, agitati me<strong>di</strong>ante vortex per 1 minuto<br />
circa, e poi centrifugati per 2 min a 13 rpm. Dalla soluzione<br />
ottenuta, sono stati prelevati 1 ml a cui sono<br />
stati aggiunti 20 µl <strong>di</strong> angiotensina come standard interno.<br />
Lo standard è stato preparato partendo da una<br />
soluzione standard 8 mg/ml, successivamente <strong>di</strong>luito<br />
fino ad una concentrazione <strong>di</strong> 40,8 µg/ml. La separazione<br />
cromatografica è stata condotta iniettando 10 μl<br />
<strong>di</strong> ciascun campione su una colonna monolitica Onyx<br />
(Phenomenex) (50x2 mm, una velocità <strong>di</strong> flusso 0.4<br />
ml/min). Il gra<strong>di</strong>ente <strong>di</strong> eluizione è: 0-1 min buffer A<br />
al 100% (H2O + 10 mM <strong>di</strong> acido formico, pH 3,5, con<br />
NH4OH), 1-6,7 min 0-30% <strong>di</strong> buffer B (MeOH), 6,7-<br />
11,7 min 40-70% <strong>di</strong> buffer B, 11,7-14,56 min 70-100%<br />
<strong>di</strong> buffer B, 14,56-20 min 100% buffer B. Le analisi<br />
sono state condotte in polarità positiva. La temperatura<br />
della sorgente è stata fissata a 80 ºC, con temperatura<br />
<strong>di</strong> desolvatazione <strong>di</strong> 150 ºC. Il capillary voltage<br />
usato era pari a 3 kV e il sampling cone 30 eV. La<br />
collision energy pari a 2, la cell entrance 5, la cell exit<br />
-20. I metaboliti analizzati me<strong>di</strong>ante HPLC sono stati<br />
identificati me<strong>di</strong>ante analisi LC-ESI-MS sia dell’estratto<br />
che <strong>di</strong> una soluzione multi-standard, contenente<br />
i principali metaboliti caratterizzati. Il multi-standard<br />
è stato preparato a partire dai singoli analiti ad una<br />
concentrazione 100 mg/ml in MeOH. Successivamente<br />
tutte le soluzioni sono state <strong>di</strong>luite a 0,1 mg/ml. Di<br />
ogni standard <strong>di</strong>luito a 0,1 mg/ml sono stati prelevati<br />
5 µl e portato a 500 µl finali <strong>di</strong> acqua.<br />
Me<strong>di</strong>ante LC-MS sono stati identificati e quantizzati<br />
i glicoalcaloi<strong>di</strong> α-chaconina e α-solanina (metodo<br />
dell’aggiunta standard). I dati sono stati analizzati<br />
attraverso l’uso del software MassLynx 4.1 (Waters).<br />
La quantizzazione è stata ottenuta me<strong>di</strong>ante<br />
la curva <strong>di</strong> calibrazione, utilizzando come standard<br />
α-chaconina, α-solanina e apigenina. Gli esperimenti<br />
sono stati condotti in triplicato, sono stati iniettati <strong>di</strong>versi<br />
volumi in modo da ottenere per i glicoalcaloi<strong>di</strong><br />
25 ng, 50 ng, 75 ng, 100 ng, 150 ng e 250 ng e per<br />
l’apigenina 0,125 ng, 0,25 ng, 1 ng, 1,5 ng.<br />
Risultati e <strong>di</strong>scussione<br />
Lo stu<strong>di</strong>o dei metaboliti secondari <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>precoci</strong><br />
<strong>di</strong> Solanum tuberosum L. (solanaceae) è stato<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 45
LEPORE STUDIO DEI METABOLITI SECONDARI DI VARIETà PRECOCI DI SolANUm tUBeroSUm<br />
mg/Kg<br />
1.800<br />
1.600<br />
1400<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13<br />
09-AR-S-A 09-AR-S-E<br />
09-AR-S-G<br />
Figura 1. — ESI (+) LC-MS <strong>di</strong> un estratto totale <strong>di</strong> tubero. Picchi:<br />
(1) acido ascorbico; (2) tirosina; (3) caffeoil spermina, (4) triptofano,<br />
(5) 3-O-caffeoil-5-O-feruloil acido chinico; (6) bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil<br />
spermina; (7) acido clorogenico, (8) rutina; (9) Tris(<strong>di</strong>hydrocaffeoyl)<br />
spermi<strong>di</strong>ne; (10) α-chaconine; (11) α-solanina; (12) kaemferol- 3-Orutinoside;<br />
(13) 3-OMe-Quercetina; (14) apigenina.<br />
realizzato utilizzando tuberi raccolti in <strong>di</strong>versi siti <strong>di</strong><br />
coltivazione in Puglia e Sicilia. Le regioni dei siti<br />
<strong>di</strong> raccolta del tubero <strong>di</strong> Solanum tuberosum rappresentano<br />
le zone agricole dove si concentra la<br />
maggior parte della produzione, commercializzazione<br />
ed esportazione della <strong>patata</strong> novella in Italia. I<br />
tuberi freschi sono stati congelati in azoto liquido,<br />
mg/Kg<br />
1.800<br />
1.600<br />
1400<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
conservati al buio a -20 °C fino all’uso, l’estrazione è<br />
stata effettuata in metanolo ed acido meta-fosforico<br />
utilizzando gli ultrasuoni sul prodotto liofilizzato 7.<br />
L’identificazione e la quantizzazione dei metaboliti<br />
presenti negli estratti <strong>di</strong> tubero è stata ottenuta me<strong>di</strong>ante<br />
HPLC-DAD, l’analisi quantitativa è stata effettuata<br />
attraverso curve <strong>di</strong> calibrazione da standard<br />
puri. In tutti i tuberi analizzati i metaboliti più abbondanti<br />
sono risultati acido clorogenico ed ascorbico.<br />
La definitiva identificazione dei metaboliti secondari<br />
e l’analisi quali-quantitava dei glicoalcaloi<strong>di</strong><br />
è stata ottenuta me<strong>di</strong>ante LC-MS/MS (Figura 1) 8-10.<br />
I risultati dello stu<strong>di</strong>o quali quantitativo sono mostrati<br />
nelle Figure 2-4. Analizzando i risultati ottenuti<br />
per i tuberi della cultivar Spunta un contenuto <strong>di</strong><br />
acido ascorbico e acido clorogenico superiore è stato<br />
osservato per il campione 09-SP-P-A (1600 mg/<br />
kg e 1200 mg/kg rispettivamente) rispetto a quanto<br />
osservato per gli altri tuberi della stessa cultivar (acido<br />
ascorbico 900-1200 mg/kg ed acido clorogenico<br />
400-700 mg/kg, rispettivamente, Figura 3).<br />
Il contenuto degli analiti identificati nei tuberi della<br />
cultivar Arinda è risultato me<strong>di</strong>amente più basso<br />
rispetto a quanto rilevato per i tuberi della <strong>varietà</strong><br />
Spunta, con l’eccezione <strong>di</strong> acido ascorbico, tirosina<br />
ed acido clorogenico, che risultavano i metaboliti<br />
più abbondanti (44%, 17% e 15%, rispettivamente).<br />
I flavonoi<strong>di</strong> e i derivati poliamminici (caffeoil spermina,<br />
bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil spermina, tris <strong>di</strong>idrocaffeoil<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13<br />
09-SG-P-C 09-SG-P-D<br />
09-SG-S-F 09-SG-P-C-COM<br />
09-SG-S-I-GIARRE 09-SG-S-L-ISPICA 09-SG-S-H-MARSALA<br />
Figura 2. — Metaboliti (mg/kg <strong>di</strong> droga secca) osservati nei tuberi della cultivar spunta: (1) acido ascorbico, (2) tirosina, (3) caffeoil spermina,<br />
(4) triptofano, (5) acido 3-caffeoil-5-o- feruloil chinico, (6) bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil spermina, (7) acido neoclorogenico, (8) acido clorogenico,<br />
(9) ammide dell’acido ferulico, (10) bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil spermi<strong>di</strong>na, (11) tris-<strong>di</strong>idrocaffeoil spermi<strong>di</strong>na, (12) flavonoi<strong>di</strong>,, (13) alcaloi<strong>di</strong>.<br />
46 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
STUDIO DEI METABOLITI SECONDARI DI VARIETà PRECOCI DI SolANUm tUBeroSUm LEPORE<br />
mg/Kg<br />
1.800<br />
1.600<br />
1400<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13<br />
09-SPP-A 09-SPP-I<br />
09-SPS-B 09-SPS-C<br />
Figura 3. — Metaboliti (mg/kg <strong>di</strong> droga secca) osservati nei tuberi della cultivar arinda: (1) acido ascorbico, (2) tirosina, (3) caffeoil spermina,<br />
(4) triptofano, (5) acido 3-caffeoil-5-o-feruloil chinico, (6) bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil spermina, (7) acido neoclorogenico, (8) acido clorogenico,<br />
(9) ammide dell’acido ferulico, (10) bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil spermi<strong>di</strong>na, (11) tris-<strong>di</strong>idrocaffeoil spermi<strong>di</strong>na, (12) flavonoi<strong>di</strong>, (13) alcaloi<strong>di</strong>.<br />
Arinda<br />
Sieglinde<br />
Spunta<br />
Acido ascorbico<br />
Ammide dell’acido ferulico<br />
Chlorogenic acid<br />
Acido 3-0-caffeoil-5-0-feruloil<br />
chinico<br />
Flavonoi<strong>di</strong><br />
Acido neoclorogenico<br />
Totale alcaloi<strong>di</strong><br />
Totale spermina<br />
Triptofano<br />
Tirosina<br />
Figura 4. — Metaboliti (mg/kg <strong>di</strong> droga secca) osservati nei tuberi<br />
della cultivar sieglinde: (1) acido ascorbico, (2) tirosina, (3) caffeoil<br />
spermina, (4) triptofano, (5) acido 3-caffeoil-5-o- feruloil chinico,<br />
(6) bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil spermina, (7) acido neoclorogenico, (8) acido<br />
clorogenico, (9) ammide dell’acido ferulico, (10) bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil<br />
spermi<strong>di</strong>na, (11) tris-<strong>di</strong>idrocaffeoil spermi<strong>di</strong>na, (12) flavonoi<strong>di</strong>, (13)<br />
alcaloi<strong>di</strong>.<br />
spermi<strong>di</strong>na e bis <strong>di</strong>idrocaffeoil spermi<strong>di</strong>na) erano<br />
presenti in piccole quantità 11-13. Anche i tuberi della<br />
cultivar Sieglinde presentavano un alto contenuto <strong>di</strong><br />
acido clorogenico, che risultava essere il costituente<br />
principale tra i metaboliti secondari (31%, corrispondente<br />
ad un valore me<strong>di</strong>o 800 mg/kg in peso<br />
secco). In particolare, i tuberi <strong>di</strong> SG-P-D e 09-SG-P-<br />
C-COM risultavano particolarmente ricchi in questo<br />
metabolita, con un contenuto totale pari a 1000 mg/<br />
kg. Altri metaboliti secondari osservati con concentrazioni<br />
elevate sono stati l’acido ascorbico, tirosina,<br />
glicoalcaloi<strong>di</strong>, ed acido neoclorogenico risultano rispettivamente<br />
23%, 17%, 8% e 10% dei metaboliti<br />
totali. Meno abbondanti sono risultati, come per le<br />
altre cultivar, flavonoi<strong>di</strong>, esteri poliamminici (caffeoil<br />
spermina, bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil spermina, tris <strong>di</strong>idrocaffeoil<br />
spermi<strong>di</strong>na e bis <strong>di</strong>idrocaffeoil spermi<strong>di</strong>na),<br />
triptofano ed acido ferulico. La variabilità e le analogie<br />
tra le <strong>di</strong>verse cultivar <strong>di</strong> <strong>patata</strong> precoce e le<br />
eventuali relazioni tra il contenuto in metaboliti secondari<br />
e la loro provenienza geografica, sono state<br />
stu<strong>di</strong>ate me<strong>di</strong>ante il confronto del contenuto qualiquantitativo<br />
dei composti identificati (Figura 5).<br />
Il contenuto in metaboliti secondari delle cultivar<br />
Spunta e Arinda risultava simile nonostante i<br />
campioni analizzati provengano da regioni <strong>di</strong>verse.<br />
Il contenuto <strong>di</strong> acido ascorbico e tirosina variava<br />
da 35-44% e 11-18% rispettivamente, mentre<br />
il contenuto in acido clorogenico presentava note-<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 47
LEPORE STUDIO DEI METABOLITI SECONDARI DI VARIETà PRECOCI DI SolANUm tUBeroSUm<br />
a-chaconine a-solanine<br />
93%<br />
7%<br />
Figura 5. — Confronto tra le quantità (mg/kg <strong>di</strong> droga secca) <strong>di</strong> metaboliti<br />
secondari osservati nei tuberi della cultivar Arinda, Spunta,<br />
Seglinde.<br />
voli variazioni (dal 16 al 31%, Figura 5). Le abbondanze<br />
relative dei metaboliti minori, quali i derivati<br />
poliamminici (caffeoil spermina, bis-<strong>di</strong>idrocaffeoil<br />
spermina, tris <strong>di</strong>idrocaffeoil spermi<strong>di</strong>na e bis <strong>di</strong>idrocaffeoil<br />
spermi <strong>di</strong>na, total spermine), gli alcaloi<strong>di</strong> e<br />
i flavonoi<strong>di</strong> risultavano simili nelle 2 cultivar. I tuberi<br />
delle cultivar Arinda e Spunta si presentavano<br />
particolarmente ricchi in acido ascorbico (circa 44%<br />
per entrambe), mentre quelli della cultivar Sieglinde<br />
presentavano un contenuto <strong>di</strong> acido ascorbico<br />
del 23-26%, il contenuto <strong>di</strong> acido clorogenico e alcaloi<strong>di</strong><br />
in questa cultivar era leggermente superiore<br />
rispetto alle altre (31-33%). La quantità <strong>di</strong> alcaloi<strong>di</strong><br />
osservata in tutte le cultivar analizzate risultava<br />
omogenea (5-8%), i glicoalcaloi<strong>di</strong> identificati sono<br />
l’α-chaconina e l’α-solanina. Il glicoalcaloide più<br />
abbondante è risultato l’α-chaconina (93%), come<br />
mostra il grafico in Figura 6. Stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> letteratura<br />
hanno evidenziato che il contenuto in glicoalcaloi<strong>di</strong><br />
in Solanum tuberosum è proporzionale a quello in<br />
acido cloro genico 4, ciò è risultato evidente anche<br />
dai nostri dati come si può osservare nei grafici nelle<br />
Figure 7-8, l’andamento del contenuto metabolico<br />
dei glicoalcaloi<strong>di</strong> è correlato a quello dell’acido<br />
clorogenico.<br />
Successivamente, il contenuto in metaboliti secondari<br />
delle stesse cultivar è stato analizzato rispetto<br />
al pH dei terreni <strong>di</strong> raccolta dei tuberi 14. Dai dati<br />
ottenuti il contenuto <strong>di</strong> acido ascorbico sembra non<br />
essere influenzato dal pH (400-600 mg/kg), tirosina<br />
Figura 6. — Valore me<strong>di</strong>o dei glicoalcaloi<strong>di</strong> (mg/kg <strong>di</strong> droga secca)<br />
osservati nei campioni analizzati.<br />
Figura 7. — Glicoalcaloi<strong>di</strong> (mg/kg <strong>di</strong> droga secca) osservati nei<br />
campioni (1) 09-AR-S-A, (2) 09-AR-S-E, (3) 09-AR-S-G, (4) 09-SP-P-A,<br />
(5) 09-SP-P-I, (6) 09-SP-P-B, (7) 09-SP-P-C, (8) 09-SG-P-C, (9) 09-SG-<br />
P-D, (10) 09-SG-S-F, (11) 09-SG-P-C-COM, (12) 09-SG-S-I-GIARRE,<br />
(12) 09-SG-S-ISPICA, (13) 09-SG-S-H-MARSALA<br />
0<br />
Molto acido Neutro Alcalino<br />
Figura 8. — Acido clorogenico (mg/kg <strong>di</strong> droga secca) osservato nei<br />
campioni (1) 09-AR-S-A, (2) 09-AR-S-E, (3) 09-AR-S-G, (4) 09-SP-P-A,<br />
(5) 09-SP-P-I, (6) 09-SP-P-B, (7) 09-SP-P-C, (8) 09-SG-P-C, (9) 09-SG-<br />
