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Progetto PRAL 2003/14 

Impiego di lieviti con particolari proprietà enologiche, 

selezionati nella Regione Lazio, per il miglioramento 

della qualità dei vini. 

RISULTATI DELLA RICERCA 

ENC - Velletri

IndIce 

2 

Sommario.................................................................................................................................. pag. 3 

Aspetti metodologici e tecnologici........................................................................................... pag. 5 

Aspetti fermentativi............................................................................................................... pag. 35 

Nuovi approcci per la tipizzazione molecolare di lieviti di interesse enologico................ pag. 43

SOMMARIO 

Il presente progetto è il frutto di una collaborazione tra CRA - Unità di ricerca per le produzioni enologiche 

dell’Italia centrale – VELLETRI (già Istituto Sperimentale per l’Enologia), e il Dipartimento di 

Biologia Cellulare e dello Sviluppo (BCS) dell’Università “Sapienza” di Roma. 

Tale collaborazione, già sperimentata con successo negli anni passati, si giova delle competenze complementari 

sulla fermentazione sviluppate dai due gruppi di ricerca coinvolti, nonché della diversa tipologia 

di strumentazione presente nei laboratori dei due Enti. 

Il gruppo coordinato dal Dr. Gaetano Ciolfi ha maturato una lunga esperienza principalmente sugli 

aspetti metabolici e tecnologici della fermentazione mentre il gruppo coordinato dal Prof. Claudio Falcone 

si occupa prevalentemente dello studio genetico e molecolare dei lieviti vinari. 

Lo scopo principale di questa collaborazione è quello di approfondire da un lato l’effetto della composizione 

dei mosti e delle condizioni di fermentazione sulla qualità del vino e, dall’altro, di migliorare le 

tecniche di identificazione dei lieviti per comprendere il ruolo di ceppi specifici nel processo di vinificazione. 

Presso il CRA sono state effettuate prove di fermentazione in presenza/assenza di ossigeno, azoto e 

calcio pantotenato, utilizzando due differenti ceppi di lievito e uve con diverso grado di maturazione, 

allo scopo di verificare la possibilità di indurre produzioni elevate di composti responsabili della composizione 

chimica ed organolettica dei vini, quali acidi organici, acidi grassi, esteri e glicerina. Su tutte le 

prove sono state eseguite a completamento della fase di fermentazione analisi chimico-fisiche, sensoriali 

e statistiche dei vini ottenuti. 

Le prove sperimentali presso il CRA, come si evince dalla trattazione, hanno confermato come l’impiego 

del lievito S6U (ibrido con caratteristiche fenotipiche riferibili alla razza fisiologica uvarum) sia 

da preferire in ogni fermentazione e questo perché esprime al meglio la tipicità del vino per i seguenti 

motivi: 

contribuisce a mantenere alto il valore di acidità totale e questo rappresenta una garanzia di stabilità 

strutturale del vino; 

produce, in ogni condizione, valori di glicerina più elevati, quindi il vino assume connotati di corposità 

che esaltano il rapporto con il territorio; 

una minore produzione di solfiti agevola un razionale impiego a fine fermentazione e determina una 

migliore compatibilità ambientale. 

Da un punto di vista dei trattamenti al mosto è risultato che: 

l’impiego di ossigeno nel corso della fermentazione risulta ininfluente ai fini del risultato metabolico 

del lievito; 

l’impiego di azoto va limitato soltanto ai casi di effettivo impoverimento del mezzo, casi rarissimi nelle 

condizioni di una razionale enotecnica che non deve prevedere eccessi di chiarifica. Spesso, infatti, si 

tende ad addizionare azoto ammoniacale nell’intento di prevenire rallentamenti o arresti di fermentazione 

che sono la conseguenza della mancata rimozione di inibitori e la causa di trattamenti deproteinizzanti 

troppo spinti. Al riguardo si evidenzia come l’impiego di azoto ammoniacale deprima le qualità 

tipiche dell’uva poiché rallenta il metabolismo degli aminoacidi e peptidi del mezzo; ne consegue che 

la maggiore tipicità del prodotto va perseguita attraverso opportune tecniche colturali volte proprio alla 

migliore espressione del metabolismo variatale. 

Impiegando lieviti in purezza o con inoculo scalare, si riscontra che nelle prove scalari i principali metaboliti 

sono presenti in concentrazioni inferiori rispetto alle fermentazioni in purezza. Per i motivi discussi 

successivamente nel testo, appare evidente come la condotta delle fermentazioni debba essere operata 

da un solo lievito al fine di poter ottenere il migliore risultato metabolico prevedibile e che, nel corso di 

3

fermentazioni scalari, il risultato metabolico complessivo non può essere considerato come il rafforzativo 

delle singole peculiarità ma, bensì, come l’appiattimento delle specifiche tendenze metaboliche. 

Questo fatto appare importante soprattutto quando si vogliono esaltare le qualità compositive del mosto 

di partenza, quindi delle uve e dell’ambiente di provenienza. 

Infine, recenti risultati di Berovic e Herga (2007) hanno indicato che un inoculo di lievito sottoposto a 

shock termico è in grado di produrre un incremento del 74% di glicerina nel corso della fermentazione 

alcolica. Data l’importanza delle implicazioni di tali risultati, abbiamo voluto verificare la loro validità 

mediante prove sperimentali effettuate nelle medesime condizioni operative descritte dagli Autori. 

I nostri risultati, ottenuti anche utilizzando dosi di lievito inoculo differenti, non hanno però indicato 

alcuna variazione nella concentrazione di glicerolo a fine fermentazione. 

Presso il Dipartimento BCS è stato sviluppato un nuovo sistema molecolare per l’identificazione dei 

lieviti vinari basato sulla presenza dei geni che codificano per le alcool deidrogenasi (ADH). Il sistema 

ha il vantaggio di presentare un doppio controllo in quanto consente di combinare l’analisi del DNA amplificato 

di ciascun gene e dei relativi frammenti di restrizione (RFLP) con il rilevamento delle attività 

enzimatiche (zimogramma) ADH presenti in ciascun ceppo. 

I ceppi di lievito analizzati, isolati prevalentemente dall’uva, dai mosti e dal vino, provengono dalle 

collezioni del CRA di Velletri e del Dipartimento di Biologia Vegetale dell’Università di Perugia. 

Nel lievito S. cerevisiae, il sistema ADH è costituito da quattro geni altamente conservati (ADH1, 2, 3 e 

5) che codificano per attività enzimatiche che sono fondamentali per la formazione dell’etanolo a partire 

dagli zuccheri presenti nei mosti. 

La conoscenza delle sequenze nucleotidiche del ceppo di S. cerevisiae utilizzato come controllo ha permesso 

di disegnare coppie di primers specifici per l’amplificazione di ciascuno dei quattro geni ADH. 

Questa tecnica ha permesso di ottenere frammenti di DNA di taglia diversa specifici per ciascun gene. 

L’amplificazione è stata effettuata anche su tutti e quattro i geni contemporaneamente mediante PCR 

multiplex allo scopo di ottenere più velocemente un’impronta molecolare dei ceppi in esame. 

La digestione dei prodotti di PCR ottenuti con Sau3AI, un enzima di restrizione che riconosce le sequenze 

GATC, e la successiva separazione dei frammenti su gel, ci ha permesso di ottenere un polimorfismo 

di restrizione più dettagliato e specifico per ciascun lievito analizzato. 

Per una successiva verifica della validità del metodo, a queste tecniche basate sul DNA è stata affiancata 

l’analisi delle attività enzimatiche ADH codificate dai singoli geni. Questa tecnica, da noi messa a punto 

su minigel e che non richiede pertanto un tempo eccessivo, consiste nella separazione elettroforetica 

degli isozimi ADH presenti negli estratti proteici dei lieviti che vengono poi visualizzate mediante una 

specifica colorazione per attività. 

In tal modo è stato possibile definire per ogni ceppo analizzato uno specifico zimogramma delle attività 

ADH che, confrontato con l’analisi del DNA, ha potuto confermare la presenza/assenza dei rispettivi 

geni. 

Di conseguenza, il sistema combinato DNA enzima potrebbe consentire di seguire con precisione le 

percentuali d’impianto dei vari ceppi durante la fermentazione. 

Il Coordinatore del progetto 

Prof. Claudio Falcone 

4

cRA-Unità di ricerca per le produzioni enologiche dell’Italia centrale Velletri 

Regione Lazio, Progetto PRAL 2003/14: 

Impiego di lieviti con particolari proprietà enologiche, selezionati nella Regione Lazio, per il miglioramento 

della qualità dei vini. 

ASPETTI METABOLICI E TECNOLOGICI 

Favale Stefano, Paolo Pietromarchi, Domenico Tiberi, Alberto Cedroni, Aldo Garofolo, Gaetano Ciolfi 

Premessa 

Nelle varie fasi che si susseguono durante il processo tecnologico della vinificazione, quella della fermentazione 

alcolica è sicuramente una degli aspetti più sentiti nel mondo enologico, proprio perchè è 

durante questo processo biochimico che si determinano le caratteristiche compositive ed organolettiche 

dei vini. 

Considerato l’interesse rivolto a questo argomento dall’industria enologica, la ricerca scientifica è da 

tempo impegnata ad affrontare le problematiche legate al biochimismo cellulare del lievito, oltre ad 

approfondire le conoscenze sugli aspetti che possono indurre anomalie quali arresti di fermentazione o 

fermentazioni stentate. 

Nonostante i numerosi progressi realizzati in cantina (controllo della temperatura, ecc.), si può considerare 

che la gestione della fermentazione è ancora lungi dall’essere ottimizzata. In effetti, un dato

fondamentale in enologia è raramente preso in considerazione, ed in modo impreciso: la variabilità 

della materia prima. Il monitoraggio in linea della cinetica fermentativa (per ora ancora una utopia) può 

servire non solo a migliorare il controllo dell’andamento delle fermentazioni, ma anche, e soprattutto, a 

“pilotarne” il controllo. 

