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Tabella 2. Riassunto schematico della correlazione tra presenza/assenza degli amplificati relativi ai singoli geni ADH e le rispettive attività enzimatiche nei ceppi di lievito delle collezioni di Velletri e di Perugia. La presenza dell’ attività Adh5p non è rilevabile con questo tipo di colorazione (N.D.). 0
CONCLUSIONI Per una migliore identificazione e tracciabilità dei lieviti appartenenti al genere Saccharomyces, è stato messo a punto un nuovo approccio enzimatico-molecolare basato sull’analisi delle alcool deidrogenasi (ADH), un sistema genico che risulta essere altamente conservato nei lieviti nel corso dell’evoluzione. Ai fini dello studio della variabilità tra le varie specie, il sistema ADH presenta il doppio vantaggio di poter esser analizzato sia a livello del DNA dei geni che lo costituiscono che dei loro prodotti enzimatici. Infatti, da quanto scaturisce dalla nostra indagine, utilizzando primers basati sulle sequenze note dei geni ADH del ceppo di S. cerevisiae di controllo si possono ottenere frammenti di DNA di taglia diversa specifici per ciascun gene. Allo scopo di ottenere più velocemente un’impronta molecolare dei ceppi in esame, è possibile effettuare l’amplificazione di tutti e quattro i geni contemporaneamente mediante PCR multiplex. Inoltre, la successiva digestione dei prodotti di PCR con l’enzima Sau3AI consente di ottenere un polimorfismo di restrizione più dettagliato per ciascun lievito da analizzare. Una volta rilevata la presenza/assenza dei singoli geni ADH, è possibile procedere alla conferma dei risultati ottenuti sulla base dell’analisi del DNA mediante confronto con quelli ottenuti dallo studio delle attività enzimatiche ADH codificate dai singoli geni. Infatti, l’analisi degli zimogrammi ADH ottenuti nell’ambito del presente progetto per ciascun ceppo ha permesso di confermare che: a) l’assenza dell’amplificato di uno specifico gene è sempre associata alla mancanza del rispettivo enzima, a conferma che i primers utilizzati sono altamente specifici per ciascun gene. b) la presenza/assenza degli enzimi ADH in un determinato ceppo ben si correla con il polimorfismo di restrizione del relativo DNA. Riassumendo i risultati, l’analisi combinata DNA-enzima suggerisce che i ceppi di chevalieri e italicus della collezione di Perugia mostrano la presenza di tutti i geni ADH e, pertanto, possono essere considerati delle varietà di cerevisiae. Al contrario, i ceppi B1 e B2 (S.bayanus) e U2 (S.uvarum) della stessa collezione risultano privi del gene ADH3. Inoltre, questi tre ceppi presentano un profilo RFLP e uno zimogramma tra loro sovrapponibili ma molto diversi da quelli delle altre specie di lieviti analizzati. Questi dati suggeriscono che B1, B2 e U2, classificati sulla base delle loro caratteristiche fisio-morfologiche in specie diverse del genere Saccharomyces, possono invece appartenere alla stessa variante di specie. E’ interessante inoltre sottolineare che il pattern enzimatico del ceppo A-270 di uvarum della collezione di Velletri, privo del gene ADH3, è sovrapponibile con quello dei ceppi B1, B2 e U2 della collezione di Perugia. Al contrario, il ceppo C-S6u uvarum della collezione di Velletri mostra uno zimogramma che somiglia in parte a quello al ceppo A-270 uvarum e in parte a quello dei cerevisiae var. bayanus della stessa collezione. Questo dato conferma la capacità discriminante del nostro metodo dal momento che C-S6u, classificato 1
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