P-D, (10) 09-SG-S-F, (11) 09-SG-P-C-COM, (12) 09-SG-S-I-GIARRE,<br />
(12) 09-SG-S-ISPICA, (13) 09-SG-S-H-MARSALA<br />
e 3-O-caffeoil-5-O-feruloil-chinico presentavano una<br />
concentrazione inversamente proporzionale all’aumentare<br />
del pH (555, 413, 238 mg/kg, e193, 83, 35<br />
48 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012<br />
mg/Kg<br />
mg/Kg<br />
1.400<br />
1.200<br />
1.000<br />
800<br />
300<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
1.800<br />
1.600<br />
1.400<br />
1.200<br />
1.000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
600<br />
400<br />
200<br />
1 2 3 4 5 6 7<br />
1 2 3 4 5 6 7<br />
Alcaloi<strong>di</strong> totali<br />
8 9 10 11 12 13 14<br />
Acido clorogenico<br />
8 9 10 11 12 13 14
STUDIO DEI METABOLITI SECONDARI DI VARIETà PRECOCI DI SolANUm tUBeroSUm LEPORE<br />
100<br />
50<br />
0<br />
2.50<br />
mg/kg, rispettivamente), triptofano, acido clorogenico<br />
e acido neoclorogenico presentavano un profilo<br />
simile e pH <strong>di</strong>pendente; infatti questi analiti sono<br />
prodotti in quantità significativamente superiori dai<br />
tuberi coltivati in terreni alcalini (117, 1200, 400 mg/<br />
kg, rispettivamente). In Figura 9 sono riportati i valori<br />
dell’acido clorogenico in funzione del pH del<br />
terreno <strong>di</strong> coltivazione dei tuberi, come appare evidente<br />
il valore me<strong>di</strong>o <strong>di</strong> questo analita a pH bassi è<br />
<strong>di</strong> circa 300 mg/kg, a pH neutri è <strong>di</strong> circa 650 mg/<br />
kg e cresce significativamente a pH alcalini (circa<br />
1200 mg/kg).<br />
Uno stu<strong>di</strong>o comparativo dei metaboliti secondari<br />
presenti nei tuberi della Cultivar Spunta raccolti in<br />
Sicilia e Puglia evidenziava nei tuberi provenienti<br />
dalla Puglia un contenuto <strong>di</strong> acido ascorbico, acido<br />
clorogenico e alcaloi<strong>di</strong> maggiore rispetto a quello<br />
dei tuberi prelevati della Sicilia. I tuberi <strong>di</strong> Sieglinde<br />
della Puglia mostravano un contenuto <strong>di</strong> acido<br />
ascorbico e tirosina significativamente maggiore rispetto<br />
ai campioni provenienti dalla Sicilia. La tirosina<br />
non sembra essere influenzata dal variare della<br />
5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 Time<br />
Figura 9. — Acido clorogenico (mg/kg <strong>di</strong> droga secca) osservato in tuberi cresciuti in terreni a pH acido, neutro e alcalino.** La <strong>di</strong>fferenza<br />
fra le me<strong>di</strong>e osservate è significativa al 95%, P
LEPORE STUDIO DEI METABOLITI SECONDARI DI VARIETà PRECOCI DI SolANUm tUBeroSUm<br />
coalcaloi<strong>di</strong> (α-solanina e α-chaconina), kaemferolo-<br />
3-O-rutinoside, quercetina <strong>di</strong>metil-etere. Il confronto<br />
dei profili dei metaboliti secondari osservati per i<br />
<strong>di</strong>versi tuberi analizzati è stato effettuato me<strong>di</strong>ante<br />
comparazioni intra e inter-cultivar. Dalle analisi<br />
inter-cultivar è emerso che Arinda e Spunta sono<br />
particolarmente ricche in acido ascorbico. Il contenuto<br />
in acido clorogenico è abbastanza omogeneo,<br />
tranne nella cultivar Arinda, dove risulta in quantità<br />
inferiori. Flavonoi<strong>di</strong>, derivati poliammi<strong>di</strong>ci, triptofano<br />
sono presenti in bassissime quantità in tutte le<br />
cultivar analizzate, così come il contenuto in alcaloi<strong>di</strong>.<br />
Al fine <strong>di</strong> determinare eventuali correlazioni tra il<br />
profilo dei metaboliti secondari quantizzati e la loro<br />
provenienza geografica, o il pH del terreno in cui i<br />
tuberi erano stati coltivati, analisi intra-cultivar sono<br />
state effettuate. Mettendo in correlazione la provenienza<br />
geografica e il contenuto metabolico delle<br />
cultivar, è stato possibile dedurre che all’interno<br />
della stessa cultivar, coltivata in regioni <strong>di</strong>fferenti, le<br />
<strong>di</strong>fferenze in metaboliti sono significative, tuttavia<br />
tali <strong>di</strong>fferenze non presentano lo stesso andamento<br />
per tuberi <strong>di</strong> cultivar <strong>di</strong>fferenti. Dalle analisi intracultivar,<br />
effettuate per la valutazione dell’effetto del<br />
pH del terreno (composizione vs. pH), si è potuto<br />
osservare che il contenuto <strong>di</strong> acido ascorbico, ammide<br />
dell’acido ferulico e alcuni derivati delle spermine<br />
non è influenzato dal pH del terreno, tirosina<br />
ed acido 3-O-caffeoil-5-O-feruloil chinico presentano<br />
una concentrazione inversamente proporzionale<br />
all’aumento del pH, mentre triptofano, acido<br />
neoclorogenico, acido clorogenico presentano un<br />
aumento <strong>di</strong> concentrazione proporzionale all’aumento<br />
del pH. Le cultivar <strong>di</strong> <strong>patata</strong> precoce analizzate<br />
risultavano una interessante fonte <strong>di</strong> acido<br />
ascorbico 15, 16.<br />
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50 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):51-60<br />
Definizione <strong>di</strong> una firma “geochimico-mineralogica”<br />
dei suoli destinati alla produzione della <strong>patata</strong> precoce<br />
Obiettivo. Definire parametri mineralogici e pattern geochimici<br />
identificativi dei suoli delle aree <strong>di</strong> provenienza<br />
<strong>di</strong> patate <strong>precoci</strong> prodotte in tre regioni del sud Italia.<br />
Per un numero selezionato <strong>di</strong> campioni, tali parametri<br />
sono stati ricercati anche nel suolo adeso ai tuberi.<br />
Meto<strong>di</strong>. Suolo e tuberi sono stati prelevati a fine ciclo<br />
produttivo in 12 siti ubicati in Puglia, Campania e Sicilia.<br />
Dei siti è stato stu<strong>di</strong>ato il contesto geologico e sui suoli<br />
sono stati determinati: granulometria (granulometro<br />
laser), pH, carbonati totali (calcimetro), carbonio organico<br />
(Walkley-Black), CSC e basi <strong>di</strong> scambio (BaCl 2 a pH<br />
8.2), P assimilabile (metodo Olsen), Fe, Al e Si (ossalato<br />
e DCB), composizione multielementare (ICP-MS), mineralogia<br />
(XRD).<br />
Risultati. I substrati parentali sono riconducibili a tre<br />
tipologie principali: rocce calcaree, se<strong>di</strong>menti alluvionali<br />
e substrati vulcanici. I suoli sono caratterizzati da tessitura<br />
sciolta e pH generalmente neutro e subalcalino. La<br />
maggior parte è povera <strong>di</strong> carbonati e CO con bassa CSC.<br />
Quarzo, feldspati, calcite e minerali argillosi in <strong>di</strong>verse<br />
quantità relative si associano in ambiente vulcanico con<br />
ossi<strong>di</strong> <strong>di</strong> ferro e alluminosilicati a scarso or<strong>di</strong>ne cristallino.<br />
Distintivo è il contenuto totale <strong>di</strong> macro e micronutrienti,<br />
mentre le quantità bio<strong>di</strong>sponibili degli stessi elementi<br />
non <strong>di</strong>fferenziano altrettanto bene i suoli <strong>di</strong> aree<br />
geografiche <strong>di</strong>verse. Il suolo adeso ai tuberi ha curve<br />
granulometriche e tracciati XRD simili al suolo tal quale,<br />
ma più elevate quantità <strong>di</strong> particelle <strong>di</strong> minori <strong>di</strong>mensioni<br />
che ne <strong>di</strong>fferenziano la composizione geochimica.<br />
Conclusioni. Gli in<strong>di</strong>catori suolo-<strong>di</strong>pendenti <strong>di</strong>fferenziano<br />
bene i suoli <strong>di</strong> provenienza della <strong>patata</strong> precoce. Il<br />
suolo adeso ai tuberi con alcune <strong>di</strong>fferenze rispecchia la<br />
mineralogia, la granulometria e la composizione geochimica<br />
del suolo <strong>di</strong> provenienza.<br />
Parole chiave: Suolo - Tracciabilità - Prodotti agroalimentari.<br />
Autore <strong>di</strong> contatto: S. Vingiani, Dipartimento <strong>di</strong> Scienze del Suolo,<br />
della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Università <strong>di</strong><br />
Napoli Federico II, Via Università, 100, 80055 Portici (Napoli), Italia.<br />
E-mail: vingiani@unina.it<br />
S. VINGIANI, M. ZAMPELLA, L. MINIERI, F. TERRIBILE, P. ADAMO<br />
Dipartimento <strong>di</strong> Scienze del Suolo, della Pianta<br />
dell’Ambiente e delle Produzioni Animali<br />
Università <strong>di</strong> Napoli Federico II, Napoli, Italia<br />
I l regolamento CE 178/2002, che istituisce la European<br />
Food Safety Authority, stabilisce principi e requisiti<br />
generali riguardo alla “rintracciabilità” dei prodotti<br />
agroalimentari definendola come la capacità <strong>di</strong><br />
ritrovare la traccia o origine dei prodotti. Ciò in risposta<br />
alle crescenti richieste <strong>di</strong> sicurezza alimentare da<br />
parte dei consumatori e all’esigenza delle aziende <strong>di</strong><br />
innovarsi per essere competitive su un mercato sempre<br />
più globalizzato 1. La denominazione <strong>di</strong> origine<br />
ha rappresentato un primo passo finalizzato alla salvaguar<strong>di</strong>a<br />
dei prodotti agroalimentari, definendo dei<br />
parametri <strong>di</strong>stintivi che permettono <strong>di</strong> in<strong>di</strong>viduarne la<br />
tipicità. Il passo successivo è stato l’identificazione e<br />
valutazione <strong>di</strong> meto<strong>di</strong> e tecniche analitiche che forniscano<br />
informazioni significative per la determinazione<br />
della zona geografica <strong>di</strong> origine del prodotto. Tra<br />
i meto<strong>di</strong> considerati: l’analisi sensoriale, le tecniche<br />
spettroscopiche, la risonanza magnetica nucleare,<br />
i meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> rilevamento delle impronte elementare<br />
ed isotopica basati sull’impiego della spettrometria<br />
<strong>di</strong> massa 2. Diffuso è l’impiego dell’analisi me<strong>di</strong>ante<br />
GS-IRMS del rapporto isotopico dei cosiddetti “bioelementi”<br />
(C, N, O, H e S), il cui valore, tuttavia, risulta<br />
fortemente influenzato da parametri sia ambientali,<br />
quali le variazioni climatiche, sia <strong>di</strong> gestione, quali<br />
l’impiego <strong>di</strong> fertilizzanti 3. Diversi altri meto<strong>di</strong> sono<br />
attualmente oggetto <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o allo scopo <strong>di</strong> ottenere<br />
informazioni univoche circa la provenienza geografica<br />
degli alimenti. Tra questi, <strong>di</strong> particolare interesse<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 51
VINGIANI DEFINIZIONE DI UNA FIRMA “GEOCHIMICO-MINERALOGICA” DEI SUOLI DESTINATI ALLA PRODUZIONE DELLA PATATA PRECOCE<br />
sono quelli basati sull’impiego <strong>di</strong> traccianti o in<strong>di</strong>catori<br />
geogenici e pedogenici caratterizzati da scarsa<br />
o nulla variazione stagionale o annuale e pertanto<br />
stabili nel lungo periodo<br />
4, 5.<br />
La composizione mineralogica e la concentrazione<br />
<strong>di</strong> macro e microelementi del suolo sono, infatti, il<br />
risultato dell’influenza esercitata per lungo tempo e<br />
in modo combinato dalla matrice litologica e da tutti i<br />
fattori attivi nella pedosfera, con particolare riferimento<br />
all’intensità dei processi <strong>di</strong> weathering, lisciviazione<br />
e pedogenesi. Mineralogia e geochimica riflettono<br />
le interazioni che si stabiliscono tra i fattori <strong>di</strong> formazione<br />
del suolo: roccia madre, clima, tempo, rilievo<br />
ed entità biotiche. Pertanto, suoli formatisi in areali<br />
geografici <strong>di</strong>versi tendono ad essere caratterizzati da<br />
qualità e quantità <strong>di</strong> minerali <strong>di</strong>versi la cui identificazione<br />
e <strong>caratterizzazione</strong> chimica può consentire<br />
<strong>di</strong> ottenere preziose informazioni su tipo e proprietà<br />
del suolo <strong>di</strong> appartenenza. Le stesse concentrazioni<br />
<strong>di</strong> elementi in traccia nei tessuti delle piante sono regolate<br />
dal loro contenuto nei suoli, dalla forma in cui<br />
si trovano e dai fattori che ne influenzano la mobilità,<br />
nonché dalla capacità <strong>di</strong> assorbimento da parte dei<br />
vegetali.<br />
Sulla base <strong>di</strong> tali premesse, l’obiettivo principale<br />
del presente lavoro è stato caratterizzare da un punto<br />
<strong>di</strong> vista geo-pedologico le aree <strong>di</strong> produzione della<br />
<strong>patata</strong> precoce oggetto <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o del progetto TI-<br />
PIPAPA. Tale <strong>caratterizzazione</strong> ha avuto lo scopo <strong>di</strong><br />
definire parametri mineralogici e pattern geochimici<br />
identificativi delle aree <strong>di</strong> provenienza dei tuberi. Per<br />
un numero selezionato <strong>di</strong> campioni, tali parametri<br />
sono stati ricercati anche nel suolo che rimane aderente<br />
a tuberi raccolti in campo e a tuberi in fase<br />
<strong>di</strong> commercializzazione per verificare la possibilità <strong>di</strong><br />
rintracciarne la provenienza. La <strong>di</strong>versità geo-pedologica<br />
delle aree <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o considerate ha reso tale<br />
approccio particolarmente interessante, consentendo<br />
<strong>di</strong> definire una firma “geochimico-mineralogica” dei<br />
suoli destinati alla produzione della <strong>patata</strong> precoce.<br />
Materiali e meto<strong>di</strong><br />
Inquadramento geologico e geomorfologico delle aree<br />
<strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o<br />
I punti <strong>di</strong> campionamento georeferenziati sono<br />
stati riportati sulla cartografia <strong>di</strong> Google Earth e per<br />
ciascuna area <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o è stato realizzato un inquadramento<br />
geologico e geomorfologico alla scala <strong>di</strong> se-<br />
mi-dettaglio. A tale fine sono state utilizzate le Carte<br />
Geologiche d’Italia in scala 1:100.000, realizzate dal<br />
