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Digestione di molecole di DNA con endonucleasi di restrizione e loro analisi
Per la digestione delle molecole di DNA è stata usata 1 unità di enzima per µg di DNA. La reazione
di taglio è stata effettuata in una opportuna soluzione tampone specifica per l’ enzima Sau3AI) alla
temperatura di 37°C .
L’esito della digestione è stato controllato mediante elettroforesi su gel di agarosio alla concentrazione
finale del 2%.
La corsa elettroforetica è stata effettuata ad un voltaggio costante tra 50 e 150 Volts nel tampone TBE
(Tris Base 89mM, acido borico 89mM, EDTA pH 8,3 2mM).
I frammenti di DNA prodotti sono stati messi in evidenza mediante l’aggiunta al gel di agarosio di
bromuro di etidio alla concentrazione finale di 0,5 mg/ml.
Estrazione di proteine totali di lievito
Le cellule provenienti da una precoltura contenente glucosio 2%, vengono seminate in tubi batteriologici
sterili contenenti 5 ml di terreno YP oppure in 20 ml di terreno minimo in beute, supplementato con
le opportune fonti di carbonio. Dopo crescita fino alla fase tardo-esponenziale, le cellule vengono
centrifugate per 10 minuti a 3000 rpm a 4 °C e risospese in 180 µl di soluzione contenente TE 1X (
Tris-EDTA pH 7.4) e Triton-X100 allo 0.1% per ogni 0,1g di cellule. La rottura della parete cellulare
viene effettuata meccanicamente per agitazione della sospensione di cellule su vortex, dopo aggiunta di
sferette di vetro del diametro di 0.5mm. Tale trattamento dura circa 10 minuti e l’avvenuta rottura viene
verificata al microscopio ottico. I campioni vengono quindi centrifugati per 5 minuti a 14000 rpm per
eliminare il pellet cellulare e il supernatante recuperato viene centrifugato per altri 5 minuti a 15000 rpm
permettendo la separazione di una fase solubile.
La quantità delle proteine totali presenti nei campioni in esame viene determinata mediante un saggio
colorimetrico alla lunghezza d’onda di 595 nanometri utilizzando il reattivo Bradford (Coomassie
Brillant Blu G250 0,01%, etanolo 4,7%, acido fosforico 8,5%) (Bradford, 1976).
Separazione elettroforetica delle proteine in condizioni non denaturanti
Le proteine degli estratti cellulari sono state separate sulla base alla carica elettrica posseduta mediante
elettroforesi in condizioni non denaturanti su gel di poliacrilamide al 5%. Il tampone impiegato nella
corsa elettroforetica è così composto: Tris base 25 mM, glicina 192 mM, in acqua bidistillata. Sono stati
caricati su ogni pozzetto del gel circa 10 µg di proteine totali di ciascun campione diluito in un volume
finale di 8-15µl di una soluzione contenente Tris-HCl pH 6.8 50 mM, glicerolo 25%, ß-mercaptoetanolo
100mM e blu di bromofenolo come tracciante. La corsa elettroforetica è stata effettuata a 4°C per circa
1 ora ad un amperaggio costante di 25mA in un apparato per elettroforesi BioRad Mini protean II.
Colorazione degli enzimi ADH mediante saggi di colorazione per attività
L’attività alcool deidrogenasica (ADH) è stata evidenziata incubando il gel per 10-15 minuti a temperatura
ambiente in 5 ml di una soluzione contenente: 10mg di NAD + , 0,4 mg di fenazina metasolfato (PMS) e
1 mg di Sali di blu di nitro tetrazolio (NTB) e 15 µl di etanolo 95%.
L’attività enzimatica è stata rilevata mediante la formazione specifica di bande di colore viola-blu nelle
regioni del gel in cui è migrata l’attività.
Il saggio è basto su reazioni di ossidoriduzione catalizzate dagli enzimi stessi. La colorazione è dovuta
alla riduzione del sale di tetrazolio, accettore finale degli elettroni nella reazione innescata dall’enzima.
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