Questa nozione di pilotaggio consiste nell’adattare gli interventi (temperatura, aggiunte di nutrienti etc.) 

in funzione dello svolgimento della fermentazione. A breve o medio termine, consisterà anche in anticipare, 

grazie ad una predizione (modellizzazione) dell’andamento fermentativo e nel prendere in considerazione 

non solo i criteri tecnologici (completamento delle fermentazioni, consumo di frigorie…) 

ma anche criteri più qualitativi. 

È ormai dimostrato, dalla letteratura, come alcuni elementi costituiscano veri e propri fattori limitanti 

lo sviluppo e il metabolismo del lievito, in particolare: l’ossigeno risulta essere necessario ai lieviti 

per sintetizzare acidi grassi e steroli nella fase di crescita aerobica, l’azoto (sotto forma assimilabile) è 

necessario alla crescita cellulare dei lieviti e calcio pantotenato, responsabile della sintesi di Acetil-coenzima 

A per un corretto impiego di acetato di derivazione intracellulare. 

Sebbene la fermentazione alcolica si svolga in un ambiente anaerobico, è ormai dimostrato come il ruolo 

dell’ossigeno nei mosti influenzi la produzione di numerosi composti e contribuisca alla completezza 

gusto-olfattiva dei vini; fino ad oggi, però, l’importanza di questo elemento è stata valutata soprattutto 

per ciò che attiene all’incidenza sulla frazione fenolica del mosto e poco si sa sulla funzione di questo 

elemento sul metabolismo cellulare in condizione di fermentazione anaerobica. 

Il ruolo dell’ossigeno è generalmente favorevole alla qualità dei vini, in modo particolare nella vinificazione 

in rossi, anche se è necessario che dosi e modalità d’impiego siano strettamente controllate. Diverse 

e recenti tecniche di vinificazione prevedono la somministrazione ragionata dell’ossigeno durante le 

fasi che susseguono nella trasformazione da uva a vino anche in condizioni di iperossiggenazione. 

La microssigenazione, durante la fase di maturazione e affinamento dei vini, o al contrario, le vinificazioni 

in riduzione, eseguite cercando di limitare al minimo il contatto dei mosti e dei vini con l’ossigeno, 

dimostrano l’importanza che riveste questo elemento in enologia. 

È perciò necessario rapportare queste tecniche sempre al tipo di uva oggetto di lavorazione in considerazione 

della differente risposta legata alla composizione analitica del mosto. 

Uve aromatiche (ad esempio moscato ) o con alto contenuto di precursori aromatici (tra cui si può annoverare 

anche la Malvasia del Lazio) possono essere trattate sia con tecniche in riduzione sia in ossidazione. 

Per uve che possiedono un basso contenuto aromatico, viene preferita in vinificazione in riduzione, 

al fine di cercare di mantenere questa dotazione altrimenti compromessa con ossigenazione. 

Uve dal sapore neutro, che apportano ai conseguenti vini profumi e aromi derivanti dalla sola fermentazione 

alcolica, sono generalmente trattate con techiche ossidative, che contribuiscono a una migliore 

stabilità del vino e ad un uso ridotto di solfiti. 

Le principali esperienze del ruolo dell’ossigeno nella fermentazione vinaria furono eseguite da Riberau- 

Gayon e da Sablayrolles, i quali, oltre a constatare il ruolo fondamentale che riveste nella sintesi lipidica 

e nella formazione di grandi quantità di steroli e acidi grassi, determinarono che la quantità di ossigeno 

necessaria al corretto svolgimento di questo processo sia da considerarsi tra i 5 e 10 mL/L di ossigeno, 

somministrato nella fase esponenziale di crescita cellulare del lievito (circa due giorni dopo l’inoculo). 

Si deve a Moutonet e ad altri ricercatori di Montpellier i primi studi sulla microssigenazione, tecnica nata 

dall’intuizione di ricreare condizioni redox in un mosto o in un vino, vinificato in serbatoio in acciaio 

inox, simili a quelle che si verificano in una barrique. Si è accertato che l’apporto di ossigeno in fase di 

affinamento in una barrique varia da 0,6 a 3 mL/L/mese in funzione della tipologia di legno utilizzato e 

dal grado di permeazione delle doghe, che diminuisce con il tempo di utilizzo (Ferrarini et al., 2001). 

Alcuni studiosi riportano come mosti fermentati con lieviti Saccharomyces cerevisiae, in assenza di 

ossigeno iniziale, producano a fine fermentazione vini con più basse concentrazioni di alcoli superiori ed 

esteri, mentre mosti addizionati di ossigeno presentano più alti contenuti di questi composti. In presenza

di ossigeno iniziale , però, è più elevato il contenuto in alcoli superiori a scapito degli esteri, per cui il 

miglior rapporti tra questi due composti induce a pensare che il non impiego di ossigeno iniziale possa 

incrementare le proprietà sensoriali dei vini ottenuti (Valero, et al., 2002). 

Altre ricerche hanno indagato sull’influenza che determina l’addizione di ossigeno durante la fermentazione 

sugli steroli contenuti nelle fecce (lisi o scorse) di lievito e la reattività delle stesse nei confronti 

dell’ossigeno. Studi condotti da Caroline Fornairon-Bonnefond (2003) hanno investigato sulla potenziale 

relazione tra ossigeno aggiunto a ceppi di lievito enologici commerciali durante la fase di fermentazione 

alcolica e l’interazione tra fecce di lievito e ossigeno. Sulla base di queste indagini, aggiunte di 

bassi ed eccessivi contenuti di ossigeno, rispettivamente di (7 mg/L) e (37 mg/L), alla fine della crescita 

cellulare, sono stati comparati in termini di ripercussioni sull’attività di consumo dell’ossigeno delle 

corrispondenti fecce di lievito. 

Da ciò è emerso che la somministrazione di ossigeno da parte delle cellule di lievito durante la fermentazione 

ha un’influenza positiva sulla cinetica di fermentativa, incrementando al tempo stesso la formazione 

di biomassa delle cellule. Si è altresì osservato che i tassi di consumo di ossigeno e la capacità 

di consumo da parte delle fecce di lievito, diminuisce quando l’ossigeno viene somministrato durante 

la fermentazione. Contemporaneamente si è registrato un incremento della sintesi dell’ergosterolo e la 

degradazione degli steroli ossigeno dipendenti. Tale degradazione avviene quando l’ossigeno è somministrato 

in dosi eccessive. Sulla base di questi studi risulta fondamentale avere un controllo diretto dell’ossigenazione 

dei mosti durante la FA sia per ottimizzare la cinetica fermentativa, sia per controllare 

la reattività che hanno le fecce di lievito nei confronti dell’ossigeno. 

Diversi studi hanno evidenziato come il contenuto di azoto presente nei mosti contribuiscano alla qualità 

compositiva e sensoriali del vino. Mosti che presentano bassi contenuti di azoto prontamente assimilabile, 

fondamentale per la crescita cellulare dei lieviti e di conseguenza del vigore fermentativo, 

vanno incontro a rischi di arresti fermentativi, cinetiche di fermentazione stentate o lente, favorendo 

la produzione di tioli non desiderati (es. idrogeno solforato) e alcoli superiori, con basse produzioni di 

esteri e acidi grassi. Di contro, alti contenuti di azoto assimilabile, oltre a determinare vigorose fermentazioni, 

favoriscono la formazione di etil acetato, acido acetico e acidità volatile (Bell S., Henschke P., 

2005). Altri studi, svolti presso l’INRA di Montpellier e cordinati da Jean Marie Sabrayrolles, hanno 

evidenziato che la disponibilità di azoto assimilabile non ha influenza sul completo svolgimento della 

fermentazione (esaurimento degli zuccheri presenti), ma che tale dotazione influenzi la velocità di avvio 

della fermentazione, i tempi in cui questa raggiunge il massimo consumo degli zuccheri e sull’altezza 

del picco di massima velocità di fermentazione (intesa come quantità di zuccheri consumata, o di CO2 

sviluppata, nell’unità di tempo). 

Alcune ricerche hanno approfondito gli aspetti e dimostrato anche le interazioni che avvengono in mosti 

sintetici tra azoto assimilabile e acido pantotenico presenti in dosi variabili. In mezzi sintetici contenenti 

250 μg/L la produzione di idrogeno solforato (H2S) diminuisce da 480 μg e 420 μg a 4-6 e 80 μg 

rispettivamente quando il contenuto in azoto assimilabile è incrementato da 60 a 250 mg/L. al contrario 

il contenuto di H2S viene incrementato quando all’aumento di azoto prontamente assimilabile coincide 

un basso valore di acido pantotenico (Wang et al., 2003).

Scopo del lavoro 

Dalla disamina delle acquisizioni si sono volute approfondire le conoscenze circa la possibilità di indurre 

produzioni elevate, durante la fase di fermentazione alcolica, di alcuni dei composti responsabili della 

composizione chimica ed organolettica dei vini, quali acidi organici, acidi grassi, esteri e glicerina. 

A tal fine sono state allestite e condotte presso il CRA-Unità di ricerca per le produzioni enologiche 

dell’Italia centrale (già Istituto Sperimentale per l’Enologia) una serie di prove di fermentazione analizzando 

l’interazione che si registra nel mezzo utilizzando due differenti ceppi di lieviti enologici isolati 

presso il CRA-ENC, in presenza o assenza, di ossigeno, azoto e calcio pantotenato, su un mosto da 

Malvasia puntinata (o del Lazio) (foto 1 e 2) ottenuto da uve raccolte a maturità fisiologica ma con uno 

stato sanitario differente. Le uve provenivano dal vigneto sperimentale presso l’unità di ricerca sede del 

Centro Dimostrativo Regionale ARSIAL e da essa condotto (foto3). 