Servizio Geologico d’Italia. Le carte sono state consultate<br />
attraverso il sito web dell’ISPRA 6. Le descrizioni<br />
<strong>di</strong> carattere geomorfologico e geologico sono<br />
state elaborate tenendo conto delle Note illustrative<br />
allegate alle carte geologiche e <strong>di</strong> relazioni geologiche<br />
e geomorfologiche redatte per i singoli comuni e<br />
<strong>di</strong>sponibili in rete.<br />
Campionamento e preparazione <strong>di</strong> suolo e tuberi<br />
Campioni <strong>di</strong> suolo <strong>di</strong> superficie (0-30 cm) e <strong>di</strong> tuberi<br />
<strong>di</strong> <strong>patata</strong> sono stati prelevati contemporaneamente<br />
e a fine ciclo produttivo nel periodo maggio-giugno<br />
2009 in corrispondenza <strong>di</strong> 12 siti <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o ubicati in<br />
tipiche aree <strong>di</strong> produzione della <strong>patata</strong> precoce <strong>di</strong> tre<br />
regioni del sud dell’Italia (Tabella I). In ciascun sito, è<br />
stata adottata una strategia <strong>di</strong> campionamento con 3<br />
repliche <strong>di</strong> campo. Campioni <strong>di</strong> tuberi in fase <strong>di</strong> commercializzazione<br />
e provenienti dai siti FG-Manfredonia<br />
(EL-PEcom) e LE-Alliste-Cisternella (SG-PCcom)<br />
sono stati anche inclusi nello stu<strong>di</strong>o.<br />
Campioni <strong>di</strong> suolo aderente alla superficie esterna<br />
dei tuberi sono stati prelevati da campioni selezionati<br />
<strong>di</strong> tuberi presi in campo e in fase <strong>di</strong> commercializzazione,<br />
me<strong>di</strong>ante lavaggio in acqua ultrapura ed essiccamento<br />
in stufa a 40 °C. Tutti i campioni <strong>di</strong> suolo<br />
sono stati essiccati all’aria e setacciati a 2 mm (terra<br />
fine), prima delle determinazioni analitiche.<br />
Determinazioni analitiche<br />
Le analisi chimiche e chimico-fisiche sono state<br />
condotte sulla terra fine, secondo i Meto<strong>di</strong> Ufficiali<br />
<strong>di</strong> Analisi Chimica del Suolo 7: il pH è stato misurato<br />
per via potenziometrica su sospensioni suolo-H2O (rapporto 1:2.5); il carbonio organico con il metodo<br />
Walkley e Black; la conducibilità elettrica (CE) in<br />
estratto acquoso con conduttivimetro a cella <strong>di</strong> misura;<br />
il calcare totale con determinazione gas-volumetrica<br />
della CO2; il fosforo assimilabile con il metodo<br />
Olsen; la capacità <strong>di</strong> scambio cationico (CSC) con<br />
BaCl2 a pH 8.2 e le basi <strong>di</strong> scambio per Spettrometria<br />
ad Assorbimento Atomico (AAS). La <strong>di</strong>stribuzione<br />
granulometrica è stata determinata su campioni<br />
<strong>di</strong>spersi con so<strong>di</strong>o esametafosfato, me<strong>di</strong>ante granulometro<br />
laser, con un sistema Mastersizer 2000 della<br />
Malvern. Le estrazioni selettive <strong>di</strong> Fe, Al e Si con<br />
ossalato d’ammonio acido a pH 3 (Feo, Alo, Sio) e<br />
Na <strong>di</strong>tionito-citrato-bicarbonato (Fed, Ald) sono sta-<br />
52 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
DEFINIZIONE DI UNA FIRMA “GEOCHIMICO-MINERALOGICA” DEI SUOLI DESTINATI ALLA PRODUZIONE DELLA PATATA PRECOCE VINGIANI<br />
Tabella I. — Co<strong>di</strong>ci dei campioni <strong>di</strong> suolo e tuberi raccolti e ubicazione dei siti <strong>di</strong> campionamento.<br />
Co<strong>di</strong>ce* Varietà Regione Provincia Sito <strong>di</strong> campionamento Latitu<strong>di</strong>ne N Longitu<strong>di</strong>ne E<br />
SP-P A1-2-3 Spunta Puglia Lecce (LE) Alliste-Chianchi 39° 56.254 18° 06.344<br />
SG-P C1-2-3 Sieglinde “ “ Alliste-Cisternella 39° 54.655 18° 05.102<br />
EL-P E1-2-3 Elvira “ Foggia (FG) Manfredonia 41° 32.563 15° 53.514<br />
SP-P F1-2-3 Spunta “ Bari (BA) Bitonto 41° 06.641 16° 43.635<br />
SP-P I1-2-3 Spunta “ “ Mola <strong>di</strong> Bari 41° 02.051 17° 07.388<br />
AR-S A1-2-3 Arinda Sicilia Siracusa (SR) Contrada Milocca 37° 01.581 15° 15.862<br />
SP-S B1-2-3 Spunta “ “ Agro <strong>di</strong> Cassibile 36° 58.593 15° 12.270<br />
SP-S C1-2-3 Spunta “ Catania (CT) Acireale 37° 39.885 15° 09.517<br />
AR-S E1-2-3 Arinda “ “ Riposto 37° 41.306 15° 10.957<br />
SG-S F1-2-3 Sieglinde “ Messina (ME) Torregrotta 38° 12.503 15° 20.465<br />
AR-S G1-2-3 Arinda “ “ Monteforte S. Giorgio 38° 12.536 15° 20.290<br />
AGR-C A1-2-3 Agria Campania Napoli (NA) Afragola 40° 55.230 14° 20.370<br />
*co<strong>di</strong>ce: XX-Y-Zn, dove XX=<strong>varietà</strong> (SP: Spunta; SG: Sieglinde; EL: Elvira; AR: Arinda; AGR: Agria), Y: regione (P: Puglia; S: Sicilia; C: Campania), Z: lettera<br />
progressiva <strong>di</strong> identificazione del campione, N.: replica dello stesso campione (1,2,3).<br />
te effettuate secondo i meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> Schwertmann 8 e<br />
Mehra e Jackson 9 rispettivamente, ed i contenuti <strong>di</strong><br />
Fe, Al e Si determinati me<strong>di</strong>ante Spettrofotometria ad<br />
Emissione Atomica, utilizzando un ICP-AES modello<br />
Liberty 150, Varian.<br />
Le indagini mineralogiche sono state condotte sulla<br />
frazione terra fine <strong>di</strong> tutti i suoli prelevati in campo<br />
e su una selezione <strong>di</strong> suoli adesi alle patate, me<strong>di</strong>ante<br />
l’impiego della <strong>di</strong>ffrattometria a raggi-X (XRD). Campioni<br />
non orientati sono stati analizzati con un <strong>di</strong>ffrattometro<br />
RigakuGeigerflex D/Max IIIC, con ra<strong>di</strong>azione<br />
Co-kα ferro-filtrata.<br />
L’analisi geochimica o multielemento, finalizzata ad<br />
accertare la composizione chimica quali-quantitativa<br />
dei suoli, con particolare riferimento al contenuto <strong>di</strong><br />
macro e micronutrienti, è stata effettuata me<strong>di</strong>ante <strong>di</strong>gestione<br />
acida ad alta temperatura (HNO 3:HClO 4:HF<br />
6:3:10) ed analisi degli estratti con ICP-MS. Per l’analisi<br />
delle frazioni bio<strong>di</strong>sponibili degli elementi presenti<br />
nel suolo delle aree <strong>di</strong> campionamento sono stati utilizzati<br />
due meto<strong>di</strong>: 1. estrazione me<strong>di</strong>ante EDTA 0.05<br />
M; 2. estrazione me<strong>di</strong>ante NaNO 3 0.1 M. Le misure<br />
sono state effettuate me<strong>di</strong>ante ICP-MS.<br />
Risultati e <strong>di</strong>scussione<br />
Inquadramento geologico e geomorfologico delle aree<br />
<strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o<br />
I risultati sono riportati in forma sintetica in Tabella<br />
II. Le aree <strong>di</strong> campionamento sono caratterizzate da<br />
un’ampia variabilità geologica, sia in termini <strong>di</strong> lito-<br />
tipo sia <strong>di</strong> età del substrato roccioso sul quale si rinvengono<br />
i suoli. Si fa riferimento al substrato roccioso<br />
poiché la sua determinazione è agevole attraverso le<br />
carte geologiche. È importante considerare, però, che<br />
le rocce rinvenute al <strong>di</strong> sotto <strong>di</strong> un suolo non sempre<br />
costituiscono la “roccia madre” dalla cui alterazione<br />
si forma il suolo e che a questo conferisce proprietà<br />
chimiche e fisiche. I suoli possono formarsi anche<br />
da depositi eolici, non riportati in carta geologica e<br />
nemmeno osservabili in campo. In ogni caso, l’in<strong>di</strong>cazione<br />
della carta geologica rappresenta il punto<br />
<strong>di</strong> partenza per l’identificazione della roccia madre<br />
del suolo, sebbene non costituisca una informazione<br />
certa.<br />
Dallo stu<strong>di</strong>o della cartografia geologica nazionale<br />
è stato osservato che, per quanto riguarda la regione<br />
Puglia, i substrati rocciosi possono essere ricondotti<br />
a 3 tipologie principali: 1) calcari detritici stratificati e<br />
calcari dolomitici del Cretacico (Terziario); 2) calcari<br />
grossolani e sabbioni calcarei Plio-Pleistocenici (Quaternario);<br />
e 3) alluvioni per colmata e cordoni litorali.<br />
Dal punto <strong>di</strong> vista geomorfologico, invece, i siti si<br />
<strong>di</strong>fferenziano sensibilmente. Alliste ha una morfologia<br />
simile a quella <strong>di</strong> tutta la penisola salentina, molto<br />
dolce e caratterizzata dalla presenza delle serre. Si<br />
tratta <strong>di</strong> modesti rilievi allungati in <strong>di</strong>rezione NNO-<br />
SSE o NO-SE che, unitamente alle aree depresse, rispecchiano<br />
le con<strong>di</strong>zioni strutturali della zona. Manfredonia<br />
si colloca in una pianura costiera all’interno<br />
del golfo omonimo. I se<strong>di</strong>menti fluviali nell’area<br />
costiera sono soggetti a rielaborazione da parte del<br />
moto ondoso, che produce cordoni litorali. Alcune<br />
<strong>di</strong> queste aree, a partire dal 1900, sono state soggette<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 53
VINGIANI DEFINIZIONE DI UNA FIRMA “GEOCHIMICO-MINERALOGICA” DEI SUOLI DESTINATI ALLA PRODUZIONE DELLA PATATA PRECOCE<br />
Tabella II. — Inquadramento sintetico della geologia delle aree <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o.<br />
Regione Comune Località<br />
Formazione<br />
geologica<br />
Puglia Lecce Alliste-Chianchi Calcareniti del<br />
Salento (coeve ai<br />
Tufi delle Murge)<br />
Lecce Alliste-Cisternella Calcari <strong>di</strong> Melissano<br />
(coeve ai Calcari <strong>di</strong><br />
Mola)<br />
a bonifiche. Bitonto si colloca nell’area morfologicostrutturale<br />
del rilievo murgiano (altopiano murgiano).<br />
Tale “rilievo mostra, anche localmente, il suo tipico<br />
aspetto <strong>di</strong> tavolato a vasti ripiani, allungati parallelamente<br />
alla linea <strong>di</strong> costa” 10. Nell’altopiano, le rocce<br />
carbonatiche sono caratterizzate da una successione<br />
ininterrotta <strong>di</strong> bacini endoreici, vallette carsiche, doline<br />
e inghiottitoi 11. In tali depressioni topografiche il<br />
deposito dell’eluvium sul fondo delle doline occlude,<br />
più o meno totalmente, gli inghiottitoi e i condotti<br />
carsici. Altro aspetto caratteristico del territorio è la<br />
<strong>di</strong>ffusa presenza della “terra rossa”, un suolo molto<br />
comune in Puglia e prevalentemente nella parte sudorientale<br />
delle Murge. Mola <strong>di</strong> Bari è al limite tra la<br />
scarpata murgiana e l’area dei terrazzi marini della<br />
fascia costiera. I tratti caratteristici della fascia costiera<br />
sono dati dai terrazzi <strong>di</strong> origine marina, leggermente<br />
degradanti verso il mare, e dai torrenti (lame) che li<br />
incidono, tutti a corso brevissimo, paralleli tra loro e<br />
perpen<strong>di</strong>colari alla linea <strong>di</strong> costa.<br />
Per la Sicilia si <strong>di</strong>stinguono quattro tipi litologici:<br />
1) le biocalcareniti pleistoceniche della Sicilia sud-<br />
orientale; 2) le lave; 3) le alluvioni vulcaniche del<br />
monte Etna; e 4) i depositi alluvionali e fluviali della<br />
Sicilia settentrionale. Dal punto <strong>di</strong> vista geomorfologico,<br />
anche i siti siciliani sono molto <strong>di</strong>versi. I siti<br />
<strong>di</strong> Siracusa si collocano sul margine orientale <strong>di</strong> un<br />
altopiano prevalentemente calcareo, che a partire da<br />
quota 1000 m s.l.m degrada gradualmente verso sud<br />
e verso est, fino al livello del mare. Acireale e Riposto<br />
si trovano sul versante sud-orientale del monte<br />
Etna, mentre Torregrotta e Monteforte S. Giorgio occupano<br />
zone <strong>di</strong> pianura soggette alla deposizione<br />
<strong>di</strong> se<strong>di</strong>menti alluvionali provenienti dalla Fiumara <strong>di</strong><br />
Niceto, che sfocia nell’area costiera della Sicilia settentrionale.<br />
In Campania, il sito <strong>di</strong> Afragola ha come substrato<br />
i depositi vulcanici, prevalentemente piroclastici, <strong>di</strong><br />
origine flegrea e vesuviana. Infatti, la zona occupa<br />
la porzione centrale della Piana Campana, un graben<br />
peritirrenico al margine occidentale della catena<br />
appenninica. In<strong>di</strong>viduatasi a partire dal Pliocene superiore,<br />
è stata coinvolta in processi <strong>di</strong> subsidenza a<br />
partire dal Quaternario. La Piana è colmata da oltre<br />
54 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012<br />
Litotipi*<br />
calcareniti, calcari grossolani tipo “panchina”,<br />
sabbioni calcarei più o meno cementati,<br />
talora argillosi (“tufi”)<br />
calcari compatti, a frattura irregolare, grigi e<br />
nocciola, con intercalati calcari dolomitici e,<br />
più raramente, dolomie calcaree vacuolari<br />
Età delle rocce del<br />
substrato<br />
Plio- Pleistocene<br />
(Quaternario)<br />
Cretacico (Terziario)<br />
Foggia Manfredonia alluvioni per colmata; cordoni litorali Depositi recenti<br />
Bari Bitonto Calcare <strong>di</strong> Bari Calcari detritici in strati e banchi; calcari<br />
dolomitici; calcari massicci<br />
Cretacico (Terziario)<br />
Bari Mola <strong>di</strong> Bari Calcare <strong>di</strong> Bari/Tufi Calcari detritici in strati e banchi; calcari Cretacico (Terziario)<br />
delle Murge dolomitici; calcari massicci; depositi calcareo- Plio-Pleistocene<br />
arenacei e calcareo-arenaceo-argillosi più<br />
o meno cementati, con frequenti livelli<br />
fossiliferi<br />
(Quaternario)<br />
Sicilia Siracusa Agro <strong>di</strong> Cassibile e<br />
biocalcareniti tenere giallastre che passano Pleistocene<br />
Contrada Milocca<br />
verso l’alto e lateralmente ad argille grigioazzurre<br />
Catania Acireale lave XIV secolo<br />
Catania Riposto alluvioni, sabbie e ghiaie <strong>di</strong> natura vulcanica<br />
e argille fluviali<br />
Pleistocene<br />
Messina Monforte S. Giorgio,<br />
alluvioni, ghiaie e sabbie marine; sabbie, Depositi recenti<br />
Torregrotta<br />
ghiaie ed argille fluviali<br />
Campania Napoli Afragola depositi vulcanici: ceneri e pomici da caduta;<br />
tufi<br />
Depositi recenti<br />
* descrizione della Carta Geologica d’Italia in scala 1:100.000.
