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MESSA A PUNTO DI UN NUOVO CRITERIO DI IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE
AMPLIFICAZIONE DEL SISTEMA GENICO ADH
Il metodo di screening genetico molecolare da noi utilizzato per discriminare i ceppi di lievito isolati
dall’Istituto Sperimentale per l’Enologia di Velletri (ora CRA-Unità di ricerca per le produzioni
enologiche dell’Italia centrale Velletri) si basa sull’analisi del sistema delle alcool deidrogenasi (ADH).
Questo sistema è costituito da tre geni principali, chiamati ADH1, ADH2 e ADH3, che codificano per
attività alcool deidrogenasiche coinvolte nel metabolismo dell’etanolo (Cyriacy 1975; 1979; Young
e Pilgrim 1985). L’espressione dei geni che compongono il sistema delle alcool deidrogenasi viene
regolata a livello trascrizionale, in funzione del tipo di fonte di carbonio disponibile per le cellule.
In particolare i geni ADH1e ADH2 codificano rispettivamente per le proteine enzimatiche Adh1p e
Adh2p, entrambe localizzate nel citoplasma. ADH1 viene espresso in modo semicostitutivo e viene
indotto da glucosio. Il gene ADH2 codifica per un’attività responsabile dell’utilizzazione dell’etanolo
accumulato durante la fermentazione e catalizza la conversione dell’etanolo ad acetaldeide, con
concomitante riduzione del NAD + a NADH. L’espressione del gene ADH2 viene repressa in presenza di
glucosio e indotta su fonti di carbonio respirabili, come etanolo e glicerolo.
In S.cerevisiae esiste un terzo gene, ADH3, che codifica per un alcool deidrogenasi a localizzazione
mitocondriale. La presenza di Adh3p aumenta di circa tre volte durante la crescita su glicerolo. L’isozima
Adh3p partecipa ad un sistema navetta etanolo-acetaldeide capace di regolare l’equilibrio redox NAD + /
NADH tra il citoplasma e il mitocondrio (Bakker et al., 2000).
Esistono inoltre altri geni ADH, quali ADH5, che sembrano essere coinvolti nel metabolismo degli alcoli
superiori (Dickinson et al., 2003).
La scelta di questo sistema genico per il lavoro di caratterizzazione è stata effettuata principalmente per
due motivi:
- i geni ADH sono presenti in tutti i lieviti fermentativi in quanto necessari per la produzione di etanolo
durante la vinificazione a partire dalle alte concentrazioni zuccherine presenti nei mosti;
- i geni ADH mostrano tra loro un’alta omologia e potrebbero quindi costituire un buon substrato per
analizzare le variazioni ceppo e/o specie dipendente nella sequenza del loro DNA .
Nel nostro lavoro di caratterizzazione è stato analizzato il polimorfismo dei geni ADH1, ADH2,
ADH3 e ADH5 mediante amplificazione per PCR utilizzando specifici DNA primers per ciascun gene.
L’amplificazione dei geni ADH è stata condotta sia separatamente sui singoli geni (PCR) che utilizzando
contemporaneamente le coppie di tutti i primers (vedi Tabella in Materiali e Metodi) relativi ai 4 geni
nello stesso tubo di reazione (PCR-multiplex).
Per ottenere un profilo più dettagliato del pattern dei DNA amplificati, questi sono stati sottoposti
successivamente a digestione mediante Sau3AI, un enzima di restrizione che taglia con alta frequenza
le molecole di DNA riconoscendo sequenze specifiche.
Infine, abbiamo cercato di mettere in relazione l’assenza dell’amplificato dei singoli geni con la presenza/
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