Tutte le fermentazioni sono state condotte a 25°C fino allo svolgimento di un grado alcolico del 4%, per 

poi concludere la FA ad una temperatura costante di 18°C. 

Su tutte le prove oggetto di studio sono state eseguite a completamento della fase di fermentazione analisi 

chimico-fisiche, sensoriali e statistiche dei vini ottenuti. 

Foto 1

Foto 2 

Foto 3

Materiali e metodi 

La prova sperimentale è stata eseguita presso il CRA-ENC Unità di ricerca per le produzioni enologiche 

dell’Italia centrale di Velletri. É stata impiegata uva Malvasia del Lazio, raccolta manualmente in due 

masse distinte: la prima massa, denominata MQ (Malvasia di Qualità) è stata effettuata sottoponendo le 

uve a cernita manuale, scartando i grappoli in non perfetto stato sanitario; la seconda massa, denominata 

MS (Malvasia Standard), è stata effettuata simulando una raccolta meccanizzata, quindi raccogliendo 

tutti i grappoli presenti sulle piante, anche quelli in non perfetto stato sanitario. 

Per ciascuna delle masse di uva, di circa 1500 kg cadauna, si è seguito lo stesso protocollo di vinificazione 

in bianco, che ha previsto nelle prime fasi di lavorazione le seguenti operazioni: diraspo-pigiatura, 

pressatura e solfitazione omogenea del mosto (50 mg/L), chiarificazione statica (senza ausilio di additivi) 

per 24 ore a 8°C. Trascorso tale tempo è stata spillata una massa omogenea di 900L, per ciascuna 

prova, e ripartita in 10 fermentini in acciaio inox AISI 316 termocondizionati. 

Su ciascun fermentino è stata avviata la fermentazione alcolica utilizzando due distinti ceppi di lievito 

isolati presso il CRA-ENC, lievito Saccharomyces cerevisiae r.f. uvarum S6U e lievito Saccharomyces 

cerevisiae AT1. I lieviti sono stati scelti in virtù delle loro caratteristiche metaboliche le più compatibili 

con la tipologia di vini dell’areale laziale. 

Le condizioni operative sui fermentini, uguali per entrambe le prove (MQ e MS), hanno previsto condizioni 

differenti di fermentazione alcolica in presenza o assenza di ossigeno, azoto e calcio pantotenato, 

e sono di seguito riassunte nello schema riportato in Tabella 1. 

Tutte le prove oggetto di studio, a fine fermentazione alcolica, sono state sottoposte ad analisi chimiche 

e fisiche, inoltre, per ogni prova si sono eseguiti trattamenti di chiarifica, stabilizzazione tartarica e proteica, 

filtrazione ed infine avviate alla fase di imbottigliamento. 

Dopo circa 3 mesi dal loro confezionamento in bottiglia, tutti i vini sono stati sottoposti ad esame organolettico 

e sensoriale. 

Le prove sono state allestite presso la cantina sperimentale del CRA-Unità di ricerca per le produzioni 

enologiche dell’Italia centrale di Velletri impiegando un impianto pilota (foto 4) dimensionato per effettuare 

fermentazioni sperimentali, impianto finanziato totalmente con fondi regionali attraverso convenzioni 

e progetti PRAL (2000/44, 2002/59, 2003/22) In foto 5 si evidenzia il particolare strumentale del 

microossigenatore. 

Foto 4 

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Foto 5 

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Schema operativo 

N° fermentino Lievito Ossigeno Azoto Calcio Pantotenato 

1 AT1 NO SI SI 

2 S6U NO SI SI 

3 AT1 NO NO NO 

4 S6U NO NO NO 

5 AT1 NO SI NO 

6 S6U NO SI NO 

7 AT1 SI NO NO 

8 S6U SI NO NO 

9 AT1 SI SI NO 

10 S6U SI SI NO 

Lievito: le dosi di inoculo utilizzate sono state per il lievito S6U di 20 g/hL (peso secco) e di lievito AT1 

in dose di 2 Milioni cellule/m L sotto forma di mosto di avviamento. 

Il lievito S6U, isolato nell’areale laziale, per le sue qualità metaboliche e tecnologiche viene prodotto 

industrialmente dalla società Lallemad-Lalvin e distribuito in tutte le aree enologiche del Pianeta. Questo 

lievito ha ottenuto un espresso riconoscimento da studiosi di tutto il mondo; parimenti il Centro per la 

Sperimentazione in Vitivinicoltura di Verona e l’Università degli studi di Verona lo hanno indicato 

come il miglior lievito per la produzione di vini in Valpolicella. Si tratta di un lievito ibrido naturale con 

caratteristiche fenotipiche della razza S. uvarum (Tosi,Zapparoli,2005). 

Il lievito AT1, isolato anch’esso nell’areale laziale è uno dei migliori ceppi della razza fisiologica 

cerevisiae ed è stato preferito per le sue qualità aromatiche e metaboliche. 

Ossigeno: quattro prove sono state trattate fornendo ossigeno (Rivoira S.p.A.) in dose complessiva di 

2,5 ml/L per die, somministrato mediante microssigenatore (ditta Tecnal) ad intervalli regolari di 30 

minuti nell’arco delle 24 ore. 

Azoto assimilabile: sulla base delle analisi eseguite dopo pigiadiraspatura, pressatura e omogeneizzazione 

della massa, è stato aggiunto azoto prontamente assimilabile, sotto forma di solfato (50%) e fosfato di 

ammonio (50%), fino a raggiungere un contenuto nel mosto complessivo di 237 mg/L ed aggiunto in un 

unica somministrazione all’inizio della fermentazione. 

Calcio Pantotenato: sui fermentini interessati è stato fornito calcio pantotenato in dose di 1 mg/L e 

somministrato in unica soluzione all’inizio della fermentazione. 

Analisi chimiche: sulle tutte le prove oggetto di studio sono state eseguite analisi chimico-fisiche 

secondo le metodiche ufficiali riportate sulla G.U. delle Comunità Europee L.272 del 3/10/1990. 

Le analisi dei composti volatili sono state eseguite secondo i metodi Giannotti S., Di Stefano R. (1991) 

e Di Stefano R. (1991). 

Analisi statistiche: tutti i dati ottenuti dalle analisi chimicho-fisiche sono stati trattati con Test ANOVA 

(α = 0.05) . 

Analisi Sensoriali: a circa tre mesi dopo il loro confezionamento in bottiglia, i vini ottenuti dalle prove 

MQ e MS sono stati sottoposti ad esame organolettico utilizzando il Test di Kramer (o dell’ordimanento) 

attraverso il quale il panel di degustatori è stato chiamato ad esprimere un giudizio di gradevolezza 

complessivo, ordinando i vini in ordine crescente di gradimento. 

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Risultati delle prove sperimentali 

Di seguito vengono riportate le principali analisi chimico-fisiche dei mosti di partenza, ci sono differenze 

significative, la prova MS evidenzia un mosto proveniente da uve con raccolta posticipata, lo si deduce 

dalla concentrazione zuccherina (20,43 % per MQ contro, 22,8 % per MS), dalla acidità titolabile in 

valore superiore alla MQ, dal contenuto in APA a livello inferiore. Purtroppo nella prova MS si evidenzia 

un contenuto in acidità volatile elevato (0,92 g/L a fronte dello 0,16 per la prova MQ), questo fatto 

dimostra come la sanità delle uve era alquanto compromessa. Per un certo verso, la cosa è stata voluta 

e programmata proprio al fine di valutare l’eventuale incidenza dell’acido acetico sul metabolismo del 

lievito ma anche per individuare eventuali differenze dovute alla diversa tipologia di azoto presente; 

infatti, con lo svilupparsi della muffa grigia la sua crescita impone l’idrolisi di parte del contenuto 

proteico dell’acino e conseguente consumo di parte dell’azoto aminoacidico dello stesso. A riprova di 

ciò, le analisi evidenziano come l’APA presente nel mosto MS sia inferiore a quello in MQ. Nell’allestire 

le prove, quindi, quella su mosto MS conterrà un quantitativo di azoto ammoniacale superiore al mosto 

MS tale, però, da pareggiare il valore finale di APA. 

Analisi dei mosti di partenza 

PROVA MQ (Tabella 1) 

Zuccheri 20,43 

pH 3,37 

Ac. Titolabile 6,15 

APA* (mg/L) 187 

SO2 totale 58 

Ac. Volatile 0,16 

densità 20°C 1,0801 

*Azoto ammoniacale, per le prove che lo prevedevano, è stato addizionato fino a raggiungere valore di 237 mg/L: 150 

mg/L sotto forma di fosfato e 150 mg/L di solfato. 

PROVA MS (Tabella 2) 

Zuccheri 22.8 

pH 3,44 

Ac. Titolabile 7,27 

APA* (mg/L) 159 

SO2 totale (mg/L) 58 

Ac. Volatile 0,92 

densità 20°C 1,0925 

* Azoto ammoniacale, per le prove che lo prevedevano, è stato addizionato fino a raggiungere 237mg/L : 234mg/L 

sotto forma di fosfato e 234 mg/L di solfato. 

Di seguito sono riportati i dati relativi alle analisi chimico-fisiche dei vini (tabella 3 e 4) ottenuti nonché 

le elaborazioni statistiche anche dei composti volatili (dalla tabella 5 a 18). 

In tabella 19 vengono riportate le principali significatività statisticamente accertate indicando con 

il segno più e meno il valore maggiore e il minore in termini assoluti; per alcuni parametri, ritenuti 

ugualmente importanti si è voluto sottolineare il significato del valore riscontrato pur non essendo, 

questo, statisticamente significativo. Tali valori sono stati indicati con un cerchietto. 