DEFINIZIONE DI UNA FIRMA “GEOCHIMICO-MINERALOGICA” DEI SUOLI DESTINATI ALLA PRODUZIONE DELLA PATATA PRECOCE VINGIANI<br />
4000 m <strong>di</strong> depositi clastici <strong>di</strong> ambiente marino, transizionale<br />
ed alluvionale, vulcaniti e piroclastici.<br />
La <strong>di</strong>versità <strong>di</strong> substrati, riscontrata anche per siti<br />
<strong>di</strong> campionamento ubicati all’interno dello stesso<br />
comune, può costituire un elemento importante, <strong>di</strong><br />
supporto alle indagini analitiche, per la definizione<br />
della firma “geochimico-mineralogica” dei suoli destinati<br />
alla produzione <strong>di</strong> patate <strong>di</strong> cui si vuole accertare<br />
la provenienza.<br />
Caratterizzazione fisica e chimica del suolo<br />
Dalla combinazione delle <strong>di</strong>verse percentuali <strong>di</strong><br />
sabbia, limo e argilla risulta che tutti i suoli stu<strong>di</strong>ati,<br />
in accordo con le esigenze colturali della <strong>patata</strong>, sono<br />
caratterizzati da una tessitura loam (franco sabbiosa,<br />
franca e franco limosa) con la sola eccezione dei suoli<br />
della fascia retrodunale <strong>di</strong> Manfredonia, prevalentemente<br />
sabbiosi (Figura 1).<br />
La determinazione granulometrica, effettuata me<strong>di</strong>ante<br />
la tecnica della <strong>di</strong>ffrattometria laser, evidenzia<br />
<strong>di</strong>fferenze tra la “particle-size <strong>di</strong>stribution” del suolo<br />
adeso ai tuberi rispetto al suolo tal quale (Figura 2)<br />
con una più elevata percentuale <strong>di</strong> particelle delle <strong>di</strong>mensioni<br />
dell’argilla, del limo e della sabbia fine nel<br />
primo rispetto al secondo. Ciononostante, le curve<br />
granulometriche hanno un andamento simile, come<br />
Figura 1. — Tessitura dei suoli stu<strong>di</strong>ati.<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
0.01 0.1 1 10 100 1000 3000<br />
Figura 2. — Curve granulometriche del suolo del sito <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o <strong>di</strong><br />
Manfredonia (FG), del suolo adeso ai tuberi prelevati in campo e ai<br />
tuberi in fase <strong>di</strong> commercializzazione provenienti dallo stesso sito.<br />
descritto da parametri statistici quali la moda primaria<br />
e la me<strong>di</strong>ana.<br />
Le principali proprietà chimiche dei suoli stu<strong>di</strong>ati<br />
sono riportate in Tabella III. Sulla base del valore <strong>di</strong><br />
pH i suoli possono essere classificati in: molto acido<br />
(pH50 g kg -1) solo i suoli pugliesi<br />
<strong>di</strong> Manfredonia ed il suolo siciliano Agro <strong>di</strong> Cassibile.<br />
Tutti i suoli pugliesi ed i suoli siciliani campionati in<br />
provincia <strong>di</strong> Messina sono poveri o molto poveri <strong>di</strong><br />
C organico (CO
VINGIANI DEFINIZIONE DI UNA FIRMA “GEOCHIMICO-MINERALOGICA” DEI SUOLI DESTINATI ALLA PRODUZIONE DELLA PATATA PRECOCE<br />
Tabella III. — Principali proprietà chimiche dei suoli. Valori me<strong>di</strong> riferiti al peso secco in stufa (105 °C) e in corsivo dev. standard<br />
(N.=3).<br />
è la percentuale <strong>di</strong> so<strong>di</strong>o <strong>di</strong> scambio (ESP=32%) dei<br />
suoli della fascia retrodunale <strong>di</strong> Manfredonia. Elevato<br />
è il contenuto <strong>di</strong> K scambiabile dei suoli campani <strong>di</strong><br />
Afragola.<br />
Caratterizzazione mineralogica<br />
In Tabella IV viene riportata in maniera sintetica<br />
la composizione mineralogica dei suoli analizzati. In<br />
tutti i suoli della regione Puglia, l’an<strong>di</strong>cità (espressa<br />
Puglia Sicilia Campania<br />
SP-P A SG-P C EL-P E SP-PF SP-PI AR-S A SP-S B SP-S C AR-S E SG-S F AR-S G Agr-C A<br />
pH H 2O 7,3 4,5 8,8 8,3 6,9 7,2 8,1 4,9 5,2 7,7 6,3 6,5<br />
0,2 0,2 0,1 0,1 0,7 0,3 0,2 0,1 0,7 0,1 0,8 0,2<br />
CE dS m -1 0,24 0,77 0,34 0,18 0,14 0,37 0,26 0,47 0,54 0,22 0,28 0,10<br />
0,05 0,05 0,07 0,02 0,04 0,04 0,18 0,08 0,21 0,05 0,09 0,01<br />
Calcare totale g kg -1 9 assente 228 16 6 13 276 assente assente 15 assente assente<br />
0,1 6,6 2,6 2,5 4,5 47,3 1,2<br />
C.O. g kg -1 9,2 7,6 5,3 10,4 10,6 13,5 17,8 12,6 23,3 5,9 9,3 15,6<br />
1,7 0,9 1,4 0,8 2,1 0,7 1,2 0,9 5,1 0,3 0,9 0,3<br />
CSC cmol (+)kg -1 23,4 20,8 4,9 36,4 27,7 51,5 43,2 14,5 17,0 9,3 12,1 21,3<br />
0,7 0,4 0,2 2,4 1,6 1,9 2,8 1,0 3,3 1,2 1,0 1,6<br />
Ca-scamb. “ 24,0 3,7 1,3* 41,5 21,9 62,6 33,1* 5,2 6,9 9,8 12,2 16,0<br />
2,4 1,6 0,6 1,0 5,3 6,0 2,6 0,8 7,5 0,9 4,4 2,31<br />
Mg-scamb. “ 4,1 3,1 1,2 11,9 5,8 7,9 7,9 1,3 2,2 0,5 1,5 1,7<br />
0,3 0,5 0,3 0,6 0,7 0,4 1,3 0,3 2,3 0,1 0,5 0,2<br />
Na-scamb. “ 1,2 2,4 1,6 1,4 0,6 2,4 0,8 0,6 0,8 0,6 0,7 1,1<br />
0,07 0,13 0,14 0,04 0,04 0,16 0,07 0,04 0,13 0,05 0,01 0,06<br />
K-scamb. “ 1,8 2,4 0,8 1,1 1,8 1,6 1,3 0,9 1,6 0,9 1,6 2,7<br />
0,20 0,09 0,37 0,06 0,05 0,33 0,79 0,14 0,78 0,23 0,09 0,04<br />
P-Olsen mg kg -1 199 510 146 226 318 231 98 220 188 65 156 244<br />
30,4 46,0 42,3 26,6 54,8 25,3 28,6 24,9 25,9 3,8 12,2 25,3<br />
*calcolato per <strong>di</strong>fferenza tra la CSC e la somma degli ioni so<strong>di</strong>o, potassio e magnesio.<br />
Tabella IV. — Composizione mineralogica dei suoli stu<strong>di</strong>ati.<br />
Co<strong>di</strong>ce Regione Siti Argille Quarzo Feldspati Calcite Leucite Pirosseni<br />
SP-P A Puglia Alliste-Chianchi (LE) X XXX<br />
SG-P C “ Alliste-Cisternella (LE) X XXX X<br />
EL-P E “ Manfredonia (FG) XX XXX XX XX<br />
SP-P F “ Bitonto (BA) X XXX X X<br />
SP-P I “ Mola <strong>di</strong> Bari (BA) X XXX X<br />
AR-S A Sicilia Contrada Milocca (SR) X XXX X X<br />
SP-S B “ Agro <strong>di</strong> Cassibile (SR) X XXX X XXX<br />
SP-S C “ Acireale (CT) X XXX<br />
AR-S E “ Riposto (CT) XXX<br />
SG-S F “ Torregrotta (ME) XX XXX XX<br />
AR-S G “ Monforte S. Giorgio (ME) XX XXX XX<br />
AGR-C A Campania Afragola (NA) XXX XX X<br />
XXX, XX, X=quantità relativa decrescente<br />
attraverso il valore % Al o+0,5Fe o) è sempre inferiore<br />
allo 0,4%, che costituisce il valore soglia al <strong>di</strong> sotto<br />
del quale i suoli non hanno né proprietà an<strong>di</strong>che (%<br />
Al o+0,5Fe o> 2), né vitriche (% Al o+0,5Fe o tra 0,4 e 2)<br />
12, e <strong>di</strong> conseguenza non sono <strong>di</strong> origine vulcanica.<br />
Dall’activity ratio (Feo/Fed=0,1) si evince che le forme<br />
del ferro prevalenti in questi suoli sono quelle<br />
degli ossi<strong>di</strong> cristallini, in coerenza con il colore rosso<br />
<strong>di</strong> questi suoli. Per quanto riguarda la composizione<br />
mineralogica ottenuta dall’XRD, il quarzo è il mine-<br />
56 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
DEFINIZIONE DI UNA FIRMA “GEOCHIMICO-MINERALOGICA” DEI SUOLI DESTINATI ALLA PRODUZIONE DELLA PATATA PRECOCE VINGIANI<br />
rale dominante in tutti i suoli della Puglia, mentre<br />
secondaria è la presenza dei minerali argillosi. Anche<br />
i feldspati sono tra i minerali presenti, ad eccezione<br />
del sito <strong>di</strong> Alliste-Chianchi, e la calcite viene identificata<br />
solo a Manfredonia e Bitonto. Considerato<br />
che sia il quarzo che i feldspati non sono componenti<br />
delle rocce prevalentemente carbonatiche del<br />
substrato, è possibile ipotizzare che la pedogenesi <strong>di</strong><br />
questi suoli sia stata influenzata da materiali eolici.<br />
Per quanto riguarda i suoli della Sicilia, quelli <strong>di</strong> Torregrotta<br />
e Monteforte S. Giorgio non risultano né an<strong>di</strong>ci,<br />
né vitrici (% Al o+0,5Fe o
VINGIANI DEFINIZIONE DI UNA FIRMA “GEOCHIMICO-MINERALOGICA” DEI SUOLI DESTINATI ALLA PRODUZIONE DELLA PATATA PRECOCE<br />
Distanze legami<br />
1800<br />
1600<br />
1400<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
Capaccio<br />
Monforte m.<br />
Dendogramma per 44 casi<br />
Legame completo<br />
Distanze Euclidee<br />
Siracusa<br />
Manfredonia<br />
Acireale e<br />
S. Venerina<br />
Figura 4. — Dendrogramma <strong>di</strong> cluster analysis (A) e <strong>di</strong>agramma <strong>di</strong> or<strong>di</strong>namento PCA (B) dei suoli campionati<br />
nibili estratte con i due meto<strong>di</strong> risultano correlate<br />
tra loro solo nel caso del Li (P
DEFINIZIONE DI UNA FIRMA “GEOCHIMICO-MINERALOGICA” DEI SUOLI DESTINATI ALLA PRODUZIONE DELLA PATATA PRECOCE VINGIANI<br />
Distanze legami<br />
Distanze legami<br />
2,5e7<br />
2e7<br />
1,5e7<br />
1e7<br />
5e6<br />
0<br />
2e6<br />
1,5e6<br />
1e6<br />
5e5<br />
0<br />
Siracusa<br />
Acireale e<br />
S. Venerina<br />
Capaccio<br />
Manfredonia<br />
Dendogramma per 39 casi<br />
Legame completo<br />
Distanze Euclidee<br />
Acireale e<br />
S. Venerina<br />
Dendogramma per 39 casi<br />
Legame completo<br />
Distanze Euclidee<br />
Manfredonia<br />
Siracusa<br />
Figura 5. — Dendrogramma <strong>di</strong> cluster analysis e <strong>di</strong>agramma <strong>di</strong> or<strong>di</strong>namento PCA della frazione estratta dai suoli me<strong>di</strong>ante EDTA (A, B) e<br />
NaNO 3 (C, D).<br />
alla <strong>patata</strong>” può costituire un marchio <strong>di</strong> origine dei<br />
tuberi. Ciò consentirà <strong>di</strong> in<strong>di</strong>viduare ed evitare fro<strong>di</strong><br />
<strong>di</strong> commercializzazione <strong>di</strong> tuberi provenienti da aree<br />
<strong>di</strong>verse da quelle <strong>di</strong>chiarate.<br />
Bibliografia<br />
1. John MD. Recent developments in food authentication. Analyst<br />
1998;123:151R-6R.<br />
2. Cosio MS, Ballabio D, Benedetti S, Gigliotti C. Evaluation of <strong>di</strong>ffer-<br />
Projection of the cases on the factor-plane (1 x 2)<br />
Cases with sum of cosine square ≥ 0.00<br />
ent storage con<strong>di</strong>tions of extra virgin olive oils with a innovative<br />
recognition tool built by means of electronic nose and electronic<br />
tongue. Food Chemistry 2007;101:485-91.<br />
3. Longobar<strong>di</strong> F, Casiello G, Sacco D, Tedone L, Sacco A. Characterisation<br />
of the geographical origin of Italian potatoes, based on<br />
stable isotope and volatile compound analyses. Food Chemistry<br />
2010;124:1708-13.<br />
4. Swoboda S, Brunner M, Boulyga SF, Galler P, Horacek M, Prohaska<br />
T. Identification of Marchfeld asparagus using Sr isotope ratio<br />
measurements by MC-ICP-MS. Anal BioanalChem 2008;390:487-94.<br />
5. Camin F, Larcher R, Nicolini G, Bontempo L, Bertol<strong>di</strong> D, Perini<br />
M et al. Isotopic and elemental data for tracing the origin of European<br />
olive oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry<br />
2010;58:570-7.<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 59<br />
Factor 2: 12.43%<br />
Factor 2: 14,17%<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
-2<br />
-4<br />
-6<br />
Active<br />
-8<br />
-12 14 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14<br />
Factor 1: 49.84%<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
-2<br />
-4<br />
-6<br />
-8<br />
Projection of the cases on the factor-plane (1 x 2)<br />
Cases with sum of cosine square ≥ 0.00<br />
Active<br />
-10<br />
-10 -5 0 5 15 20 25
VINGIANI DEFINIZIONE DI UNA FIRMA “GEOCHIMICO-MINERALOGICA” DEI SUOLI DESTINATI ALLA PRODUZIONE DELLA PATATA PRECOCE<br />
6. ISPRA: Carta Geologica d’Italia alla scala 1:100.000.© 2010 ISPRA.<br />
Available from: http://www.apat.gov.it/me<strong>di</strong>a/carta_geologica_<br />
italia/cartageologica.htm<br />
7. MIPAF (Ministero delle Politiche Agricole e Forestali). Meto<strong>di</strong><br />
<strong>di</strong> Analisi Chimica del Suolo. Collana <strong>di</strong> meto<strong>di</strong> analitici per<br />
l’agricoltura. Roma: Franco Angeli; 2000.<br />
8. Schwertmann U. Differenzierung der Eisenoxide des Bodens<br />
durch photochemische Extraktion mit sauerAmmoniumoxalate-<br />
Losung. Zeitschrift fur Pflanzenernahrung und Bodenkunde<br />
1964;105:194-202.<br />
9. Mehra OP, Jackson ML. Iron oxide removal from soils and clays<br />
by a <strong>di</strong>thionite-citrate system buffered with so<strong>di</strong>um bicarbonate.<br />
Clays Clay Miner 1960;7:317-27.<br />
10. Azzaroli A, Valduga A. Note Illustrative della Carta Geologica<br />
d’Italia alla scala 1:100.000,Foglio 177 e Foglio 178, Bari e Mola <strong>di</strong><br />
Bari. Roma: Serv. Geol. d’Italia; 1967. p. 26.<br />
11. Cherubini C, Spizzico V. Peculiari aspetti carsici del territorio <strong>di</strong><br />
Conversano in relazione agliattuali mutamenti climatici e socioeconomici.<br />
Giornale <strong>di</strong> Geologia Applicata 2008;8:129-35.<br />
12. WRB. World Reference Base for soil resources. A framework for<br />
international classification, correlation and communication. IUSS,<br />
ISRIC, FAO; 2006.<br />
13. Parfitt RL. Allophane in New Zealand — A review. Aust J Soil Res<br />
1990;28:343-60.<br />
14. Parfitt RL, Wilson AD. Estimation of allophane and halloysite in<br />
three sequences of volcanic soils, New Zealand. In: Fernandez<br />
Caldas E, Yaalon DH, e<strong>di</strong>tors. Volcanic soils: Weathering and landscape<br />
relationships of soils on tephra and basalt. CatenaSuppl. 7.<br />
Cremlingen, Germany: Catena Verlag; 1985. p. 1-8.<br />
Ringraziamenti.—Si ringraziano il MIPAF per avere finanziato il lavoro<br />
<strong>di</strong> ricerca e tutte le aziende agricole che hanno collaborato alla realizzazione<br />
del lavoro rendendo possibili i campionamenti e fornendo<br />
tutte le informazioni necessarie circa le pratiche colturali.<br />
60 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):61-9<br />
Indagine sullo stato fitosanitario<br />
delle produzioni <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>precoci</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong> da consumo<br />
Dall’anno 2008 al 2010 è stata eseguita un’indagine<br />
per valutare lo stato fitosanitario <strong>di</strong> produzioni <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
precoce prelevati nell’Italia meri<strong>di</strong>onale e in Sicilia. I<br />
patogeni ricercati sono stati: Ralstonia solanacearum,<br />
Potato Spindle Tuber Viroid, i virus Y, X, V della <strong>patata</strong><br />
e il Potato Leafroll Virus (PLRV). Le analisi batteriologiche<br />
sono state eseguite me<strong>di</strong>ante isolamento su substrato<br />
semi-selettivo mentre la ricerca del PSTVd è stata<br />
effettuata per ibridazione su membrana con l’uso <strong>di</strong><br />
un kit commerciale. In generale, le analisi virologiche<br />
sono state eseguite me<strong>di</strong>ante DAS-ELISA. Per il virus Y<br />
è stata eseguita anche la <strong>caratterizzazione</strong> in varianti<br />
genetiche con meto<strong>di</strong> immunologici (TAS-ELISA) e molecolari<br />
(RT-PCR e analisi filogenetica). In nessuno dei<br />
campioni analizzati sono stati riscontrati R. solanacearum,<br />
PSTVd e PVV; la frequenza <strong>di</strong> rilevamento <strong>di</strong> PVX<br />
e PLRV è stata molto bassa. Il patogeno maggiormente<br />
presente è risultato essere il PVY e, in particolare, le<br />
sue varianti NTN e Wilga. Il protocollo <strong>di</strong> RT-PCR impiegato<br />
si è mostrato il metodo più preciso per la <strong>di</strong>fferenziazione<br />
in varianti e il suo utilizzo per le analisi<br />
<strong>di</strong>agnostiche connesse alla certificazione dei tuberi-seme<br />
sarebbe auspicabile. L’analisi filogenetica della regione<br />
