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RISULTATI Analisi degli amplificati del sistema genico AdH L’analisi degli amplificati dei geni ADH condotta su ceppi ottenuti dalle collezioni del CRA di Velletri e del DBVPG è riportata in Figura 1. L’analisi è stata eseguita da tre a cinque volte per ciascun ceppo. Come si può osservare, utilizzando primers specifici per i singoli geni ADH, si ottengono i rispettivi amplificati che mostrano migrazioni tra loro diverse mediante gel-elettroforesi. Nel ceppo 2 (S.cerevisiae B-S11c) della collezione di Velletri, il gene ADH2 mostra più prodotti di amplificazione che tendono a scomparire quando vengono amplificati contemporaneamente tutti e quattro i geni (Figura 1a). Per tale motivo, sui ceppi della collezione di Perugia è stata utilizzata direttamente quest’ultimo tipo di tecnica (Figura 1b). La mancata amplificazione di un singolo gene può essere interpretata come indice dell’assenza del gene stesso. I risultati, riassunti nella Tabella 1, sono esposti qui di seguito. - Nel ceppo di riferimento di S.cerevisiae sono presenti gli amplificati di tutti i geni saggiati. Dal confronto degli altri ceppi con questo, si può osservare che: - ADH1, che codifica il principale enzima responsabile dell’attività fermentativa, è presente in tutti i ceppi di tutte le specie saggiate appartenenti a entrambe le collezioni. Inoltre, la taglia del DNA amplificato per PCR rimane la stessa in tutti i casi. - ADH2, nella collezione di Velletri, è presente negli uvarum mentre è del tutto assente nel ceppo di S.cerevisiae E-AT1 e nei bayanus C-SbC2 e D-S16b. Quest’ultimo risultato non si riscontra nei bayanus B1 e B2 della collezione di Perugia nei quali l’amplificato ADH2 è presente e di taglia attesa, così come in tutti gli altri ceppi saggiati di questa collezione. - ADH3 è presente in tutti i cerevisiae di entrambe le collezioni ma mostra una presenza variabile nelle altre specie analizzate. Infatti, per quanto riguarda i ceppi classificati come uvarum, l’amplificato è presente nel ceppo C-S6u della collezione di Velletri e mostra bande di taglia diversa nel ceppo A-270. Nel caso degli uvarum della collezione di Perugia, l’amplificato è presente nel ceppo U1 mentre è del tutto assente nel ceppo U2. Per quanto riguarda la specie bayanus, l’amplificato ADH3 è presente nei ceppi C-SbC2 e D-S16b della collezione di Velletri e assente nei ceppi B1 e B2 della collezione di Perugia. - ADH5 è presente in tutti i ceppi di tutte le specie saggiate appartenenti ad entrambe le collezioni. 2
Digestione degli amplificati del sistema genico AdH ottenuti per PCR Per ottenere un pattern di identificazione molecolare più affidabile, i prodotti di PCR dei geni ADH sono stati sottoposti a restrizione utilizzando Sau3AI, un enzima di restrizione che taglia con alta frequenza il DNA specifico per la sequenza GATC. Questo approccio consente di evidenziare più in dettaglio il polimorfismo di ciascun ceppo. L’analisi è stata effettuata dapprima sul ceppo di laboratorio di riferimento BY4741 (Fig.2) e successivamente sui ceppi della collezione di Velletri (Fig.3) e di Perugia (Fig.4). Come si può vedere, la digestione degli amplificati genici, ottenuti sia singolarmente che insieme dal ceppo di controllo BY4741, ha fornito una serie di frammenti di restrizione caratteristici di ciascun gene e concordi con la loro sequenza nucleotidica. Il pattern RFLP che si ottiene sembra essere caratteristico per ciascun ceppo in quanto questi differiscono tra loro per la dimensione di alcuni frammenti e nel loro numero, coerentemente con il numero di geni amplificati in ciascun ceppo. Per quanto riguarda la collezione di Perugia, il ceppo C2 di S. cerevisiae mostra un pattern di restrizione identico al cerevisiae di controllo, a conferma dell’affidabilità della tecnica. Con piccole differenze, questo pattern si osserva sia nel ceppo di italicus (I2) che nei due ceppi di chevalieri (H2, H3) che, notoriamente, sono sinonimi di cerevisiae. Un diverso profilo è risultato comune per i ceppi U2, classificato nella collezione di Perugia come S. uvarum, e i ceppi B1 e B2 di bayanus. Dal momento che avevamo precedentemente osservato che nel ceppo U2 non