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ANALISI DEI VINI PROVA MQ (Tabella 3) 

analisi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 

Alcol % vol 11,75 11,56 11,65 11,59 11,7 11,16 11,65 11,38 11,68 11,45 

densità 20°C 0,99280 0,99330 0,99275 0,9931 0,9927 0,99415 0,99275 0,99345 0,99285 0,9935 

estratto totale 

g/L 

14 

21,6 22,4 21,3 21,9 21,3 23,2 21,3 22,2 21,5 22,6 

pH 3,38 3,32 3,4 3,35 3,32 3,23 3,4 3,33 3,33 3,28 

acidità volatile 

g/L 

acidità titolabile 

g/L 

0,17 0,19 0,21 0,14 0,14 0,16 0,17 0,18 0,18 0,17 

6,07 6,90 5,92 6,9 6,15 7,65 6,11 7,27 6,26 7,2 

SO 2 totale mg/L 37,76 27,52 33,92 23,04 31,36 16 37,76 20,48 32 20,48 

l dominante 

(P.O. 1cm) 

luminosità y% 

(P.O. 1cm) 

saturazione P% 

(P.O. 1cm) 

abs 420 nm 

(P.O. 1cm) 

flavani vanillina 

mg/L di (+)- cat. 

polifenoli totali 

mg/L di (+)- cat. 

acidi ICT Acido 

caffeico mg/L 

574,224 574,703 574,884 576,002 574,682 576,570 574,172 575,196 574,510 575,972 

98,63 96,52 96,05 95,44 95,99 94,85 96,74 95,48 96,32 95,14 

5,63 5,15 5,53 5,21 5,96 5,98 5,59 6,15 5,55 6,04 

0,077 0,074 0,081 0,081 0,084 0,09 0,081 0,091 0,081 0,089 

38,97 48,85 55,25 50,02 64,56 41,29 50,02 51,76 43,04 55,83 

177,18 184,64 183,52 173,45 173,07 195,45 190,60 185,75 180,91 180,91 

34,67 34,33 35,44 35,44 36,11 33,78 36,67 35,56 36,22 36,00 

acido malico g/L 2,34 2,67 2,42 2,61 2,34 2,66 2,37 2,66 2,42 2,69 

acido lattico g/L 0,01 0,01 0,02 0,03 0,01 0,03 0,01 0,02 0,02 0,02 

acetaldeide 

mg/L 

12 23 12 18 9 21 12 19 12 15 

glicerina g/L 4,8 6,1 5,1 6,1 5,5 6,7 5,4 6,5 5,4 6,4

ANALISI DEI VINI PROVA MS (Tabella 4) 

analisi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 

Alcol % vol 13,60 13,48 13,53 13,61 13,37 13,47 13,41 13,58 13,52 13,49 

densità 20°C 0,99445 0,99340 0,99445 0,9934 0,99595 0,9937 0,99555 0,99335 0,9948 0,99365 

estratto totale 

g/L 

estratto ridotto 

g/L 

31,5 28,4 31,3 28,8 34,6 29,1 33,8 28,6 32,2 29,1 

26,8 27,23 27,41 

zuccheri g/L 7,8 7,57 5,79 

pH 3,48 3,36 3,53 3,45 3,48 3,35 3,53 3,44 3,47 3,33 

acidità 

volatile g/L 

acidità 

titolabile g/L 

SO 2 libera 

mg/L 

SO 2 totale 

mg/L 

0,60 0,56 0,74 0,61 0,59 0,58 0,66 0,62 0,6 0,58 

6,66 7,47 6,45 7,37 6,45 7,67 6,45 7,35 6,45 7,83 

1,92 2,11 2,37 2,18 1,54 1,28 1,28 1,28 1,92 1,92 

36,48 36,48 33,92 39,04 33,28 26,88 38,4 30,4 39,68 24,96 

ceneri g/L 3,02 2,89 2,9 2,87 3,11 3,1 2,92 2,89 3,06 3,07 

alcalinità delle 

ceneri meq/L 

l dominante 

(P.O. 1cm) 

luminosità y% 

(P.O. 1cm) 

saturazione 

P% (P.O. 

1cm) 

abs 420 nm 

(P.O. 1cm) 

flavani 

vanillina mg/L 

di (+)- cat. 

polifenoli 

totali mg/L di 

(+)- cat. 

acidi ICT 

Acido caffeico 

mg/L 

31,44 31,12 35,5 34,66 31,2 30,4 36,68 36,3 31,16 30,44 

575,784 578,721 577,452 578,325 575,859 577,742 576,473 577,965 576,482 578,281 

88,66 77,49 84,65 77,10 87,60 80,79 86,50 78,72 86,18 80,39 

10,75 18,89 14,85 20,20 11,29 16,59 12,65 17,74 12,59 16,81 

0,188 0,316 0,241 0,337 0,198 0,284 0,217 0,304 0,217 0,281 

29,66 33,73 31,41 32,57 36,06 29,08 27,34 36,06 28,50 32,57 

199,56 195,08 208,88 198,06 202,17 189,11 209,63 210,00 196,20 192,10 

35,56 38,44 37,11 38,78 36,00 37,00 36,67 40,78 34,33 39,00 

1

ANALISI DEI VINI PROVA MS (Tabella 4) 

analisi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 

acido tartarico 

g/L 

acido malico 

g/L 

acido lattico 

g/L 

acetaldeide 

mg/L 

1 

2,10 2,25 2,04 2,18 2,13 2,21 1,98 2,09 1,96 2,21 

1,93 2,28 2,01 2,42 1,83 2,18 2,07 2,46 1,97 2,37 

0,07 0,04 0,04 0,05 0,13 0,17 0,06 0,06 0,13 0,12 

34 19 29 22 30 19 34 21 33 18 

glicerina g/L 6,1 7,6 6,6 7,2 6,8 7,9 7 7,5 6,9 8,1 

ANALISI STATISTICA DEI COMPOSTI VOLATILI (MQ+MS) (Tabella 5) 

UVA 

MQ MS 

Numero di dati 20 10 10 

media dev.st. media dev.st. 

isoamil acetato ** 4161 1626 1285 698 

esil acetato ** 309 113 87 40 

2-fenil acetato ns 797 368 619 256 

S Acetati ** 5266 1988 1996 591 

Acido acetico (g/L) ** 0,171 0,021 0,614 0,052 

(S Acetati/Ac. Acetico) x 10 -3 ** 31 11 3 1 

etil C6 ** 790 126 372 193 

etil C8 ** 963 184 450 215 

etil C10 ** 276 67 129 60 

S Esteri etilici ** 2030 374 951 463 

C6 ** 4860 676 1990 859 

C8 ** 9606 1457 3714 1685 

C10 ** 3066 561 1386 492 

S Acidi grassi ** 17532 2664 7090 2998 

S Esteri etilici/S Acidi grassi ** 0,115 0,007 0,131 0,013 

C4 ** 124 24 60 33 

C12 ** 121 33 52 29 

alcol isoamilico ** 140647 16411 106292 14639 

1-pentanolo ** 35 6 43 5 

esanolo ns 1515 214 1402 75 

alcol benzilico ** 37 34 10 7

ANALISI STATISTICA DEI COMPOSTI VOLATILI (MQ+MS) (Tabella 5) 

UVA 

2-feniletanolo ns 31435 8601 27011 8593 

etil lattato ns 288 152 531 347 

etil-3-OH-butirrato ** 93 35 41 44 

benzaldeide ns 29 10 28 36 

dietil succinato ns 60 25 56 13 

3-metil-tiopropanolo ** 131 33 80 50 

etil-4-OH-butirrato ns 733 332 1497 1137 

N-(3-metil-butilacetamide) ** 153 26 1001 671 

monoetilsuccinato ns 894 1136 338 113 

Alcol % vol ** 11,56 0,18 13,51 0,08 

densità 20°C ** 0,99314 0,00047 0,99427 0,00094 

estratto totale g/L ** 21,9 0,7 30,7 2,3 

pH ** 3,33 0,05 3,44 0,07 

acidità volatile g/L ** 0,17 0,02 0,61 0,05 

acidità titolabile g/L ns 6,64 0,61 7,02 0,57 

SO 2 totale mg/L ns 28 8 34 5 

l dominante (P.O. 1cm) ** 575,09 0,82 577,31 1,08 

luminosità y% (P.O. 1cm) ** 96,12 1,07 82,81 4,38 

saturazione P% (P.O. 1cm) ** 5,68 0,34 15,24 3,30 

abs 420 nm (P.O. 1cm) ** 0,083 0,006 0,258 0,053 

flavani vanillina mg/L di (+)- cat. ** 50 8 32 3 

polifenoli totali mg/L di (+)- cat. ** 183 7 200 7 

acidi ICT Acido caffeico mg/L ** 35,4 0,9 37,4 1,9 

acido malico g/L ** 2,5 0,2 2,2 0,2 

acido lattico g/L ** 0,02 0,01 0,09 0,05 

acetaldeide mg/L ** 15,3 4,7 25,9 6,7 

glicerina g/L ** 5,8 0,6 7,2 0,6 

1

LIEVITO (Tabella 6) 