genica VPG-NIa degli isolati <strong>di</strong> PVY ha permesso<br />
la <strong>di</strong>fferenziazione in due cluster che raggruppano gli<br />
isolati NTN e Wilga.<br />
Parole chiave: Virus - Agricoltura - Pianta, malattia.<br />
Le malattie che influenzano le produzioni <strong>di</strong> <strong>patata</strong>,<br />
sia da seme che da consumo, sono <strong>di</strong>verse: <strong>di</strong> origine<br />
abiotica e biotica. Tra le malattie <strong>di</strong> origine batterica,<br />
una delle più preoccupanti nei paesi a clima<br />
caldo-piovoso è l’avvizzimento batterico causato da<br />
Autore <strong>di</strong> contatto: L. Sigillo, INRAN, Istituto Nazionale <strong>di</strong> Ricerca per<br />
gli Alimenti e la Nutrizione, Sezione <strong>di</strong> Battipaglia, SS 18, Km 77,700,<br />
84091, Battipaglia (SA). E-mail: l.sigillo@ense.it<br />
L. SIGILLO, G. SERRATORE, V. SPINA, V. SENAPE, R. BRAVI<br />
INRAN, Istituto Nazionale <strong>di</strong> Ricerca<br />
per gli Alimenti e la Nutrizione<br />
Sezione <strong>di</strong> Battipaglia, Battipaglia, Salerno, Italia<br />
Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. 1995<br />
biovar 2 razza 3. I sintomi dovuti all’infezione causata<br />
da questo batterio si presentano sia sul tubero<br />
che sulla parte aerea. Il tubero mostra, in sezione, un<br />
imbrunimento dell’anello vascolare e, in corrispondenza<br />
delle zone alterate, si osserva la produzione<br />
<strong>di</strong> un essudato cremoso. Sulla parte aerea, si verifica<br />
un ingiallimento iniziale delle foglie basali seguito da<br />
un avvizzimento generalizzato dell’intera pianta 1. R.<br />
solanaceraum è incluso dall’EPPO (European Plant<br />
Protection Organization) nella lista A2 2 dei patogeni<br />
da quarantena, ne è vietata l’introduzione e la <strong>di</strong>ffusione<br />
su territorio italiano e rientra tra i microrganismi<br />
a “tolleranza zero” 3. Altro importante patogeno<br />
da quarantena è il viroide Potato Spindel Tuber Viroid<br />
3, agente dell’affusolamento del tubero <strong>di</strong> <strong>patata</strong>,<br />
anch’esso compreso nella lista A2 dell’EPPO 4. Il sintomo<br />
principale dell’affusolamento è rappresentato<br />
da una deformazione dei tuberi che si presentano<br />
allungati e talvolta con screpolature esterne. Le parti<br />
epigee della pianta presentano, invece, sintomi piuttosto<br />
leggeri: il fogliame assume un comportamento<br />
molto eretto e una tonalità scura 1.<br />
Particolarmente importanti per la qualità dei tuberi<br />
sono le malattie ad eziologia virale soprattutto per le<br />
problematiche correlate alla sanità del materiale <strong>di</strong><br />
moltiplicazione. Numerosissimi sono i virus che colpiscono<br />
la <strong>patata</strong> ma quelli più frequenti e dannosi<br />
sono il Potato virus X (PVX), il Potato leafroll virus<br />
(PLRV) e il Potato virus Y (PVY).<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 61
SIGILLO INdAGINE SuLLO STATO fITOSANITARIO dELLE PROduzIONI dI VARIETà PRECOCI dI PATATA dA CONSuMO<br />
Il PVX è il responsabile del mosaico leggero della<br />
<strong>patata</strong>, è facilmente trasmissibile (prevalentemente<br />
per contatto) e causa sintomi la cui severità varia<br />
in base alla cultivar colpita. La sintomatologia comprende<br />
un mosaico internervale più o meno accentuato,<br />
la riduzione delle <strong>di</strong>mensioni fogliari e l’increspatura<br />
dei margini del lembo fino alla necrosi<br />
dei tessuti; in alcuni casi il virus si può presentare in<br />
forma latente 1.<br />
Il PLRV è l’agente dell’accartocciamento fogliare<br />
della <strong>patata</strong>. Le piante infette presentano clorosi<br />
<strong>di</strong>ffusa sulle foglie apicali che si ripiegano a doccia<br />
verso l’alto, inoltre i tessuti fogliari si ispessiscono assumendo<br />
consistenza vetrosa. L’evidenza dei sintomi<br />
è fortemente con<strong>di</strong>zionata dalla <strong>varietà</strong> e dall’epoca<br />
<strong>di</strong> infezione 1.<br />
Il virus più <strong>di</strong>ffuso su <strong>patata</strong> è universalmente il<br />
Potato virus Y (PVY), capostipite della famiglia dei<br />
Potyvirus 5. Sia in America che in Europa la sua presenza<br />
viene monitorata nei programmi <strong>di</strong> certificazione<br />
della <strong>patata</strong> da seme e le normative sementiere<br />
prevedono, per la commercializzazione, la presenza<br />
dell’organismo solo entro determinate soglie <strong>di</strong> tolleranza<br />
5.<br />
Il PVY è agente del mosaico nervale della <strong>patata</strong>.<br />
La malattia si manifesta comunemente come una<br />
clorosi maculata del lembo fogliare che assume un<br />
aspetto ruvido-rugoso. Le nervature vanno incontro a<br />
processi necrotici talvolta seguiti anche da necrosi del<br />
picciolo e dello stelo 1.<br />
Il virus Y è <strong>di</strong>stinto in tre tipologie principali: il<br />
PVY O, PVY N e PVY C, caratterizzate dalla <strong>di</strong>versa sintomatologia<br />
che inducono in Nicotiana tabacum 5.<br />
Il primo ad essere stato descritto e ritrovato in tutto<br />
il mondo è stato il PVY O (ceppo comune) ma successivamente,<br />
prima in Europa e poi negli altri continenti,<br />
è stato rilevato un nuovo gruppo: il PVY N<br />
(ceppo necrotico) 6, 7. All’interno del gruppo PVY N<br />
sono stati successivamente identificati ulteriori ceppi,<br />
originati dalla ricombinazione genetica del PVY O<br />
con il PVY N. La loro classificazione è in continua evoluzione<br />
e <strong>di</strong>versi autori si sono occupati della loro<br />
patogenesi 5. Nel nostro lavoro, faremo riferimento<br />
alla classificazione utilizzata da Lorenzen 8 che riconosce,<br />
oltre ai due gruppi principali (PVY N e PVY O), i<br />
sottogruppi PVY N:O (Wilga-type) 9-11, PVY NTN (agente<br />
della maculatura ad anelli dei tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong>) 12, NA-<br />
PVY N e NA-PVY NTN (isolati nordamericani del PVY N<br />
e PVY NTN) 13. Questa classificazione è basata sulle sequenze<br />
nucleoti<strong>di</strong>che e sui punti <strong>di</strong> ricombinazione<br />
del genoma 11. Nel caso del PVY NTN sembrerebbe che<br />
una ricombinazione a livello della coat protein 14 sia<br />
responsabile della capacità <strong>di</strong> tali ceppi <strong>di</strong> determinare<br />
la maculatura necrotica; ulteriori stu<strong>di</strong> <strong>di</strong>mostrano<br />
però che non tutti i ceppi NTN presentano tale ricombinazione<br />
15.<br />
<strong>di</strong>versa è la classificazione del PVY basata sul<br />
comportamento sierologico. Me<strong>di</strong>ante l’uso <strong>di</strong> antisieri<br />
monoclonali, infatti, è possibile riconoscere solo<br />
i tre sierotipi: PVYO, PVYN e PVYC 16. In base alla<br />
reazione sierologica, i ceppi Wilga (PVYN:O), inoltre,<br />
vengono riconosciuti come sierotipi O anche se si<br />
comportano in vivo come ceppi necrotici e gli isolati<br />
NTN non vengono <strong>di</strong>stinti dagli N<br />
62 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012<br />
17, 18.<br />
un altro importante potyvirus che infetta la <strong>patata</strong> è<br />
il Potato virus V (PVV). Alcuni isolati europei <strong>di</strong> PVV<br />
erano originariamente considerati varianti <strong>di</strong> isolati<br />
<strong>di</strong> PVY C poiché causavano sintomi necrotici nelle <strong>varietà</strong><br />
contenenti il gene Nc, gene responsabile della<br />
risposta <strong>di</strong> ipersensibilità <strong>di</strong> isolati <strong>di</strong> PVY C in <strong>patata</strong>.<br />
Successivamente fu verificata la presenza, in queste<br />
stesse cultivar, del gene Nv, responsabile <strong>di</strong> una reazione<br />
<strong>di</strong> ipersensibilità specifica nei confronti degli<br />
isolati <strong>di</strong> PVV. Il PVY C e il PVV sono inoltre sierologicamente<br />
<strong>di</strong>stinguibili 19.<br />
In questo lavoro vengono presentati i risultati <strong>di</strong><br />
un’indagine eseguita dall’anno 2008 all’anno 2010<br />
al fine <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>are lo stato fitosanitario <strong>di</strong> tuberi <strong>di</strong><br />
<strong>patata</strong> precoce da consumo prodotti nel Sud Italia.<br />
La ricerca è stata condotta nell’ambito del progetto<br />
“Tipicizzazione e <strong>caratterizzazione</strong> <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> <strong>precoci</strong><br />
<strong>di</strong> <strong>patata</strong> con l’impiego <strong>di</strong> tecniche molecolari e spettroscopiche”<br />
finanziato dal Ministero delle Politiche<br />
Agricole, Alimentari e forestali.<br />
Oggetto dello screening è stata la ricerca <strong>di</strong> R. solanacearum<br />
e PSTVd. Oltre a questi due patogeni<br />
da quarantena, sono stati ricercati i più importanti<br />
patogeni <strong>di</strong> qualità presenti su territorio nazionale,<br />
de<strong>di</strong>cando particolare interesse ai virus trasmissibili<br />
per tubero-seme: virus X, V e Y della <strong>patata</strong> e il virus<br />
dell’accartocciamento fogliare (PLRV) 5.<br />
Nel caso del virus Y, inoltre, è stato eseguito uno<br />
stu<strong>di</strong>o filogenetico delle varianti genetiche al fine <strong>di</strong><br />
ricercare anche una eventuale correlazione tra sequenze<br />
nucleoti<strong>di</strong>che e l’origine geografica degli isolati.<br />
Materiali e meto<strong>di</strong><br />
Le analisi sono state eseguite in tre anni successivi,<br />
dal 2008 al 2010, su un totale <strong>di</strong> 119 campioni <strong>di</strong>
INdAGINE SuLLO STATO fITOSANITARIO dELLE PROduzIONI dI VARIETà PRECOCI dI PATATA dA CONSuMO SIGILLO<br />
tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong> da consumo appartenenti alle <strong>varietà</strong><br />
Agria, Annabel, Arinda, Bellini, Elvira, Inova, Lady<br />
Rosetta, Nicola, Safrane, Santè, Sieglinde e Spunta. Il<br />
campionamento è stato effettuato in <strong>di</strong>verse aziende<br />
della Campania, della Puglia e della Sicilia per<br />
lo svolgimento <strong>di</strong> un progetto multi<strong>di</strong>sciplinare intitolato<br />
“Tipicizzazione e <strong>caratterizzazione</strong> <strong>di</strong> <strong>varietà</strong><br />
<strong>precoci</strong> <strong>di</strong> <strong>patata</strong> con l’impiego <strong>di</strong> tecniche molecolari<br />
e spettroscopiche”. Nell’ultimo anno <strong>di</strong> sperimentazione<br />
sono stati analizzati anche campioni<br />
provenienti dall’Egitto e dall’Italia settentrionale. In<br />
Tabella I è riportato il numero <strong>di</strong> campioni stu<strong>di</strong>ati,<br />
raggruppati per anno e origine geografica.<br />
Sui 119 campioni sono state eseguite le analisi per<br />
la detection <strong>di</strong> Ralstonia solanacearum, Potato Spindle<br />
Tuber Viroid (PSTVd), PVX, PVV, PVY e PLRV.<br />
Per la ricerca <strong>di</strong> R. solanacearum, le analisi sono<br />
state eseguite me<strong>di</strong>ante isolamento dai tessuti prelevati<br />
dai tuberi, su substrato semi-selettivo (SMSA).<br />
La procedura per la preparazione del campione ha<br />
previsto il lavaggio dei tuberi in acqua corrente, il<br />
prelievo dei coni ombelicali e la macerazione in<br />
un’opportuna quantità <strong>di</strong> tampone fosfato ad<strong>di</strong>zio-<br />
nato <strong>di</strong> un antiossidante<br />
20, 21.<br />
Eventuali colonie sospette isolate sono state purificate<br />
su substrato generico NAG (agar nutritivo<br />
ad<strong>di</strong>zionato <strong>di</strong> glucosio) e identificate me<strong>di</strong>ante reazione<br />
<strong>di</strong> ipersensibilità in tabacco e analisi PCR. La<br />
reazione <strong>di</strong> PCR è stata eseguita secondo il protocollo<br />
<strong>di</strong> Seal e collaboratori 22.<br />
La ricerca del PSTVd è stata eseguita sui tessuti<br />
fogliari sviluppatisi in seguito al germogliamento dei<br />
tuberi ottenuto in con<strong>di</strong>zioni controllate. Lo screening<br />
è stato eseguito me<strong>di</strong>ante ibridazione su membrana<br />
(dOT-BLOT) con l’utilizzo <strong>di</strong> un kit commerciale<br />
(Ag<strong>di</strong>a Incorporated, In<strong>di</strong>ana). L’utilizzo del kit<br />
prevede un metodo <strong>di</strong> estrazione rapido dell’RNA e<br />
la detection me<strong>di</strong>ante una sonda marcata con <strong>di</strong>gossigenina.<br />
Come per il viroide, le analisi virologiche sono<br />
state eseguite su tessuti fogliari sviluppatisi in seguito<br />
a germogliamento dei tuberi in serra.<br />
Tabella I.
SIGILLO INdAGINE SuLLO STATO fITOSANITARIO dELLE PROduzIONI dI VARIETà PRECOCI dI PATATA dA CONSuMO<br />
Tabella II.
INdAGINE SuLLO STATO fITOSANITARIO dELLE PROduzIONI dI VARIETà PRECOCI dI PATATA dA CONSuMO SIGILLO<br />
Nella tabella seguente (Tabella IV) sono riportati<br />
i risultati delle analisi virologiche eseguite me<strong>di</strong>ante<br />
dAS-ELISA nell’anno 2008. Nessun campione è risultato<br />
positivo al PVV e al PVX e un singolo campione<br />
proveniente dalla Campania è risultato positivo al<br />
PLRV. Il PVY è stato il virus rilevato con maggiore<br />
frequenza. dalla <strong>caratterizzazione</strong> sierologica dei<br />
ceppi <strong>di</strong> PVY, riportata in Tabella V, si osserva una<br />
preponderanza dei sierotipi N rispetto ai sierotipi<br />
O. Tutti i ceppi del virus pugliesi e il 60% <strong>di</strong> quelli<br />
siciliani sono infatti stati identificati come PVY N. I tre<br />
campioni campani sono risultati infetti dalla variante<br />
PVY O. In seguito alle analisi RT-PCR, è stato rilevato<br />
che tutti i sierotipi O erano identificati come ceppi<br />
ricombinanti Wilga, mentre i sierotipi N ricadevano<br />
sempre nella variante NTN. Non sono state rilevate<br />
infezioni miste.<br />
In Tabella VI sono riportati i risultati delle analisi<br />
virologiche eseguite nell’anno 2009 me<strong>di</strong>ante<br />
<strong>di</strong>agnosi sierologica. Come nell’anno precedente,<br />
il virus maggiormente rappresentato è stato il PVY<br />
mentre solo il 3% dei campioni siciliani ha presentato<br />
infezione da PVX. Nessun campione è risultato<br />
positivo al PLRV e al PVV.<br />
Nel caso del PVY, successivamente all’analisi preliminare<br />
me<strong>di</strong>ante dAS-ELISA, tutti i campioni positivi<br />
al virus sono stati sottoposti alla <strong>caratterizzazione</strong><br />
del virus PVY sia con meto<strong>di</strong> sierologici che<br />
molecolari e i dati ottenuti sono stati messi a confronto<br />
(Tabella VII).<br />
Come si osserva dalla Tabella VII, c’è una perfetta<br />
corrispondenza tra i dati ottenuti me<strong>di</strong>ante detection<br />
con dAS-ELISA e RT-PCR. Le varianti riconosciute<br />
come PVY O in dAS-ELISA vengono sempre identificate<br />
come Wilga in RT-PCR mentre quelle identificate<br />
come PVY N in dAS-ELISA vengono identificate<br />
come PVY NTN in RT-PCR.<br />
da questo momento in poi, faremo riferimento<br />
alla <strong>caratterizzazione</strong> delle varianti ottenute me<strong>di</strong>ante<br />
analisi molecolare.<br />
Nell’anno 2009 è stata riscontrata una maggiore<br />
frequenza della variante NTN rispetto alle altre. Sia<br />
Tabella IV.
SIGILLO INdAGINE SuLLO STATO fITOSANITARIO dELLE PROduzIONI dI VARIETà PRECOCI dI PATATA dA CONSuMO<br />
Tabella VII.
