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Estrazione di DNA totale da lievito
I ceppi sono stati inoculati in terreno liquido e fatti crescere fino ad una densità di 10 8 cellule/ml alla
temperatura di 28°C sotto agitazione. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione, lavate
con TE (Tris EDTA), e trattate con tampone di estrazione (Triton X-100, SDS 1%, NaCl 100mM, TE
pH 8). La sospensione è stata trattata con PCI (fenolo,/CHCl 3 /alcool isoamilico in rapporto 25:24:1
rispettivamente) e le cellule sono state sottoposte a rottura meccanica con palline di vetro su vortex per
4 minuti. Dopo aggiunta di 0,2 ml di TE e dopo centrifugazione è stata recuperata la fase acquosa ed il
DNA è stato precipitato con l’aggiunta di tre volumi di etanolo 95°. Dopo centrifugazione e rimozione
dell’etanolo il DNA veniva ridisciolto in TE+RNAasi per eliminare la contaminazione dovuta allo
RNA.
Amplificazione del DNA tramite PCR
L’amplificazione è stata eseguita utilizzando il kit della TaKaRa SHUZO CO., LTD con le seguenti
modalità:
DNA 50ng
MgCl 2 25mM
Tampone PCRII 10X
dNTP 50µM
Oligo Forward 50pmole/l
Oligo Reverse 50pmole/l
Taq polimerasi 2,5U/l
H 2 O dd Fino a volume di 50μl
Le condizioni di tempo e temperatura delle reazioni erano le seguenti:
DENATURAZIONE: 5 minuti 94°C
30 CICLI
· Denaturazione 30 secondi a 94°C
· Ibridazione 30 secondi a 58°C
· Allungamento 45 secondi a 72°C
TERMINE ALLUNGAMENTO: 4 minuti a 72°C
I prodotti di amplificazione sono stati controllati su gel di agarosio alla concentrazione del 1,2% . Il DNA
è stato messo in evidenza mediante l’aggiunta al gel di agarosio di bromuro di etidio alla concentrazione
finale di 0,5mg/ml e mediante illuminazione con raggi UV.
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