PROVA MQ+MS S6U AT1 



isoamil acetato ns 2957 1366 2489 2394 

esil acetato ns 205 114 191 170 

2-fenil acetato ** 540 248 875 308 

Acetati ns 3708 1655 3555 2737 

Acido acetico (g/L) ns 0,379 0,223 0,406 0,249 

( Acetati/Ac. Acetico) x 10-3 ns 17 15 17 18 

etil C6 ns 675 159 487 324 

etil C8 ns 817 224 596 386 

etil C10 ns 229 73 176 115 

Esteri etilici ns 1721 453 1259 823 

C6 ns 3871 1258 2979 1935 

C8 ns 7613 2677 5707 3881 

C10 ns 2446 792 2006 1179 

Acidi grassi ns 13931 4719 10691 6969 

Esteri etilici/ Acidi grassi ns 0,127 0,015 0,119 0,008 

C4 ns 109 31 75 47 

C12 ns 77 49 96 45 

alcol isoamilico ns 125814 19680 121125 27199 

1-pentanolo ns 40 5 38 8 

esanolo ns 1464 146 1453 193 

alcol benzilico ns 30 32 17 22 






3-metil-tiopropanolo ns 97 55 115 43 


N-(3-metil-butilacetamide) ns 841 736 312 391 


Alcol % vol ns 12,48 1,11 12,59 0,95 

densità 20°C ns 0,99350 0,00028 0,99391 0,00128 

estratto totale g/L ns 25,6 3,4 27,0 6,0 

pH ** 3,34 0,07 3,43 0,08 

acidità volatile g/L ns 0,38 0,22 0,41 0,25 

acidità titolabile g/L ** 7,36 0,31 6,30 0,23 

SO2 totale mg/L ** 27 7 35 3 

dominante (P.O. 1cm) ** 576,95 1,44 575,45 1,12 

luminosità y% (P.O. 1cm) ns 87,19 8,82 91,73 5,43 

saturazione P% (P.O. 1cm) ns 11,88 6,59 9,04 3,72 

abs 420 nm (P.O. 1cm) ns 0,195 0,117 0,147 0,071 

flavani vanillina mg/L di (+)- cat. ns 41 10 40 13 

polifenoli totali mg/L di (+)- cat. ns 190 10 192 13 

acidi ICT Acido caffeico mg/L ns 36,9 2,3 35,9 0,9 


acido lattico g/L ns 0,06 0,05 0,05 0,05 

acetaldeide mg/L ns 19,5 2,3 21,7 11,0 

glicerina g/L ** 7,0 0,7 6,0 0,8 

1

(Tabella 7) 

PROVA (MQ+MS) NO 

OSSIGENO 

SI 






S Acetati ns 3629 2398 3634 2034 


(S Acetati/Ac. Acetico) x 10-3 ns 17 17 17 15 

etil C6 ns 572 286 596 254 

etil C8 ns 688 352 734 309 

etil C10 ns 202 111 203 81 

S Esteri etilici ns 1462 746 1533 640 

C6 ns 3364 1751 3517 1608 

C8 ns 6548 3579 6827 3317 

C10 ns 2191 1125 2279 858 

S Acidi grassi ns 12103 6437 12623 5768 

S Esteri etilici/S Acidi grassi ns 0,122 0,014 0,124 0,012 

C4 ns 94 50 89 32 

C12 ns 90 48 80 47 



esanolo ns 1436 180 1492 150 











Alcol % vol ns 12,54 1,03 12,52 1,05 

densità 20°C ns 0,99368 0,00094 0,99374 0,00096 


pH ns 3,39 0,08 3,39 0,09 



SO totale mg/L 2 

l dominante (P.O. 1cm) 

ns 

ns 

31 

576,25 

7 

1,52 

31 

576,13 

8 

1,49 



abs 420 nm (P.O. 1cm) ns 0,171 0,103 0,170 0,095 




acido malico g/L ns 2,3 0,3 2,4 0,3 



glicerina g/L ns 6,4 1,0 6,7 0,9 

1

(Tabella 8) 

PROVA (MQ+MS) AZOTO 

SI NO 






S Acetati ns 3958 2585 3141 1487 


(S Acetati/Ac. Acetico) x 10-3 ns 19 19 14 12 

etil C6 ns 579 272 584 277 

etil C8 ns 691 340 729 330 

etil C10 ns 196 104 212 94 


C6 ns 3410 1698 3448 1700 

C8 ns 6571 3468 6794 3499 

C10 ns 2184 1045 2289 1004 



C4 ns 95 40 88 48 

C12 ns 75 40 103 52 



esanolo ns 1434 185 1495 137 


2-feniletanolo ** 23191 4517 38270 4006 

etil lattato ** 524 324 239 75 








Alcol % vol ns 12,52 1,02 12,55 1,06 

densità 20°C ns 0,99377 0,00094 0,99360 0,00095 


pH ns 3,36 0,08 3,43 0,07 



SO2 totale mg/L ns 30 7 32 7 

l dominante (P.O. 1cm) ns 576,13 1,50 576,31 1,52 



abs 420 nm (P.O. 1cm) ns 0,165 0,093 0,179 0,109 








20

(Tabella 9) 

PROVA (MQ+MS) CaPANTOTENATO 

SI NO 






S Acetati ns 4428 3179 3432 1978 


(S Acetati/Ac. Acetico) x 10 -3 ns 21 23 16 15 

etil C6 ns 619 356 572 253 

etil C8 ns 760 432 693 313 

etil C10 ns 229 138 196 89 


C6 ns 3756 2177 3342 1574 

C8 ns 7340 4394 6490 3246 

C10 ns 2518 1447 2153 910 



C4 ns 108 51 88 41 

C12 ns 83 40 87 49 



esanolo ns 1324 117 1492 162 


2-feniletanolo ** 20637 1203 31369 8387 









Alcol % vol ns 12,60 1,09 12,52 1,02 

densità 20°C ns 0,99349 0,00069 0,99376 0,00099 


pH ns 3,39 0,07 3,39 0,09 







abs 420 nm (P.O. 1cm) ns 0,164 0,115 0,172 0,096 








21

ANALISI STATISTICA DEI COMPOSTI VOLATILI (Tabella 10) 

PROVA MQ LIEVITO 

S6U AT1 






S Acetati ns 4974 1458 5559 2561 



etil C6 ns 799 135 782 132 

etil C8 ns 991 180 936 205 

etil C10 ns 278 71 274 72 


C6 ns 4957 777 4763 635 

C8 ns 9973 1427 9239 1549 

C10 ns 3128 441 3004 709 



C4 ns 131 27 116 19 

C12 ns 113 39 129 29 


1-pentanolo ** 39 6 31 2 

esanolo ns 1545 173 1484 266 











Alcol % vol ** 11,43 0,17 11,69 0,04 

densità 20°C ** 0,99350 0,00040 0,99277 0,00006 


pH ** 3,30 0,05 3,37 0,04 



SO 2 totale mg/L ** 22 4 35 3 




abs 420 nm (P.O. 1cm) ns 0,085 0,007 0,081 0,002 







glicerina g/L ** 6,4 0,3 5,2 0,3 

22

(Tabella 11) 

PROVA MQ OSSIGENO 

NO SI 






S Acetati ns 5285 2378 5239 1561 



etil C6 ns 787 153 796 93 

etil C8 ns 944 227 992 119 

etil C10 ns 281 82 267 47 


C6 ns 4826 833 4912 459 

C8 ns 9518 1813 9739 921 

C10 ns 3092 709 3027 318 



C4 ns 129 29 116 10 

C12 ns 127 38 110 27 



esanolo ns 1470 242 1581 174 











Alcol % vol ns 11,57 0,21 11,54 0,15 

densità 20°C ns 0,99313 0,00055 0,99314 0,00039 


pH ns 3,33 0,06 3,34 0,05 







abs 420 nm (P.O. 1cm) ns 0,081 0,006 0,086 0,005 








23

(Tabella 12) 

PROVA MQ Tabella 12 AZOTO 

SI NO 






S Acetati ns 5880 2379 4346 741 



etil C6 ns 787 156 796 83 

etil C8 ns 951 233 982 101 

etil C10 ns 275 80 277 53 


C6 ns 4841 875 4889 310 

C8 ns 9511 1870 9750 702 

C10 ns 3043 729 3100 233 



C4 ns 126 18 120 33 

C12 ns 106 23 143 37 



esanolo ns 1480 262 1566 133 


2-feniletanolo ** 25871 5008 39779 5037 









Alcol % vol ns 11,55 0,22 11,57 0,13 

densità 20°C ns 0,99322 0,00055 0,99301 0,00034 


pH ns 3,31 0,05 3,37 0,04 







abs 420 nm (P.O. 1cm) ns 0,083 0,006 0,084 0,005 








24

(Tabella 13) 

PROVA MQ CaPANTOTENATO 

SI NO 






S Acetati ns 6925 2281 4852 1832 



etil C6 ns 901 37 763 126 

etil C8 ns 1111 22 926 189 

etil C10 ns 343 40 259 63 


C6 ns 5561 47 4685 642 

C8 ns 11010 56 9255 1422 

C10 ns 3728 323 2900 482 



C4 ns 144 7 118 24 

C12 ns 106 46 124 33 



esanolo ns 1305 198 1567 194 











Alcol % vol ns 11,66 0,13 11,53 0,19 

densità 20°C ns 0,99305 0,00035 0,99316 0,00051 


pH ns 3,35 0,04 3,33 0,06 







abs 420 nm (P.O. 1cm) ** 0,076 0,002 0,085 0,004 








2

(Tabella 14) 