INdAGINE SuLLO STATO fITOSANITARIO dELLE PROduzIONI dI VARIETà PRECOCI dI PATATA dA CONSuMO SIGILLO<br />
0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00<br />
*legenda: SG = Sieglinde; AR = Arinda; IN = Inova; SP = Spunta; SF = Safrane; P = Puglia; S = Sicilia; EG = Egitto<br />
figura 1. — Albero filogenetico degli isolati <strong>di</strong> PVY ottenuto dal calcolo delle <strong>di</strong>stanze genetiche nella regione nucleoti<strong>di</strong>ca VPG-NIa amplificata<br />
con le coppie <strong>di</strong> primer S5585m/A6032m e S5585m/o6266c e usando come riferimento sequenze depositate in banca dati (GenBank/<br />
NCBI).<br />
Campania ma con una frequenza molto bassa. decisamente<br />
più preoccupante per lo stato fitosanitario<br />
dei tuberi italiani è risultato essere il virus Y della<br />
<strong>patata</strong>. Questo, infatti, è stato rilevato con una maggiore<br />
frequenza in tutte e tre le regioni italiane e<br />
anche i tuberi provenienti dall’Egitto sono risultati<br />
09 SG-P C2 NTN<br />
10 AR-P.3 NTN<br />
09 SG-P F2 NTN<br />
PVY NTN DSMZ PV-0410<br />
PVY NTN (AY884984) isolato americano<br />
PVY NTN (FJ201166.1) isolato americano<br />
09 SG-S F1 NTN<br />
10 IN-EG Z NTN<br />
10 IN-EG T.5 NTN<br />
09 SG-P B1 NTN<br />
09 SG-P B3 NTN<br />
10 IN-EG T.1 NTN<br />
10 IN-AR-P.7 NTN<br />
PVY Wilga (AJ889867) Germania<br />
PVY NTN (AJ889866) Polonia<br />
PVY N (HM590405.1) Cina<br />
09 SP-S C3 NTN<br />
09 SP-S B2 NTN<br />
PVY N (EU182576.1) Cina<br />
PVY N (AF522296) Egitto<br />
PVY N (X12456) Francia<br />
10 AR-P .5 O<br />
PVY common strain (O)(U09509) Canada<br />
PVY Wilga (EF558545) Polonia<br />
PVY Wilga (AM113988) Germania<br />
10 SF-P .11 O<br />
PVY common strain (O) DSMZ PV-0078<br />
10 IN-EG T.8 Wilga<br />
09 SP-S D2 Wilga<br />
09 SP-S D3 Wilga<br />
09 SG-P D3 Wilga<br />
10 IN-EG Z.11 Wilga<br />
PVY N (AY166867.1)<br />
PVY N (AJ585197) Regno Unito<br />
PVY N (X97895) Svizzera<br />
infetti dal patogeno. L’incidenza del PVY è stata valutata<br />
con il metodo dAS-ELISA che ha <strong>di</strong>mostrato<br />
essere, per le analisi massali, un metodo sufficientemente<br />
sensibile, rapido ed economico. Interessante<br />
è stato anche l’esito della <strong>caratterizzazione</strong> del<br />
PVY nelle sue varianti genetiche. Nei primi due<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 67<br />
NTN<br />
Wilga<br />
N
SIGILLO INdAGINE SuLLO STATO fITOSANITARIO dELLE PROduzIONI dI VARIETà PRECOCI dI PATATA dA CONSuMO<br />
anni <strong>di</strong> sperimentazione la <strong>caratterizzazione</strong> è stata<br />
effettuata sia con meto<strong>di</strong> sierologici (TAS-ELISA)<br />
che molecolari (touch down multiplex RT-PCR). In<br />
questo biennio i due meto<strong>di</strong> <strong>di</strong>agnostici sono stati<br />
messi a confronto. La <strong>caratterizzazione</strong> sierologica<br />
ha consentito la <strong>di</strong>stinzione delle varianti in PVY O<br />
e PVY N ma non ha permesso <strong>di</strong> <strong>di</strong>stinguere i ceppi<br />
ricombinanti. Come riportato in bibliografia, la variante<br />
NTN non viene <strong>di</strong>stinta dagli isolati PVY N così<br />
come la variante Wilga non viene <strong>di</strong>stinta dal ceppo<br />
comune. L’identificazione dei ceppi necrotici Wilga<br />
come varianti O conferisce ambiguità ai risultati delle<br />
analisi <strong>di</strong>agnostiche. In alcuni paesi, per la certificazione<br />
dei tuberi-seme, è ammessa una certa soglia<br />
<strong>di</strong> tolleranza per gli isolati comuni mentre non è<br />
consentita la presenza dei ceppi necrotici; in paesi<br />
come il Canada, la mancata identificazione <strong>di</strong> questi<br />
ultimi è stata la causa <strong>di</strong> una incontrollata <strong>di</strong>ffusione<br />
degli isolati necrotici sul territorio 26.<br />
Il protocollo <strong>di</strong> RT-PCR messo a punto da Lorenzen<br />
e collaboratori consente, invece, <strong>di</strong> <strong>di</strong>stinguere<br />
contemporaneamente tutte le varianti e <strong>di</strong> identificare<br />
con maggiore precisione le infezioni miste, dovute<br />
a due o più varianti in uno stesso tessuto.<br />
Lo stu<strong>di</strong>o <strong>di</strong> <strong>caratterizzazione</strong> effettuato sui ceppi<br />
<strong>di</strong> PVY isolati nel corso <strong>di</strong> questo lavoro ha permesso<br />
<strong>di</strong> rilevare una maggiore frequenza degli isolati<br />
ricombinanti rispetto agli originari. In particolare, è<br />
stata registrata una maggiore presenza della variante<br />
PVY NTN rispetto alla variante Wilga. Nell’anno 2008,<br />
la totalità degli isolati provenienti dalla Puglia ricadeva<br />
nella variante NTN e l’anno successivo se ne è<br />
registrata una maggiore frequenza rispetto al ricombinate<br />
Wilga, in<strong>di</strong>pendentemente dall’origine geografica<br />
dei tuberi. Risultati simili sono stati ottenuti<br />
in seguito a monitoraggi eseguiti in Svizzera 27 e in<br />
altri paesi europei 28.<br />
Molto poco frequente è stato il rinvenimento del<br />
PVY O, riscontrato solo nell’anno 2010 in tuberi provenienti<br />
dalla Puglia, mentre le varianti PVY N e PVY C<br />
non sono mai state ritrovate. d’altra parte, i casi <strong>di</strong><br />
infezione da PVY N e PVY C riscontrati sino ad oggi<br />
sono stati piuttosto rari anche in altre aree geografiche<br />
29, 30 e il rilevamento delle due varianti ricombinanti<br />
nella quasi totalità dei campioni testimonia<br />
quanto sia comune la ricombinazione genetica nei<br />
Potyvirus in generale e nel PVY in particolare 14.<br />
In seguito all’osservazione della <strong>di</strong>stribuzione delle<br />
<strong>di</strong>verse varianti, gli stu<strong>di</strong> sono stati completati da<br />
un’analisi filogenetica <strong>di</strong> un frammento a cavallo<br />
della regione genica VPG-NIa. Tale analisi ha con-<br />
sentito <strong>di</strong> <strong>di</strong>stinguere gli isolati in due grossi gruppi;<br />
nel primo sono ricaduti gli isolati appartenenti alla<br />
variante NTN mentre, nel secondo, gli isolati Wilga<br />
e O. La composizione in basi delle sequenze dei <strong>di</strong>versi<br />
ceppi, nell’ambito <strong>di</strong> ciascuno dei due gruppi,<br />
risulta essere però piuttosto omogenea e non permette<br />
<strong>di</strong> trovare una correlazione tra sequenza e origine<br />
geografica dell’isolato. Gli isolati della variante<br />
PVY NTN provenienti dall’Egitto risultano essere, in<br />
questa regione nucleoti<strong>di</strong>ca, del tutto simili agli isolati<br />
ritrovati in tuberi pugliesi e siciliani e, inoltre, le<br />
loro sequenze non si <strong>di</strong>scostano <strong>di</strong> molto da quelle<br />
riportate in banca dati per ceppi tedeschi e americani.<br />
Risultati simili sono stati ottenuti in seguito a stu<strong>di</strong><br />
eseguiti negli Stati uniti in cui, le sequenze <strong>di</strong> ceppi<br />
necrotici americani sono risultate molto simili agli<br />
isolati europei 31. Anche gli isolati Wilga rinvenuti<br />
nei campioni analizzati sono molto simili tra loro<br />
e le sequenze della regione nucleoti<strong>di</strong>ca stu<strong>di</strong>ata si<br />
<strong>di</strong>fferenziano, seppure leggermente, da quelle riportate<br />
in banca dati per l’isolato 261-4 (AM113988)<br />
tedesco, per il ceppo PVY Wilga (Ef558545) polacco<br />
o per il ceppo PVY O139 (u09509) canadese. Stu<strong>di</strong><br />
preliminari eseguiti nella regione <strong>di</strong> ricombinazione<br />
HC-Pro/P3 hanno invece consentito una certa <strong>di</strong>stinzione<br />
delle sequenze <strong>di</strong> isolati italiani rispetto<br />
alle sequenze riportate in banca dati (Tomassoli L.,<br />
comunicazione personale).<br />
Conclusioni<br />
In questo lavoro sono riportati i risultati delle<br />
analisi per la valutazione dello stato fitosanitario <strong>di</strong><br />
tuberi <strong>di</strong> <strong>patata</strong> precoce prelevati nell’Italia meri<strong>di</strong>onale<br />
e in Sicilia.<br />
Il patogeno che ha inciso maggiormente sulla<br />
qualità dei tuberi analizzati è risultato essere il virus<br />
Y della <strong>patata</strong> e, in particolare, la sua variante<br />
PVY NTN, agente della maculatura anulare necrotica<br />
dei tuberi. Il virus si trasmette in maniera non persistente<br />
a mezzo <strong>di</strong> afi<strong>di</strong> ma la sua propagazione è<br />
favorita anche dall’uso <strong>di</strong> tuberi-seme infetti 1. Nella<br />
maggior parte dei campioni analizzati i sintomi della<br />
malattia non erano evidenti pertanto la <strong>di</strong>agnosi con<br />
meto<strong>di</strong> analitici risulta fondamentale per rilevare il<br />
patogeno e per limitarne, <strong>di</strong> conseguenza, la <strong>di</strong>ffusione.<br />
Lo stu<strong>di</strong>o filogenetico eseguito nella regione<br />
VPG/NIa degli isolati italiani ha consentito la <strong>di</strong>stinzione<br />
<strong>di</strong> due gruppi corrispondenti alle due varianti<br />
ricombinanti (PVY NTN e Wilga) ma non ha messo in<br />
68 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
INdAGINE SuLLO STATO fITOSANITARIO dELLE PROduzIONI dI VARIETà PRECOCI dI PATATA dA CONSuMO SIGILLO<br />
evidenza una relazione tra le loro origini geografiche.<br />
una relazione tra le sequenze degli isolati e la<br />
loro origine geografica potrebbe essere in<strong>di</strong>viduata<br />
con lo stu<strong>di</strong>o del punto <strong>di</strong> ricombinazione nella regione<br />
genica HC-Pro/P3.<br />
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21. Anonimo. dIRETTIVA 2006/63/CE dELLA COMMISSIONE del<br />
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solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Gazzetta ufficiale<br />
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74.<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 69
MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):71-84<br />
P. LOMBARDI 1, F. CARACCIOLO 1, G. CICIA 1, L. CEMBALO 1, F. COLANTUONI 1, M. D’AMICO 2<br />
T. DEL GIUDICE 1, T. MARAGLINO 3, C. MENNA 4, T. PANICO 1, G. SANNINO 4, D. TOSCO 4<br />
La <strong>patata</strong> novella fino a qualche anno fa ha rappresentato<br />
uno dei prodotti <strong>di</strong> punta dell’export meri<strong>di</strong>onale<br />
verso i mercati europei. Attualmente l’Italia<br />
sta soffrendo <strong>di</strong> una crisi che che ha fatto fortemente<br />
<strong>di</strong>minuire i volumi <strong>di</strong> produzione e, nel contempo, i<br />
flussi destinati ai mercati esteri. Oggi l’Italia si connota<br />
come un paese importatore netto e, pertanto, ad<strong>di</strong>rittura<br />
deficitario sui mercati internazionali. Una politica<br />
<strong>di</strong> valorizazione delle produzioni che faccia perno<br />
sulla tracciabilità e sulla identificazione dell’origine<br />
del prodotto, potrebbe favorire il rilancio <strong>di</strong> tale produzione.<br />
In questo stu<strong>di</strong>o si valuta la possibilità <strong>di</strong> un<br />
simile intervento.<br />
Parole chiave: Patata novella - Tracciabilità - Denominazione<br />
<strong>di</strong> origine.<br />
La valorizzazione della produzione <strong>di</strong> patate novelle<br />
(<strong>precoci</strong> e/o primaticce) nell’Italia meri<strong>di</strong>onale<br />
è una esigenza non più <strong>di</strong>fferibile nel tempo,<br />
vista l’importanza che essa assume in particolari ambiti<br />
reginali. In effetti l’interesse per tale coltivazione<br />
è confinata in modo soatanziale in Sicilia, in Campania<br />
e in Puglia. Mentre, però, nella prima regione<br />
la base produttiva sembra tenere, nelle altre due la<br />
situazione retrocede <strong>di</strong> anno in anno facendo presagire,<br />
in assenza <strong>di</strong> interventi risolutivi, un definitivo<br />
abbandono <strong>di</strong> questa coltivazione negli or<strong>di</strong>namenti<br />
produttivi aziendali. La conseguenza, già oggi vissuta,<br />
è che mentre prima l’Italia rappresentava il paese<br />
leader sui mercati europei con le sue esportazioni<br />
(particolarmente rilevanti quelle destinate al mercato<br />
tedesco), allo stato attuale delle cose il nostro<br />
Autore <strong>di</strong> contatto: P. Lombar<strong>di</strong>, Dipartimento <strong>di</strong> Economia e Politica<br />
Agraria dell’Università degli Stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> Napoli Federico II, Via Università<br />
96, 80055, Portici, Napoli, Italia. E-mail: lombar<strong>di</strong>@unina.it<br />
Costi e benefici <strong>di</strong> un programma <strong>di</strong> tracciabilità<br />
per la filiera della <strong>patata</strong> precoce italiana<br />
1Ministero delle Politiche Agricole e Forestali<br />
(Ex Centro <strong>di</strong> Portici) e Università Federico II <strong>di</strong> Napoli,<br />
Napoli, Italia<br />
2Università degli Stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> Catania, Catania, Italia<br />
3INEA - Sede regionale per la Puglia, Bari, Italia<br />
4Ministero delle Politiche Agricole e Forestali<br />
(Ex Centro <strong>di</strong> Portici), Portici, Napoli, Italia<br />
paese risulta importatore netto accusando significative<br />
per<strong>di</strong>te in termini <strong>di</strong> quote <strong>di</strong> mercato su tutto il<br />
fronte europeo.<br />
Le possibilità <strong>di</strong> rilanciare questo settore passano<br />
per <strong>di</strong>verse possibili azioni. Una <strong>di</strong> queste è la tracciabilità<br />
<strong>di</strong> prodotto che permette al consumatore<br />
<strong>di</strong> identificare con certezza l’origine del prodotto.<br />
Esiste un’ampia letteratura sul ruolo che può svolgere<br />
questa politica nell’aumentare la competitività<br />
dei prodotti italiani a cui i consumatori nazionali<br />
ma anche europei associano in genere un’immagine<br />
fortemente positiva. Nel lavoro che qui presentiamo<br />
vengono valutate la fattibilità e l’efficacia <strong>di</strong> simili<br />
interventi stimando anche i costi e i vantaggi che<br />
essi comportano.<br />
La filiera della <strong>patata</strong> precoce in Italia<br />
La produzione complessiva della <strong>patata</strong> primaticcia<br />
in Italia è <strong>di</strong> 3,5 milioni <strong>di</strong> quintali ricavata su<br />
una superficie <strong>di</strong> poco superiore ai 18 mila ettari e<br />
una resa me<strong>di</strong>a <strong>di</strong> 195 quintali/ha ma che varia a<br />
seconda dell’ambito territoriale anche all’interno <strong>di</strong><br />
una stessa regione. Rispetto alla situazione <strong>di</strong> fine<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 71
LOMBARDI TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA<br />
Tabella I.
TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA LOMBARDI<br />
Tabella II.