è presente l’amplificato del gene ADH3, peculiarità mostrata anche dai ceppi di bayanus della stessa collezione, possiamo ipotizzare che la classificazione di questo ceppo sia stata erroneamente attribuita alla specie uvarum. Un discorso simile può essere fatto per il ceppo U1 di uvarum che mostra un pattern di restrizione più simile al ceppo H3 di chevalieri e al C2 di cerevisiae. Analisi del pattern proteico delle alcool deidrogenasi L’assenza in un determinato ceppo di lievito dell’amplificato di un gene della taglia attesa può essere dovuta alla mancanza del gene stesso o al riarrangiamento della regione codificante del gene. Per verificare che all’assenza dell’amplificato corrispondesse effettivamente l’assenza del gene, abbiamo cercato di stabilire una relazione con la presenza/assenza del corrispondente enzima. A tale scopo, dopo rottura delle cellule ed estrazione delle proteine cellulari, le singole attività ADH sono state separate mediante elettroforesi su gel nativi di acrilamide e la loro presenza è stata messa in evidenza mediante un saggio di attività per colorazione specifica. I risultati di questa analisi sui ceppi della collezione di Velletri hanno mostrato, che all’assenza degli amplificati ADH2 e ADH3 corrisponde effettivamente la mancanza delle corrispondenti attività enzimatiche (Figura 5a). E’ interessante notare che i ceppi 1 e 4 (uvarum) mostrano un pattern enzimatico 3
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RISULTATI<br />
Analisi degli amplificati del sistema genico AdH<br />
L’analisi degli amplificati dei geni ADH condotta su ceppi ottenuti dalle collezioni del CRA di Velletri<br />
e del DBVPG è riportata in Figura 1.<br />
L’analisi è stata eseguita da tre a cinque volte per ciascun ceppo.<br />
Come si può osservare, utilizzando primers specifici per i singoli geni ADH, si ottengono i rispettivi<br />
amplificati che mostrano migrazioni tra loro diverse mediante gel-elettroforesi.<br />
Nel ceppo 2 (S.cerevisiae B-S11c) della collezione di Velletri, il gene ADH2 mostra più prodotti di<br />
amplificazione che tendono a scomparire quando vengono amplificati contemporaneamente tutti<br />
e quattro i geni (Figura 1a). Per tale motivo, sui ceppi della collezione di Perugia è stata utilizzata<br />
direttamente quest’ultimo tipo di tecnica (Figura 1b).<br />
La mancata amplificazione di un singolo gene può essere interpretata come indice dell’assenza del gene<br />
stesso.<br />
I risultati, riassunti nella Tabella 1, sono esposti qui di seguito.<br />
- Nel ceppo di riferimento di S.cerevisiae sono presenti gli amplificati di tutti i geni saggiati.<br />
Dal confronto degli altri ceppi con questo, si può osservare che:<br />
- ADH1, che codifica il principale enzima responsabile dell’attività fermentativa, è presente in tutti i<br />
ceppi di tutte le specie saggiate appartenenti a entrambe le collezioni.<br />
Inoltre, la taglia del DNA amplificato per PCR rimane la stessa in tutti i casi.<br />
- ADH2, nella collezione di Velletri, è presente negli uvarum mentre è del tutto assente nel ceppo di<br />
S.cerevisiae E-AT1 e nei bayanus C-SbC2 e D-S16b.<br />
Quest’ultimo risultato non si riscontra nei bayanus B1 e B2 della collezione di Perugia nei quali<br />
l’amplificato ADH2 è presente e di taglia attesa, così come in tutti gli altri ceppi saggiati di questa<br />
collezione.<br />
- ADH3 è presente in tutti i cerevisiae di entrambe le collezioni ma mostra una presenza variabile nelle<br />
altre specie analizzate. Infatti, per quanto riguarda i ceppi classificati come uvarum, l’amplificato è<br />
presente nel ceppo C-S6u della collezione di Velletri e mostra bande di taglia diversa nel ceppo A-270.<br />
Nel caso degli uvarum della collezione di Perugia, l’amplificato è presente nel ceppo U1 mentre è del<br />
tutto assente nel ceppo U2.<br />
Per quanto riguarda la specie bayanus, l’amplificato ADH3 è presente nei ceppi C-SbC2 e D-S16b della<br />
collezione di Velletri e assente nei ceppi B1 e B2 della collezione di Perugia.<br />
- ADH5 è presente in tutti i ceppi di tutte le specie saggiate appartenenti ad entrambe le collezioni.<br />
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