PROVA MS LIEVITO 

S6U AT1 



isoamil acetato ** 1890 92 681 417 


2-fenil acetato ** 435 102 802 230 

S Acetati ** 2442 172 1550 509 


(S Acetati/Ac. Acetico) x 10 -3 ** 4 0 2 1 

etil C6 ** 552 26 193 47 

etil C8 ** 643 71 256 68 

etil C10 ** 180 30 78 27 

S Esteri etilici ** 1375 120 527 136 

C6 ** 2786 113 1194 252 

C8 ** 5254 403 2174 543 

C10 ** 1765 238 1007 361 

S Acidi grassi ** 9804 740 4375 1122 

S Esteri etilici/S Acidi grassi ** 0,140 0,007 0,121 0,009 

C4 ** 87 13 34 21 

C12 ns 41 24 63 31 



esanolo ns 1383 36 1422 102 









N-(3-metil-butilacetamide) ** 1535 130 467 533 

monoetilsuccinato ** 416 60 260 101 

Alcol % vol ns 13,53 0,06 13,49 0,09 

densità 20°C ** 0,99350 0,00016 0,99504 0,00068 


pH ** 3,39 0,06 3,50 0,03 






saturazione P% (P.O. 1cm) ** 18,04 1,51 12,43 1,59 

abs 420 nm (P.O. 1cm) ** 0,304 0,023 0,212 0,020 







glicerina g/L ** 7,7 0,4 6,7 0,4 

2

(Tabella 15) 

PROVA MS OSSIGENO 

NO SI 






S Acetati ns 1974 644 2030 593 



etil C6 ns 357 214 395 184 

etil C8 ns 432 251 476 177 

etil C10 ns 122 71 139 47 


C6 ns 1902 960 2122 798 

C8 ns 3579 1930 3916 1488 

C10 ns 1289 578 1531 351 



C4 ns 59 40 63 21 

C12 ns 53 17 50 45 



esanolo ns 1401 97 1404 33 











Alcol % vol ns 13,51 0,09 13,50 0,07 

densità 20°C ns 0,99423 0,00097 0,99434 0,00102 


pH ns 3,44 0,07 3,44 0,08 







abs 420 nm (P.O. 1cm) ns 0,261 0,062 0,255 0,045 








2

PROVA MS AZOTO 

SI NO 




esil acetato ** 107 23 57 43 


S Acetati ns 2036 424 1936 860 

Acido acetico (g/L) ** 0,585 0,015 0,658 0,059 

(S Acetati/Ac. Acetico) x 10-3 (Tabella 16) 

ns 3 1 3 2 

etil C6 ns 372 187 373 230 

etil C8 ns 432 194 477 272 

etil C10 ns 117 47 147 80 


C6 ns 1979 813 2007 1054 

C8 ns 3631 1491 3839 2185 

C10 ns 1325 317 1477 736 



C4 ns 64 30 56 40 

C12 ns 44 27 64 31 


1-pentanolo ** 45 5 39 1 

esanolo ns 1388 41 1424 114 


2-feniletanolo ** 20511 1603 36761 2449 

etil lattato ** 710 347 263 17 








Alcol % vol ns 13,49 0,07 13,53 0,09 

densità 20°C ns 0,99433 0,00096 0,99419 0,00104 


pH ns 3,41 0,07 3,49 0,05 

acidità volatile g/L ** 0,59 0,02 0,66 0,06 


SO totale mg/L 2 

l dominante (P.O. 1cm) 

ns 

ns 

33 

577,14 

6 

1,27 

35 

577,55 

4 

0,80 



abs 420 nm (P.O. 1cm) ns 0,247 0,053 0,275 0,055 


polifenoli totali mg/L di (+)- cat. ** 196 5 207 6 



acido lattico g/L ** 0,11 0,05 0,05 0,01 



2

(Tabella 17) 

PROVA MS CaPANTOTENATO 

SI NO 






S Acetati ns 1931 417 2012 650 



etil C6 ns 337 247 381 196 

etil C8 ns 409 255 460 222 

etil C10 ns 116 64 132 63 


C6 ns 1950 1088 2000 882 

C8 ns 3669 2009 3725 1753 

C10 ns 1308 567 1406 513 



C4 ns 72 51 58 31 

C12 ns 59 19 50 32 



esanolo ns 1342 19 1417 77 











Alcol % vol ns 13,54 0,08 13,50 0,08 

densità 20°C ns 0,99393 0,00074 0,99436 0,00100 


pH ns 3,42 0,08 3,45 0,07 







abs 420 nm (P.O. 1cm) ns 0,252 0,091 0,260 0,049 








2

(Tabella 18) 

SCHEMA RIASSUNTIVO DELLE SIGNIFICATIVITA’ STATISTICAMENTE ACCERTATE 

Mosto di 

Calcio 

Composti 

Lievito Ossigeno Azoto 

partenza 

Pantotenato 

30 

MQ MS uvarum cerevisiae si no si no si no 

2-fenil acetato n.s. n.s. + - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

∑ Acetati + - + - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

(∑ Acetati/Ac. 

Acetico)x10 -3 - + + - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

∑ esteri etilici + - + - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

∑ Acidi grassi + - + - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

(∑ esteri etilici/acidi 

grassi) 

- + + - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

2-feniletanolo n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. - - - 

etil-3-OH-butirrato + - + + - - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

etil-4-OH-butirrato n.s. n.s. + + - - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

anidride solforosa 

totale 

+ + 

+ 

n.s. n.s. - - + + n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

acidità titolabile n.s. n.s. + + + - - - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

acido malico + - + + + - - - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

acido acetico - + - + n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

glicerina - + + + + - - - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 

Legenda colori: ● = generale (MQ+MS); ● = MQ (Malvasia di Qualità); ● = MS (malvasia 

Standard); 

Legenda valori: + = maggiore produttore; - = minore produttore; = statisticamente non 

significativo , tendenza concordante.

Figura n. 1 

31

commento dei risultati 

Analizzando la letteratura riguardante il controllo del metabolismo del lievito, appare evidente come la 

stessa ci conceda una notevole quantità di prove in cui la visione d’assieme è sempre molto limitata e i 

trattamenti, effettuati in condizioni particolari, spesso risultano difficilmente riproducibili. Il significato 

di queste prove, dunque, può essere ricondotto al valore di tendenza metabolica, appare, però, difficile 

individuare la dinamica dei fenomeni biochimici che interessano il metabolismo della cellula del lievito 

nel corso della fermentazione. 

Infatti, nonostante i numerosi progressi realizzati in cantina (controllo della temperatura, ecc.), si può 

considerare che la gestione della fermentazione è ancora lungi dall’essere ottimizzata. In effetti, un dato 

fondamentale in enologia è raramente preso in considerazione, ed in modo impreciso: la variabilità 

della materia prima.Il monitoraggio in linea della cinetica fermentativa (per ora ancora una utopia) può 

servire non solo a migliorare il controllo dell’andamento delle fermentazioni, ma anche, e soprattutto, a 

“pilotarne” il controllo. Questa nozione di pilotaggio consiste nell’adattare gli interventi (temperatura, 

aggiunte di nutrienti …) in funzione dello svolgimento della fermentazione. A breve o medio termine, 

consisterà anche in anticipare, grazie ad una predizione (modellizzazione) dell’andamento fermentativo 

e nel prendere in considerazione non solo i criteri tecnologici (completamento delle fermentazioni, 

consumo di frigorie…) ma anche criteri più qualitativi. 

Come riportato in premessa, abbiamo notizie precise sulla funzione dell’azoto come acceleratore 

del metabolismo cellulare e dell’accresciuto assorbimento e metabolismo degli zuccheri, come pure 

dell’azione dell’ossigeno sulla futura probabile evoluzione della componente polifenolica del mezzo, 

dell’azione del calcio-pantotenato quale regolatore, in caso di carenza, del processo di biosintesi delle 

molecole a partire da acetato. Abbiamo pure ben chiare le differenze metaboliche legate alle due tipologie 

di metabolismo riconducibili all’espressione fenotipica “uvarum” e a quello di tipo “cerevisiae”(Garof 

olo,Ciolfi, Lo Scalzo,1995). 

Nel caso della presente indagine, si è voluto allestire un esperimento complesso, impiegando mezzi 

differenti e trattamenti differenti al fine di individuare le rispondenze metaboliche che potessero 

comportare una più puntuale considerazione sull’impiego di lieviti in riferimento alla tipologia di vino 

laziale soprattutto per ciò che attiene alla componente fissa (acidità) e aromatica di fermentazione, 

ovvero per quella componente che caratterizza la corposità, la persistenza la finezza delle sensazioni 

olfatto-gustative. 

Nello specifico, un obiettivo importante è stato quello di valutare il significato della presenza di glicerina 

e di come fosse possibile ottenere il massimo della sua espressione nei vini. 

I due tipi di mosto oggetto della sperimentazione MS e MQ , si tratta della stessa uva in differenti 

condizioni di stato in cui l’elemento discriminante è dato dal diverso contenuto in acido acetico iniziale 

(acidità volatile pari a 0,16 per MQ e 0,92 per MS), ed è questo il principale fattore di regolamentazione 

della sintesi dei composti metabolici. 

Da un punto di vista statistico, il test di significatività è stato applicato su tutti i trattamenti per evidenziare 

l’incidenza del mezzo (MQ,MS) tabella 5, l’incidenza del lievito (uvarum, cerevisiae) tabella 6, quindi 

rispettivamente di ossigeno tabella 7, azoto tabella 8, calcio-pantotenato tabella 9. 

I parametri statisticamente significati, infatti, risultano essere per la prova (MQ) una più consistente 

presenza di acetati, esteri etilici, acidi grassi, etil-3-OH-butirrato, acido malico. 

Per contro la seconda serie (MS) fa registrare differenze significative positive in merito agli indici di 

esterificazione, acetaldeide e glicerina. 

Questo diverso comportamento metabolico risulta facilmente riconducibile alla presenza, nel mezzo, di 

elevata concentrazione di acido acetico; questo, infatti, nel corso della fermentazione viene riassorbito 

dalla cellula come dimostra la sua concentrazione finale e va ad interferire con acetato di derivazione 

mitocondriale (fig.1). Elemento significativo è una maggiore concentrazione in glicerolo, è un fatto, 

32

questo, importante e da tenere in considerazione quando viene programmata la vendemmia. 