LOMBARDI TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA<br />
dai costi espliciti (75-81% del costo <strong>di</strong> produzione <strong>di</strong><br />
riferimento per le aziende che posseggono la terra<br />
e 92-93% per quelle che affittano) e, fra gli stessi,<br />
dalla voce mezzi tecnici (39-50%) e salari (35-44%).<br />
A questo proposito va rilevato che le patate da seme<br />
vengono importate con costi unitari elevati ed il fabbisogno<br />
<strong>di</strong> lavoro della coltivazione è rilevante poiché<br />
la raccolta è eseguita manualmente, in quanto<br />
si tratta <strong>di</strong> un prodotto che potrebbe essere danneggiato<br />
dalla macchina raccoglitrice.<br />
La composizione del red<strong>di</strong>to netto <strong>di</strong> riferimento<br />
varia profondamente passando dalle aziende che<br />
posseggono la terra a quelle che l’affittano. Nelle<br />
prime la voce più rilevante riguarda il compenso<br />
del capitale terra (61-73%), segue la voce <strong>di</strong>rezione<br />
e amministrazione (20-26%). Nelle seconde la componente<br />
dominante è rappresentata dalla <strong>di</strong>rezione<br />
(61-70%), segue la voce interessi (30-39%).<br />
Gli in<strong>di</strong>ci <strong>di</strong> red<strong>di</strong>tività accertati ricadono nel range<br />
1,1/2,4. Come già evidenziato, la red<strong>di</strong>tività dei<br />
fattori conferiti risulta influenzata soprattutto dalla<br />
resa produttiva e dal prezzo <strong>di</strong> ven<strong>di</strong>ta. Essendo il<br />
modello agrotecnico adottato dalle varie aziende<br />
sostanzialmente lo stesso, le oscillazioni delle rese<br />
produttive risultano meno accentuate <strong>di</strong> quelle dei<br />
prezzi. Le une e le altre tendono ad essere più elevate<br />
nelle aziende <strong>di</strong> maggiori <strong>di</strong>mensioni.<br />
I risultati economici della coltivazione risultano<br />
me<strong>di</strong>amente positivi, tali da configurare una <strong>di</strong>fferenza<br />
positiva tra il red<strong>di</strong>to netto e il red<strong>di</strong>to netto <strong>di</strong><br />
riferimento. Le analisi effettuate in<strong>di</strong>cano, infatti, un<br />
valore me<strong>di</strong>o <strong>di</strong> tale in<strong>di</strong>catore paria a circa 900 euro<br />
per ettaro. Tuttavia, anche in presenza <strong>di</strong> sod<strong>di</strong>sfacenti<br />
livelli red<strong>di</strong>tuali la pataticoltura precoce siciliana<br />
evidenzia una certa “<strong>di</strong>namicità” delle superfici<br />
interessate, come già emerso nel corso <strong>di</strong> altre ricerche<br />
1-10, con oscillazioni, da anno in anno, delle<br />
superfici aziendali investite anche nell’or<strong>di</strong>ne del 15-<br />
20%. Tale fenomeno è riconducibile sia a problematiche<br />
tecniche (stanchezza dei terreni, ecc.) che,<br />
ancora, agli andamenti <strong>di</strong> mercato (prezzi contenuti<br />
alla produzione ed elevata offerta nella campagna<br />
precedente, importazioni massicce da altri paesi,<br />
ecc.). Non bisogna, inoltre, trascurare la competizione<br />
tra <strong>patata</strong> e carota, che insistono sugli stessi areali,<br />
e che risulta attualmente squilibrata a favore della<br />
carota. Questa, negli ultimi anni, ha riscosso notevole<br />
interesse sia sui mercati interni che su quelli<br />
europei, generando risultati economici positivi, per<br />
gli operatori delle imprese della filiera, superiori a<br />
quelli della pataticoltura precoce.<br />
La filiera pugliese<br />
La Puglia si configura come una delle regioni <strong>di</strong><br />
riferimento nel contesto nazionale, per quel che concerne<br />
la produzione <strong>di</strong> <strong>patata</strong> precoce e contribuisce<br />
alla formazione del valore delle produzioni agricole<br />
regionali con circa 49 milioni <strong>di</strong> euro. Le coltivazioni<br />
si concentrano principalmente lungo l’arco jonicosalentino<br />
in provincia <strong>di</strong> Lecce e sul litorale adriatico<br />
delle province <strong>di</strong> Bari e Foggia. Il tessuto produttivo è<br />
composto per la quasi totalità da aziende <strong>di</strong> piccole <strong>di</strong>mensioni,<br />
la cui estensione spesso non supera l’ettaro.<br />
Sebbene nell’ultimo decennio sia stato interessato<br />
da un fortissimo ri<strong>di</strong>mensionamento della base<br />
produttiva e dei volumi <strong>di</strong> produzione (più che <strong>di</strong>mezzate),<br />
il comparto ricopre ancora una notevole<br />
importanza nel panorama produttivo italiano. Basti<br />
pensare che con 3523 ettari <strong>di</strong> superficie de<strong>di</strong>cati<br />
alla produzione <strong>di</strong> patate primaticce e con oltre 71<br />
mila tonnellate <strong>di</strong> produzione (me<strong>di</strong>a anni 2007-<br />
2010) esso incide, rispettivamente per il 19% sull’intera<br />
superficie nazionale destinata al comparto e per<br />
il 18% sui corrispondenti volumi <strong>di</strong> produzione (Tabella<br />
III).<br />
La filiera pataticola pugliese sconta da alcuni anni<br />
l’effetto del calo <strong>di</strong> competitività del prodotto sui<br />
suoi principali mercati <strong>di</strong> sbocco del nord Europa<br />
(Germania e Inghilterra) e la riduzione dei consumi<br />
<strong>di</strong> patate primaticce nel mercato interno. Risulta<br />
poco strutturata e caratterizzata da uno scarso coor<strong>di</strong>namento<br />
tra gli operatori, a causa della notevole<br />
polverizzazione aziendale sia nella fase agricola che<br />
in quella della commercializzazione. Questo tessuto<br />
produttivo e commerciale particolarmente frammentato<br />
si confronta, invece, con un comparto <strong>di</strong>stributivo<br />
altamente concentrato. Negli anni, la crescita<br />
della quota <strong>di</strong> mercato detenuta dalla grande <strong>di</strong>stribuzione<br />
organizzata (verso cui viene convogliato<br />
circa l’85% della produzione regionale) ha indebolito<br />
le imprese agricole che, nel processo <strong>di</strong> negoziazione,<br />
vedono sostanzialmente azzerato il loro potere<br />
contrattuale. È soprattutto nella definizione del<br />
prezzo <strong>di</strong> ven<strong>di</strong>ta e delle quantità che i produttori<br />
<strong>di</strong> patate <strong>precoci</strong> accusano la maggiore sofferenza,<br />
ritrovandosi a dover accettare una remunerazione<br />
sostanzialmente fissata dalle imprese acquirenti e<br />
riferita a una domanda <strong>di</strong> volumi scarsamente negoziabile.<br />
Le opinioni prevalenti raccolte durante<br />
l’indagine conoscitiva vedono nell’aggregazione<br />
dell’offerta agricola, nel miglioramento dell’efficienza<br />
dei sistemi <strong>di</strong> trasporto/logistica e nelle azioni <strong>di</strong><br />
74 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA LOMBARDI<br />
Tabella III.
LOMBARDI TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA<br />
Tabella IV.
TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA LOMBARDI<br />
Tabella V.
LOMBARDI TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA<br />
(proxy prezzo) che per tutti i perio<strong>di</strong> <strong>di</strong> commercio<br />
fanno registrare una ragione <strong>di</strong> scambio favorevole<br />
ai nostri flussi in uscita.<br />
La circostanza che maggiormente preoccupa al<br />
riguardo della situazione italiana, risiede nel fatto<br />
che il mercato dell’Unione Europea, fondamentale<br />
riferimento per tutti i flussi <strong>di</strong> commercio estero, relativamente<br />
alle patate novelle, ha visto una crescita<br />
decisamente importante della domanda interna che<br />
ha fatto lievitare i quantitativi importati da 700 mila<br />
tonnellate <strong>di</strong> inizio decennio ad oltre 1 milione <strong>di</strong><br />
tonnellate dei nostri giorni. La pertinenza italiana in<br />
questo contesto <strong>di</strong> crescita, come si può vedere nel<br />
Figura 6, è restata purtroppo stazionaria in valore<br />
assoluto e ad<strong>di</strong>rittura in <strong>di</strong>minuzione se riferita alle<br />
quote <strong>di</strong> mercato.<br />
In riferimento a queste ultime e considerando i<br />
tre perio<strong>di</strong> <strong>di</strong> commercializzazione, la situazione sul<br />
mercato dell’UE è quella rappresentata nella Figura 7<br />
che mostra in maniera incontrovertibile che Francia,<br />
Egitto e Israele assumono una posizione <strong>di</strong> assoluta<br />
dominanza da gennaio ad aprile, lasciando margini<br />
<strong>di</strong> una certa significatività alla Spagna e all’Italia solo<br />
nel periodo maggio-giugno.<br />
La cosa più sorprendente in questo contesto, non<br />
è tanto la posizione che occupano Israele ed Egitto,<br />
viste sia la loro latitu<strong>di</strong>ne che le con<strong>di</strong>zioni esistenti<br />
sui loro mercati del lavoro, quanto la imponente e<br />
<strong>di</strong>ffusa penetrazione commerciale della Francia che<br />
trova spiegazione, a nostro avviso, solo tirando in<br />
ballo la posizione dominante <strong>di</strong> trader piuttosto che<br />
<strong>di</strong> produttore (Figura 8).<br />
Le ragioni politiche per la tracciabilità<br />
Come descritto nei paragrafi precedenti, il comparto<br />
della <strong>patata</strong> precoce si caratterizza per tre elementi<br />
fondamentali: la concentrazione della produzione<br />
in poche aree del paese; l’importanza delle<br />
esportazioni per l’economia del settore; la buona<br />
reputazione del prodotto italiano derivante dalle<br />
particolari caratteristiche organolettiche della <strong>patata</strong><br />
precoce locale.<br />
In tale scenario, quin<strong>di</strong>, poter <strong>di</strong>fferenziare le patate<br />
<strong>precoci</strong> delle regioni italiane, attraverso la certificazione<br />
della provenienza, potrebbe <strong>di</strong>ventare una<br />
scelta strategica obbligata al fine <strong>di</strong> aumentare la<br />
competizione del prodotto nei mercati esteri e in<br />
quello nazionale.<br />
Quanto detto <strong>di</strong>viene maggiormente auspicabile<br />
300.000<br />
250.000<br />
200.000<br />
150.000<br />
100.000<br />
0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009<br />
Figura 6.—Trend delle importazioni UE 25.<br />
Figura 7.—Quote <strong>di</strong> mercato UE per bimestre.<br />
Figura 8.—Francia: export per bimestre e per paese.<br />
78 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012<br />
50.000<br />
M - J<br />
M - A<br />
J - F<br />
0<br />
M - J<br />
M - A<br />
J - F<br />
Francia Italia Egitto Israele<br />
20 40<br />
Spa Fra Ita Ola Egt Isr Mrc Altri<br />
0<br />
Altri<br />
20 40<br />
%<br />
%<br />
Be-Lux Ger Spa R U Ola Por<br />
60<br />
60<br />
80<br />
80<br />
100<br />
100
TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA LOMBARDI<br />
se si osservano i trend dei flussi commerciali. In particolare,<br />
come riportato nel paragrafo precedente,<br />
vanno sottolineati la progressiva rilevanza dei volumi<br />
commercializzati principalmente dalla Francia,<br />
da Israele e dall’Egitto e il contestuale calo delle<br />
esportazione verso il mercato storico <strong>di</strong> destinazione<br />
rappresentato dalla Germania.<br />
In un mercato, come quello dalla <strong>patata</strong> precoce,<br />
caratterizzato, quin<strong>di</strong>, da un profondo processo<br />
<strong>di</strong> cambiamento, poter fornire un prodotto la cui<br />
provenienza e tracciabilità fossero assicurate, permetterebbe,<br />
oltre che una migliore performance sui<br />
mercati esteri, l’impe<strong>di</strong>mento <strong>di</strong> comportamenti opportunistici<br />
a causa dei quali prodotti non italiani<br />
potrebbero essere venduti come tali solo grazie alla<br />
realizzazione del confezionamento o della semplice<br />
tolettatura in Italia.<br />
Ottenere un prodotto tracciato, per il quale fosse<br />
possibile assicurare la provenienza nazionale rappresenta<br />
una strategia <strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenziazione che è in<br />
linea con la corposa normativa privata in materia <strong>di</strong><br />
sicurezza alimentare che nei moderni scenari competitivi<br />
regola i rapporti fra fornitori e grande <strong>di</strong>stribuzione<br />
organizzata.<br />
La strategia seguita dalla fase commerciale della<br />
filiera è stata, infatti, quella <strong>di</strong> moltiplicare e <strong>di</strong>fferenziare<br />
un numero elevato <strong>di</strong> standard privati che,<br />
molto prima <strong>di</strong> quanto abbia fatto la regolamentazione<br />
pubblica obbligatoria, hanno avuto come<br />
obiettivo quello <strong>di</strong> selezionare i fornitori al fine <strong>di</strong><br />
raggiungere livelli più elevati <strong>di</strong> sicurezza alimentare<br />
e tracciabilità, addossando un parte rilevante dei<br />
costi e dei rischi alle fasi a monte della filiera e ai<br />
consumatori finali<br />
4, 5.<br />
La grande <strong>di</strong>stribuzione rappresenta attualmente<br />
l’attore chiave nelle filiere produttive, il cliente interme<strong>di</strong>o<br />
con cui tutti i comparti dell’agroalimentare<br />
italiano dovranno confrontarsi in Italia e all’estero.<br />
In tale ottica, anche la <strong>patata</strong> precoce non può sottrarsi<br />
alla sfida descritta.<br />
Il successo del processo descritto risiede da un<br />
lato in una ristrutturazione della filiera produttiva<br />
così da <strong>di</strong>venire un interlocutore della GDO e dall’altro<br />
nell’offerta crescente <strong>di</strong> innovazione e <strong>di</strong> “qualità<br />
riconoscibile” in termine <strong>di</strong> servizio e <strong>di</strong> prodotto.<br />
Per quanto <strong>di</strong>scusso relativamente alla domanda<br />
crescente <strong>di</strong> sicurezza da parte del consumatore moderno<br />
e all’importanza che la tracciabilità ha fra le<br />
numerose <strong>di</strong>mensioni della qualità e della sicurezza<br />
stessa, appare evidente come la certificazione, l’assicurazione<br />
e la tutela della provenienza della pata-<br />
ta precoce <strong>di</strong>vengano attributi capaci <strong>di</strong> conferire al<br />
prodotto l’innovatività necessaria per aumentare la<br />
competitività nei moderni mercati alimentari.<br />
La correlazione esistente fra innovatività, sicurezza<br />
alimentare e certificazione <strong>di</strong> origine rappresenta<br />
un aspetto rilevante, destinato ad una crescente valenza<br />
strategica.<br />
Fra le motivazioni che si trovano alla base <strong>di</strong> tale<br />
affermazione vi è una rinnovata attenzione sia alla<br />
provenienza dei prodotti alimentari sia alle politiche<br />
a questa connesse da parte <strong>di</strong> paesi, in passato, non<br />
sensibili a questo argomento quali gli Stati Uniti o<br />
alcuni dei paesi emergenti 2, 6. Tale processo implica<br />
che, in futuro, la <strong>di</strong>fferenziazione dei prodotti alimentari<br />
e la competizione <strong>di</strong> questi sul mercato europeo<br />
e globale saranno ancor più legate a politiche<br />
COOL (Country Of Origin Labelling) che si caratterizzeranno<br />
come un mix fra normazione privata e<br />
regolamentazione pubblica. Inoltre, la crescente domanda<br />
da parte dei consumatori non solo <strong>di</strong> sicurezza<br />
alimentare in senso stretto ma <strong>di</strong> “rassicurazione<br />
generale sul prodotto” relativamente agli impatti che<br />
questo può avere sull’ambiente, sulla salute e sulla<br />
società renderà sempre più ampi gli ambiti correlati<br />
alla semplice certificazione <strong>di</strong> origine. Non solo un<br />
prodotto ottenuto in un determinato territorio, con<br />
determinati protocolli produttivi, con determinate<br />
caratteristiche organolettiche e salutistiche ma anche<br />
un alimento la cui filiera possa dare assicurazione <strong>di</strong><br />
un’attenzione crescente alla riduzione degli impatti<br />
ambientali e al rispetto delle con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> lavoro dei<br />
soggetti coinvolti in linea con quelli che sono i <strong>di</strong>ritti<br />
umani e del lavoratore.<br />
I costi della tracciabilità<br />
Da quanto esposto nei paragrafi precedenti emerge<br />
chiaramente l’esigenza <strong>di</strong> puntare sulla soluzione<br />
<strong>di</strong> no<strong>di</strong> strutturali ma anche <strong>di</strong> elementi innovativi<br />
che conferiscano al prodotto italiano caratteristiche<br />
<strong>di</strong>stintive tali da fargli recuperare le quote <strong>di</strong> mercato<br />
perse negli anni ad<strong>di</strong>etro. In particolare, la tracciabilità,<br />
per i motivi esposti nel paragrafo precedente,<br />
rappresenta uno <strong>di</strong> questi elementi. Diviene allora<br />
importante capire quanto ciò possa incidere sui costi<br />
e, dunque, sul prezzo finale <strong>di</strong> ven<strong>di</strong>ta. A questo<br />
proposito quanto avvenuto in Regione Campania<br />
nell’ultimo decennio, rappresenta un interessante<br />
caso stu<strong>di</strong>o, peraltro unico nel panorama nazionale<br />
relativamente alla <strong>patata</strong> precoce. La filiera campa-<br />
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 79
LOMBARDI TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA<br />
na, <strong>di</strong>fatti, accanto ad elementi tra<strong>di</strong>zionali, presenta<br />
oggi realtà interessanti dal punto <strong>di</strong> vista del miglioramento<br />
qualitativo della produzione. Gli aspetti più<br />
salienti <strong>di</strong> questo miglioramento riguardano sia la<br />
fase produttiva che quelle successive <strong>di</strong> lavorazioneconfezionamento.<br />
Esso interessa sia i grossi commercianti<br />
che le OP e, più in dettaglio, consiste nella<br />
sperimentazione <strong>di</strong> nuove <strong>varietà</strong>, introduzione <strong>di</strong><br />
modalità <strong>di</strong> coltivazione biologica e/o integrata, modalità<br />
<strong>di</strong> confezionamento ed etichettatura del prodotto.<br />
Ne segue, spesso, l’adesione a sistemi <strong>di</strong> tracciabilità<br />
e a marchi <strong>di</strong> provenienza e/o <strong>di</strong> qualità che,<br />
pur non avendo un riconoscimento nazionale e/o<br />
europeo, costituiscono un significativo tentativo <strong>di</strong><br />
<strong>di</strong>fferenziazione del prodotto campano com’è avvenuto<br />
con l’istituzione del già richiamato marchio regionale<br />
Patata felix iv. Rispetto alle OP, i commercianti<br />
risultano attenti più al <strong>di</strong>scorso varietale e a quello<br />
lavorazione-confezionamento-etichettatura. Riguardo<br />
al confezionamento, prendono sempre più piede le<br />
confezioni <strong>di</strong> piccola taglia, 1,5-2,5 kg, la cui etichetta<br />
riporta informazioni su provenienza, modalità <strong>di</strong><br />
coltivazione, <strong>varietà</strong>, calibratura e consigli d’uso.<br />
L’indagine svolta per in<strong>di</strong>viduare ed analizzare i<br />
costi relativi alle <strong>di</strong>verse fasi/operazioni (Per quanto<br />
attiene ai costi relativi alla produzione, la metodologia<br />
adottata per la determinazione dei risultati<br />
economici delle aziende (costo <strong>di</strong> produzione e red<strong>di</strong>tività)<br />
si basa sul calcolo del costo <strong>di</strong> produzione<br />
<strong>di</strong> riferimento [CPR] inteso quale sommatoria dei costi<br />
espliciti [Ce] e dei costi impliciti [Ci]) ha previsto<br />
interviste, effettuate a fine estate 2011, ai principali<br />
grossisti ed alle principali OP che operano in Campania,<br />
localizzati nelle aree <strong>di</strong> produzione tra<strong>di</strong>zionale<br />
della <strong>patata</strong> precoce campana che, ovviamente,<br />
producono e commercializzano anche <strong>patata</strong> comune<br />
oltre che altri ortofrutticoli. Da sottolineare, ai fini<br />
della determinazione dei costi, che la <strong>patata</strong> precoce<br />
presenta <strong>di</strong>verse <strong>varietà</strong> dalle caratteristiche organolettiche,<br />
<strong>di</strong> serbevolezza e resistenza agli stress assai<br />
variabili i cui costi <strong>di</strong> produzione possono variare<br />
significativamente. Di conseguenza, anche i prezzi<br />
<strong>di</strong> ven<strong>di</strong>ta possono presentare un’elevata variabilità,<br />
in funzione della <strong>varietà</strong>, del momento e delle<br />
modalità <strong>di</strong> raccolta, dell’andamento climatico, della<br />
specifica piazza <strong>di</strong> contrattazione e persino del mo-<br />
iv L’iniziativa regionale ha costituito per qualche Associazione uno stimolo<br />
a fare in proprio, cimentandosi nella registrazione <strong>di</strong> un proprio marchio,<br />
come quello Patata Fresca Campana della OP Campania Patate, quale elemento<br />
<strong>di</strong> rilancio del prodotto per il consumo fresco, sia a livello nazionale<br />
che internazionale.<br />
mento della giornata in cui si effettuano gli scambi.<br />
In particolare, nell’ultima annata agraria, il prezzo<br />
della <strong>patata</strong> precoce commercializzata nei principali<br />
mercati ortofrutticoli all’ingrosso, è risultato compreso<br />
tra un minimo <strong>di</strong> 20 €/q ed un massimo <strong>di</strong> 35 €/q<br />
v. Si comprende, dunque, quanto sia problematica<br />
la ricostruzione e l’interpretazione dei costi lungo i<br />
<strong>di</strong>versi sta<strong>di</strong> della filiera. Nei questionari è stata prevista,<br />
perciò, una sezione apposita per la rilevazione<br />
dei costi sostenuti in relazione alle <strong>di</strong>verse fasi <strong>di</strong> lavorazione<br />
del prodotto, vale a <strong>di</strong>re: trasporto, lavorazione,<br />
confezionamento, stoccaggio e certificazione.<br />
In base alle informazioni ottenute i costi risultano<br />
<strong>di</strong>stribuiti come <strong>di</strong> seguito in<strong>di</strong>cato vi. Il trasporto,<br />
che avviene esclusivamente su gomma, è una delle<br />
voci più importanti incidendo, me<strong>di</strong>amente, per<br />
un ammontare pari a 3-3,5 €/q <strong>di</strong> prodotto. Le fasi<br />
<strong>di</strong> lavorazione-confezionamento hanno un’incidenza<br />
che <strong>di</strong>pende dalla lavorazione effettuata e dalle<br />
confezioni utilizzate. Difatti, queste tipologie <strong>di</strong> costo<br />
sono quelle per le quali si sono riscontrate le<br />
maggiori <strong>di</strong>fferenze potendo variare da un minimo<br />
da 2,5 €/q a un massimo <strong>di</strong> 5-6 €/q. Ciò <strong>di</strong>pende<br />
dalle caratteristiche del prodotto che esce dal magazzino.<br />
Laddove le fasi <strong>di</strong> scarico, lavaggio, scarto<br />
e calibratura della merce sono molto accurate, così<br />
come avviene quando il prodotto viene confezionato<br />
in contenitori <strong>di</strong> me<strong>di</strong>a-piccola taglia (cassette o<br />
sacchetti riciclabili <strong>di</strong> 1,5-3 kg ma anche sacchi fino<br />
a 15-20 kg) con etichetta riportante informazioni su<br />
provenienza e certificazioni, allora il costo è quello<br />
massimo in<strong>di</strong>cato. Se, viceversa, il grado <strong>di</strong> accuratezza<br />
delle fasi <strong>di</strong> lavorazione è inferiore perché<br />
il prodotto magari è destinato ad essere venduto<br />
come prodotto sfuso o essere ulteriormente lavorato<br />
da altri, allora il costo è decisamente più basso.<br />
Anche per i costi relativi allo stoccaggio è stata riscontrata<br />
una notevole variabilità che <strong>di</strong>pende dai<br />
tempi e dalle modalità <strong>di</strong> permanenza del prodotto<br />
in magazzino. Se, come avviene spesso nel caso<br />
della <strong>patata</strong> precoce commercializzata dagli operatori<br />
intervistati, si tratta <strong>di</strong> una breve permanenza<br />
(alcuni giorni) allora il costo si aggira sui 2,5 €/q;<br />
se, invece, si tratta <strong>di</strong> stoccaggio <strong>di</strong> merce lavorata<br />
che resta in frigorifero anche qualche mese, in attesa<br />
vDa precisare che quello massimo in<strong>di</strong>cato è un prezzo “eccezionale” che<br />
si è verificato in con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> mercato particolari e comunque con un prodotto<br />
<strong>di</strong> qualità elevata quale, per esempio, quello <strong>di</strong> <strong>varietà</strong> Agata, ben<br />
presentata.<br />
vi Le <strong>di</strong>verse categorie <strong>di</strong> costi sono comprensive <strong>di</strong> quelli relativi al lavoro<br />
impiegato, all’uso <strong>di</strong> impianti e macchinari ed alle <strong>di</strong>verse tipologie <strong>di</strong> confezioni<br />
utilizzate.<br />
80 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012
TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA LOMBARDI<br />
<strong>di</strong> essere venduta quando le con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> mercato<br />
migliorano, allora si arriva anche a 5-6 €/q. Infine,<br />
bisogna considerare, là dove presenti i costi della<br />
certificazione. Come sottolineato a inizio paragrafo,<br />
in Campania, sempre più OP ma anche grossisti,<br />
aderiscono a protocolli <strong>di</strong> qualità per poi richiedere<br />
a Istituti Certificatori il rilascio delle certificazioni relative.<br />
Quelle più <strong>di</strong>ffuse riguardano le modalità <strong>di</strong><br />
produzione, tipo produzioni integrate o biologiche,<br />
e la tracciabilità del prodotto commercializzato. Gli<br />
istituti cui si fa maggiore ricorso sono ISMECERT,<br />
per l’uso del marchio regionale Patata felix, e CCPV<br />
per certificazione Global G.A.P. sempre più richiesta<br />
a livello europeo ed alla quale gli operatori della filiera<br />
campana aderiscono per il consolidamento dei<br />
rapporti commerciali. Trattasi, in quest’ultimo caso,<br />
<strong>di</strong> una certificazione <strong>di</strong> tracciabilità riguardante l’intera<br />
filiera, dalla produzione alla lavorazione e al<br />
confezionamento del prodotto pronto per essere destinato<br />
al consumo finale. Me<strong>di</strong>amente, l’incremento<br />
<strong>di</strong> costo dovuto all’adesione a sistemi <strong>di</strong> tracciabilità<br />
e <strong>di</strong> qualità, come quelli precedentemente descritti,<br />
intorno ai 0,23 centesimi <strong>di</strong> euro per chilogrammo<br />
<strong>di</strong> prodotto. Tale importo deve intendersi come<br />
comprensivo sia dei più elevati costi <strong>di</strong> gestione che<br />
<strong>di</strong> quelli vivi sostenuti per l’ente certificatore.<br />
Un stima dei benefici della tracciabilità<br />
La stima dei benefici della tracciabilità è stata effettuata<br />
somministrando un questionario a un cam-<br />
Tabella VI.
LOMBARDI TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA<br />
Tabella VII.
TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA LOMBARDI<br />
<strong>di</strong>vise in <strong>precoci</strong> e comuni, cavoli, lattuga, funghi,<br />
carote, asparagi, cipolle, pomodori, peperoni e melanzane,<br />
cetrioli, fagioli e legumi, zucchine ed altri):<br />
in particolare il modello stocastico implementato ha<br />
fornito stime puntuali dei valori dell’elasticità <strong>di</strong>retta<br />
ed incrociata della domanda alle variazioni <strong>di</strong> prezzo.<br />
I parametri stimati forniscono precise in<strong>di</strong>cazioni<br />
sugli effetti delle variazioni del prezzo iniziale <strong>di</strong> <strong>patata</strong><br />
precoce sulla domanda dei beni sostituti e complementari.<br />
Questo effetto è stato misurato in termini<br />
<strong>di</strong> elasticità al prezzo <strong>di</strong>retta (-0,57) ed incrociata:<br />
fra i prodotti sostituti riscontriamo la <strong>patata</strong> comune<br />
(0,16), il finocchio (0,13) ed i legumi (0,12). Mentre<br />
i prodotti complementari comprendono la lattuga<br />
(-0,07) e le altre verdure (-0,08). Per quanto riguarda<br />
la simulazione sono stati utilizzati i parametri cosi<br />
come stimati dal modello, introducendo l’adozione<br />
<strong>di</strong> tracciabilità nel modello come un “costo puro” t<br />
che aumenta <strong>di</strong> una quota s, il prezzo <strong>di</strong> ven<strong>di</strong>ta del<br />
prodotto considerato: (t=s×P).<br />
L’analisi effettuata simula <strong>di</strong> fatto l’impatto ceteris<br />
paribus <strong>di</strong> breve periodo sul consumo <strong>di</strong> verdure<br />
fresche, ma non tiene conto in maniera esplicita del<br />
possibile incremento della <strong>di</strong>sponibilità a pagare del<br />
consumatore Italiano (DAP) per i prodotti tracciati,<br />
cosi come il paragrafo precedente sembra evidenziare.<br />
La Tabella VIII mostra l’impatto della tracciabilità<br />
sui consumi <strong>di</strong> verdura fresca delle famiglie, per i<br />
<strong>di</strong>versi valori <strong>di</strong> t. Il modello ha confermato empiricamente<br />
l’ipotesi che la <strong>patata</strong> comune è, in termini<br />
<strong>di</strong> abitu<strong>di</strong>ni alimentari, un sostituto <strong>di</strong>retto della<br />
<strong>patata</strong> precoce. I risultati consentono <strong>di</strong> affermare<br />
che i consumatori ritengono la <strong>patata</strong> comune come<br />
bene debolmente inferiore a quella novella. L’im-<br />
plicazione è che la <strong>patata</strong> novella già è considerata<br />
un bene superiore ma un aumento della forbice dei<br />
prezzi, a favore della <strong>patata</strong> comune, avrebbe effetto<br />
significativo sul consumo della novella. A seconda<br />
dell’incidenza dei costi della tracciabilità sui prezzi<br />
al consumo della <strong>patata</strong> precoce, i consumi in quantità<br />
potrebbero ridursi dal 3% al 7% a favore della<br />
<strong>patata</strong> comune.<br />
Tuttavia i costi lungo la filiera cosi come calcolati<br />
in dettaglio nei precedenti paragrafi del lavoro dovrebbero<br />
incidere sul prezzo al consumo in misura<br />
ancora inferiore <strong>di</strong> quanto qui ipotizzato nella simulazione:<br />
l’impatto al consumo dell’incremento <strong>di</strong><br />
costi attribuibile alla procedura <strong>di</strong> certificazione può<br />
ritenersi del tutto trascurabile se dovesse essere inclusa<br />
nel sistema la <strong>di</strong>sponibilità a pagare (DAP) per<br />
l’ attributo “precoce italiana” così come stimata dal<br />
precedente paragrafo. Gli effetti sul prezzo al consumo<br />
sarebbero, infatti, del tutto più che controbilanciati<br />
dall’incremento della DAP del consumatore per<br />
la <strong>patata</strong> precoce Italiana.<br />
Conclusioni<br />
La presente ricerca ha mostrato che una politica<br />
<strong>di</strong> valorizzazione che passa per il riconoscimento <strong>di</strong><br />
origine del prodotto nel settore della <strong>patata</strong> novella<br />
italiana potrebbe avere ampi margini <strong>di</strong> successo. Il<br />
<strong>di</strong>fferenziale tra i costi della tracciabilità e la <strong>di</strong>sponibilità<br />
a pagare da parte dei consumatori italiani per<br />
un prodotto tracciato è molto ampio, tanto ampio da<br />
poter prevedere che l’incremento <strong>di</strong> prezzo che si<br />
realizzerebbe sul mercato produrrebbe una minima,<br />
ancorché nulla, riduzione nella domanda <strong>di</strong> questo<br />
prodotto.<br />
Tabella VIII.
LOMBARDI TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA<br />
La certificazione <strong>di</strong> origine, però, va considerata<br />
una con<strong>di</strong>zione necessaria per il rilancio della pataticoltura<br />
precoce italiana ma da sola probabilmente<br />
non sufficiente a recuperare margini competitivi sui<br />
mercati nazionali ed europei.<br />
Il settore della pataticoltura precoce dovrebbe prestare<br />
molta attenzione non solo alla <strong>di</strong>versificazione<br />
delle produzioni cercando <strong>di</strong> anticipare la raccolta<br />
e la commercializzazione, ma anche ad una migliore<br />
organizzazione ed integrazione tra le <strong>di</strong>verse fasi<br />
della filiera. In effetti una strategia <strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenziazione<br />
che si rispetti comporta il conferimento ai prodotti<br />
<strong>di</strong> caratteristiche <strong>di</strong>stintive rilevanti per il consumatore<br />
in grado <strong>di</strong> incidere (aumentandolo) sul<br />
valore percepito. Perché questo accada è necessario<br />
un attivo coinvolgimento <strong>di</strong> tutti gli operatori della<br />
filiera. Purtroppo l’esperienza maturata nel corso <strong>di</strong><br />
questa indagine hanno fatto maturare la sensazione<br />
che una caratteristica peculiare della filera “<strong>patata</strong><br />
precoce” consiste in una sostanziale marginalità<br />
del ruolo svolto dalla fase produttiva propriamente<br />
detta. La scelta <strong>di</strong> quanto e cosa (<strong>varietà</strong>) coltivare<br />
sono input operativi che il coltivatore “esegue” in<br />
un contesto <strong>di</strong> asimmetria informativa, mentre tutto<br />
il faire valoir è spostato al post-raccolta. Questa<br />
circostanza rappresenta la principale causa che sta<br />
alla base della <strong>di</strong>fficoltà che incontra l’adozione <strong>di</strong><br />
marchi <strong>di</strong> qualità e, più in generale, <strong>di</strong> politiche <strong>di</strong><br />
valorizzazione. Non si spiega altrimenti il <strong>di</strong>vario talora<br />
troppo ampio tra i costi della certificazione e<br />
della gestione <strong>di</strong> un marchio (contenuti) e i valori<br />
(importanti) della DAP risultati dalle nostre indagini.<br />
Conviene, inoltre, anche tenere conto che l’opportunità<br />
<strong>di</strong> risalire la china e tornare ad occupare le<br />
posizioni che tra<strong>di</strong>zionalmente competono all’Italia<br />
(non solo per la <strong>patata</strong> novella ma per tutti i prodotti<br />
<strong>di</strong> qualità) esistono e sono concrete solo se si riesce<br />
ad assecondare la crescita consistente del mercato<br />
comunitario. A tal riguardo è estremamente interessante<br />
il caso della Francia, che ha acquisito negli<br />
ultimi anni un ruolo leader nel mercato della <strong>patata</strong><br />
precoce europea pur con limitati livelli produttivi<br />
propri. Deve far riflettere il fatto che, quando non si<br />
commercializzano commo<strong>di</strong>ty, i mercati sono molto<br />
ristretti e molto più fidelizzati e sensibili per cui è<br />
opportuno curare le relazioni <strong>di</strong> filiera (trasparenza<br />
e serietà) tale da avere la opportunità <strong>di</strong> ampliare il<br />
“portafoglio” cliente/prodotto per minimizzare i rischi<br />
associati alla precarietà dei mercati e aumentare<br />
la capacità <strong>di</strong> penetrarli dal punto <strong>di</strong> vista commerciale.<br />
In definitiva c’è solo da augurarsi che quanto<br />
prima prenda sostanza un progetto <strong>di</strong> filiera che<br />
partendo dal riconoscimento <strong>di</strong> un ruolo attivo dei<br />
produttori sia capace <strong>di</strong> rilanciare l’economia <strong>di</strong> un<br />
prodotto che in passato, per decenni, è stato un fiore<br />
all’occhiello dell’economia agricola meri<strong>di</strong>onale.<br />
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Finanziamenti.—Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero Italiano<br />
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PAPA.<br />
84 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012