Dal punto di vista dei trattamenti, l’impiego di ossigeno nel corso della vinificazione non comporta alcun 

evento metabolico statisticamente significativo e, pertanto, non trova alcuna giustificazione pratica dal 

punto di vista metabolico per il lievito. 

In effetti la sintesi dei grassi di cui si era ipotizzato essere influenzata dall’ossigeno è regolata dal buon 

utilizzo di acetato intracellulare a sua volta mediato da micronutrienti di natura proteica che il lievito non 

è in grado di sintetizzare in anaerobiosi ma che è presente nel mosto fresco. 

L’impiego di Ca-pantotenato, può avere un effetto metabolico statisticamente significativo soltanto per 

la sintesi di 2-feniletanolo nel senso che la sua presenza comporta una minore produzione. 

Il fatto trova una giustificazione in quanto la disponibilità di una migliore utilizzazione di acetato 

intracellulare comporta un minor metabolismo di aminoacidi aromatici. Considerato che non è auspicabile 

una minore presenza di 2-feniletanolo nel mezzo, il Ca-pantotenato può essere impiegato soltanto in 

presenza di una evidente carenza. 

Una maggiore disponibilità di azoto sotto forma ammoniacale, quindi di immediata utilizzazione, comporta 

significativamente soltanto una minore produzione di 2-feniletanolo e parallelamente di acido acetico; 

infatti, la disponibilità di azoto prontamente assimilabile, da un lato comporta un minor metabolismo degli 

aminoacidi aromatici, dall’altro, un migliore utilizzo di acetato intracellulare soprattutto di derivazione 

mitocondriale venendo a ridursi quello di origine aminoacidico. Dai parametri riscontrati, si evidenzia, 

comunque, che pur non essendo significativa la differenza, il 2-feniletanolo in termini assoluti registra 

valori più bassi la dove è minore il contenuto in APA azoto facilmente assimilabile; in tal caso abbiamo 

una minori disponibilità aminoacidica così come prevedibile per la tesi 

MS. Per quest’ultima prova, infatti, la condizione di minore sanità delle 

uve ha comportato anche una minore disponibilità aminoacidica. 

Anche questo risultato evidenzia come l’impiego di azoto ammoniacale in 

fermentazione debba essere limitato soltanto ai casi di effettiva carenza; 

deficit azotati nei mosti naturali che non abbiano subito trattamenti 

di chiarifica spinti non hanno ragione di essere ed è bene ricordare, 

peraltro, che eccedere in trattamenti di chiarifica può comportare gravi 

problemi di fermentazione e produzioni eccessive di acido acetico per un 

impoverimento del mezzo delle frazioni azotate a peso molecolare basso 

quali gli aminoacidi e i piccoli peptidi assimilabili dal lievito. 

Prove sperimentali, infatti, hanno dimostrato che un eccessivo 

impoverimento della frazione azotata può causare rallentamenti ed arresti 

di fermentazione e il fenomeno è legato soprattutto all’asportazione di 

micronutrienti proteici responsabili del controllo metabolico della cellula, 

micronutrienti che, in condizioni di anaerobiosi, il lievito non è in grado di 

sintetizzare. 

E’ vero che la somministrazione di azoto ammoniacale comporta una 

accelerazione del metabolismo degli zuccheri e quindi della fermentazione, 

a questo fatto, però, non corrisponde un metabolismo di migliore qualità nel 

precostituire un vino ottimale e rispettoso dell’ambiente di produzione. 

Vediamo, ora, i riscontri metabolici statisticamente significativi quando 

mettiamo a confronto i due lieviti nell’insieme delle prove e riscontriamo 

che cerevisiae si caratterizza per la maggiore produzione di acetati, solfiti, 

acidità volatile, così come nelle aspettative, mentre uvarum si caratterizza 

per una maggiore produzione di etile-3-OH- butirrato, acido malico, ma 

anche fa registrare un valore di acidità titolabile superiore e di glicerina 

dell’ordine di 1 g/L e anche più. Questi fati evidenziano il vantaggio 

33

compositivo di un fermentato da uvarum piuttosto che da cerevisiae soprattutto in relazione ad una 

componente acidica di maggiore complessità e di glicerina che conferisce corposità e rotondità. 

Per quanto riguarda la seconda serie di prove, in aggiunta alla significatività di cui ai metabolici elencati 

per la prima prova, constatiamo, per uvarum, una maggiore produzione di esteri, acidi grassi e relativi 

rapporti di esterificazione. Del perché di questo comportamento rispetto alla prima serie risiede in una 

maggiore disponibilità di acetato intracellulare di cui si è parlato precedentemente. 

Alla fine del ciclo produttivo, i vini finiti sono stati sottoposti all’analisi sensoriale . 

Nel sottoporre i vini a questa analisi si è voluto valutare se tra i campioni oggetto di studio ci fossero 

delle differenze e quali risultassero i più apprezzati. 

E’ stato così possibile confrontare l’aspetto globale di ciascun vino (aspetto visivo, olfattivo e gustativo) 

e sull’ eventuale gradimento da parte del consumatore. A tale riguardo è stato utilizzato il test di Kramer 

o test dell’ordinamento, il quale prevede che i degustatori siano chiamati a ordinare in successione 

decrescente, dal più gradito al meno gradito, tutti i campioni sottoposti ad analisi. 

Il panel era formato da 12 degustatori esperti ai quali sono stati sottoposti i campioni in forma anonima, 

ed è stato chiesto loro di ordinare secondo la metodica già descritta tali campioni. Le analisi dei risultati 

sono state poi elaborate utilizzando la tabella del test di Kramer (Ubigli, 2004). Dall’elaborazione di tali 

dati è emerso che i campioni che hanno riscosso maggior gradimento, presentano differenze sensoriali 

statisticamente significative: 

Prova MQ 

Al primo posto il vino n°2 (ottenuto dal trattamento con lievito S6U, senza aggiunta di ossigeno e con 

aggiunta di azoto e calcio pantotenato); 

al secondo posto il vino n°5 (ottenuto dal trattamento con lievito AT1, senza aggiunta di ossigeno e calcio 

pantotenato, con aggiunta di azoto). 

Prova MS 

Al primo posto il vino n°5 (ottenuto dal trattamento con lievito AT1, senza aggiunta di ossigeno e calcio 

pantotenato, con aggiunta di azoto); 

al secondo posto il vino n°4 (ottenuto dal trattamento con lievito S6U, senza aggiunta di ossigeno, calcio 

pantotenato e azoto). 

Nel corso delle prove, come si evince dalla trattazione, abbiamo rilevato un elevato numero di parametri 

che vengono proposti per una analisi più particolare da opera del tecnico o dello studioso. Volendo 

fornire un giudizio sintetico e riepilogativo, si può affermare come il lievito S6U sia da preferire in ogni 

fermentazione e questo perché maggiormente rispondente alla tipicità del vino per i seguenti motivi: 

- contribuisce a mantenere alto il valore di acidità totale e questo rappresenta una garanzia di 

stabilità strutturale del vino; 

- produce, in ogni condizione, valori di glicerina più elevati, quindi il vino assume connotati di 

corposità che esaltano il rapporto con il territorio; 

- una minore produzione di solfiti agevola un razionale impiego a fine fermentazione e determina 

una migliore compatibilità ambientale. 

Da un punto di vista dei trattamenti si evidenzia che: 

- l’impiego di ossigeno nel corso della fermentazione risulta ininfluente ai fini del risultato 

metabolico della cellula di lievito; 

- l’impiego di azoto va limitato soltanto ai casi di effettivo impoverimento del mezzo, casi rarissimi 

nelle condizioni di una razionale enotecnica che non deve prevedere eccessi di chiarifica. Spesso, 

infatti si tende ad addizionare azoto ammoniacale nell’intendo di prevenire rallentamenti o arresti 

di fermentazione. In realtà questi accidenti o sono conseguenza di inibitori non rimossi o sono la 

causa di trattamenti deproteinizzanti troppo spinti. Al riguardo si evidenzia come l’impiego di azoto 

ammoniacale deprima le qualità tipiche dell’uva poiché rallenta il metabolismo degli aminoacidi 

e peptidi del mezzo; ne consegue che la maggiore tipicità del prodotto va perseguita attraverso 

opportune tecniche colturali volte proprio alla migliore espressione del metabolismo variatale. 

34

Aspetti fermentativi: 

FERMENTAZIONI SCALARI CON IMPIEGO DI DUE CEPPI SACCHAROMYCES CEREVISIAEE 

CON CARATTERISTICHE METABOLICHE DIFFERENTI. 

Introduzione 

Il ruolo che i lieviti enologici svolgono nel corso della fermentazione alcolica è sicuramente 

fondamentale per la buona riuscita della stessa e dei prodotti metabolici che vengono elaborati a seguito 

della trasformazione degli zuccheri in alcol; prodotti, responsabili delle caratteristiche organolettiche e 

sensoriali dei vini ottenuti. 

Certamente l’utilizzo di ceppi di lievito selezionati ad uso enologico, possono contribuire a dare 

un’impronta al vino e alla sua definizione qualitativa, anche se l’apporto primario nella composizione 

enochimica del vino rimane quello dato dal vitigno e dalla qualità dell’uva. 

Negli ultimi tempi la ricerca ha posto una grande attenzione alla selezione e studio dei diversi ceppi 

di lievito aventi caratteristiche enologiche, anche in funzione dei metaboliti che essi sono in grado di 

produrre nel corso della loro applicazione in fermentazione. 

Questo lavoro di ricerca ha avuto come fine quello testare e verificare la possibilità di indurre la 

produzione di elevati quantitativi di metaboliti nel corso della fermentazione alcolica impiegando lieviti 

differenti per tipologia di metabolismo ipotizzando una interazione tale da consentire il rafforzamento 

delle reciproche peculiarità. 

Infatti, numerose sono state le prove sperimentali in tal senso impiegando, però, lieviti di specie diverse. 

Fra le tante prove eseguite si segnalano i risultati di Kurita (2008); l’Autore ha effettuato prove con 

l’impiego, in associazione, di Saccharomyces cerevisiae e Pichia anomala. Il risultato metabolico ha 

consentito di appurare come l’attività di sintesi di acetati è risultata potenziata in virtù della migliore 

predisposizione metabolica da parte di Picchia legata ad una attività esterasica cellulare di livello 

superiore. 

Per questo sono stati utilizzati due ceppi di lievito Saccharomyces cerevisiae: S6U, ibrido naturale con 

fenotipo della razza fisiologica uvarum e AT1 della razza cerevisie. 

Il primo si caratterizza per una elevata produzione di acidi grassi, glicerina, feniletanolo, migliore 

capacità esterosintetasi; il secondo per una elevata produzione di acetati. 

Uno dei parametri maggiormente significativi è rappresentato dal contenuto in glicerolo di un vino; anche 

su questo composto si sono concentrate attenzioni e studi volti ad esaltarne l’espressione metabolica. 

Materiali e metodi 

La prova è stata condotta presso il CRA-Unità di ricerca per le produzioni enologiche dell’Italia centrale 

(CRA-ENC) con sede in Velletri (Roma). 

Per l’eseguimento di questa ricerca è stata utilizzata uva di Malvasia del Lazio, raccolta a maturità 

fisiologica in data 02/10/07 e conferita nei locali della cantina sperimentale del CRA-ENC. Il raccolto, 

di circa 100 kg, è stato sottoposto alle operazioni di vinificazione che hanno contemplato in sequenza la 

fase di pigiadiraspatura e pressatura soffice, quest’ultima eseguita con idropressa a pressione crescente 

fino a 1bar. Sulla massa è stata fatta aggiunta di anidride solforosa in dose di 50 mg/L. Di seguito il 

mosto ha subito la fase di chiarifica prefermentativa, eseguita a temperatura di 6°C per 24 h senza ausilio 

di coadiuvanti di chiarifica. 

Le caratteristiche chimiche del mosto, dopo le fasi preliminari di pigiadiraspatura e pressatura, sono di 

seguito riportate in tabella 1. 

3

Analisi sul mosto di partenza (Tabella 1) 

Analisi sul mosto di partenza 

Zuccheri % 20,08 

pH 3,38 

Ac. Titolabile (g/L) 5,85 

APA (mg/L) 187 

Densità 21°C 1,0764 

Ac. Volatile (g/L) 0,16 

Trascorso tale tempo è stata eseguita la spillatura del mosto limpido e dopo omogeneizzazione della 

massa ottenuta, si è proceduto a ripartire 4 litri di mosto negli 8 fermentini oggetto di studio, della 

capacità di 5 litri cadauno. 

Le prove sono state contrassegnate e inoculate con lieviti selezionati seguendo lo schema riportato in 

tabella 2. 

Classificazione delle prove oggetto di studio (Tabella 2) 

Fermentino sigla lievito dose modalità prova 

1 1 S6U TQ S6U 20 g/hL prova in purezza 

2 1 BIS S6U TQ S6U 20 g/hL prova in purezza 

3 2 AT1 TQ AT1 80 ml del mosto di avviamento prova in purezza 

4 2 BIS AT1 TQ AT1 80 ml del mosto di avviamento prova in purezza 

5 3 S6U SCAL S6U 20 g/hL prova a ferm. scalare avviata con S6U 

6 3 BIS S6U SCAL S6U 20 g/hL prova a ferm. scalare avviata con S6U 

7 4 AT1 SCAL AT1 80 ml del mosto di avviamento prova a ferm. scalare avviata con AT1 

8 4 BIS AT1 SCAL AT1 80 ml del mosto di avviamento prova a ferm. scalare avviata con AT1 

La fase di fermentazione alcolica è stata avviata utilizzando 2 ceppi di lievito diversi, lievito S6U allo 

stato secco e lievito AT1 nelle dosi di 2,5 Milioni di cellule/mL circa. 

Per ciascuna prova, eseguita in doppio, è stato seguito un protocollo di vinificazione che ha previsto una 

gestione della temperatura controllata di vinificazione nel seguente modo: dall’inoculo del lievito fino 

al raggiungimento di un gradiente alcolico nel mosto di 4% vol. la temperatura di fermentazione è stata 

mantenuta costante a 25°C; quindi la temperatura è stata portata a 18°C fino alla svinatura. 

Le fermentazioni delle prove 1 S6U TQ, 1 BIS S6U TQ, 2 AT1 TQ, 2 BIS AT1 TQ, sono state condotte 

rispettivamente dai lieviti S6U e AT1 in purezza. 

Le prove 3 S6U SCAL e 3 BIS S6U SCAL sono state avviate alla fermentazione utilizzando lievito S6U. 

Al raggiungimento di 4 gradi alcolici il mosto è stato filtrato sterilmente (con cartuccia filtrante di 0,45 

micron e sotto cappa sterile) e di seguito reinoculato con il lievito AT1. 

Stesso procedimento è stato seguito per le prove 4 AT1 SCAL e 4 BIS AT1 SCAL, inoculate inizialmente 

con lievito AT1 e dopo aver raggiunto tenore alcolico di 4% vol. sono state filtrate sterilmente e reinoculate 

con lievito S6U. 

Su tutte le prove sono state eseguite analisi chimico-fisiche, secondo metodo ufficiale (Gazzetta Ufficiale 

delle Comunità europee L272/90 e Reg. CEE 2676/90), analisi dei composti volatili (Gianotti S., Di 

Stefano R., 1991). Le elaborazioni statistiche sono state eseguite utilizzando ANOVA semplice e Test 

di Tukey. 

3

Analisi chimico-fisiche sui vini (Tabella 3) 

analisi 

1 S6U 

TQ 

1 BIS S6U 

TQ 

2 AT1 

TQ 

2 BIS 

AT1 TQ 

3 S6U 

TQ 

3 BIS S6U 

TQ 

4 AT1 

TQ 

4 BIS 

AT1 TQ 

Alcol % vol 10,95 11,12 10,65 11,03 9,43 10,12 9,79 9,42 

densità 20°C 0,99700 0,99405 0,99555 0,9945 1,00350 0,99950 1,0014 1,00435 

estratto totale g/L 30,1 22,9 25,4 23,9 42,2 34,1 38 44,4 

estratto ridotto g/L 23,5 22,8 20 21,3 19,8 23,19 20,1 20,3 

zuccheri g/L 7,6 1,1 6,4 3,6 23,4 11,91 18,9 25,1 

pH 3,42 3,42 3,43 3,43 3,45 3,29 3,46 3,46 

acidità volatile g/L 0,32 0,28 0,2 0,19 0,70 0,34 0,76 0,7 

acidità titolabile g/L 6,60 6,75 6,18 6,3 5,64 6,80 5,79 5,88 

SO 2 totale mg/L 22,40 23,68 32 28,16 20,48 12,80 25,6 21,11 

l dominante (P.O. 

1cm) 

luminosità y% (P.O. 

1cm) 

saturazione P% (P.O. 

1cm) 

575,611 574,853 574,279 574,468 574,923 575,402 574,104 574,011 

96,16 96,80 97,27 97,11 96,36 95,48 97,17 96,94 

5,04 5,00 5,20 5,00 5,23 6,06 6,24 6,34 

abs 420 nm (P.O. 1cm) 0,071 0,071 0,075 0,072 0,085 0,097 0,089 0,092 

flavani vanillina mg/L di 

(+)- cat. 

polifenoli totali mg/L di 

(+)- cat. 

acidi ICT Acido caffeico 

mg/L 

54,67 52,93 47,11 51,76 26,75 25,59 31,99 30,24 

168,22 164,87 182,40 178,67 167,48 168,04 171,95 181,84 

33,67 33,89 34,33 34,78 44,33 47,56 45,56 45,89 

acido malico g/L 2,39 2,57 2,36 2,37 0 0,61 0 0 

acido lattico g/L 0,03 0,02 0,03 0,01 1,77 0,03 1,91 1,92 

acetaldeide mg/L 12 11 20 19 50 58 62 61 

glicerina g/L 5,6 5,8 4,8 5 5,3 5,7 5,6 5,8 

3

Analisi dei composti volatili (Tabella 4 ) 

COMPOSTI VOLATILI 1S6U TQ* 2AT1 TQ* 3S6U SCAL* 4AT1SCAL* 

isoamil acetato 3576 8244 1715 2155 

esil acetato 356 580 235 335 

2-fenil acetato 585 1984 427 643 

S Acetati 4517 10808 2377 3134 

Acido acetico (g/L) 0,30 0,20 0,52 0,73 

(S Acetati/Ac. Acetico) x 10 -3 15,19 55,61 5,50 4,32 

etil C6 695 859 418 452 

etil C8 959 875 514 505 

etil C10 199 159 158 172 

S Esteri etilici 1854 1893 1091 1129 

C6 4877 4426 3542 3021 

C8 10042 8841 7505 6816 

C10 2333 1895 2321 2271 

S Acidi grassi 17252 15161 13369 12108 

S Esteri etilici/S Acidi grassi 0,11 0,12 0,08 0,09 

C4 75 101 59 79 

C12 50 120 68 98 

alcol isoamilico 110539 120876 116090 110319 

1-pentanolo 36 30 32 30 

esanolo 1278 894 1162 1066 

alcol benzilico 66 9 26 35 

2-feniletanolo 29900 36950 27005 30972 

etil lattato 209 132 2103 5558 

acetoino 10 11 21 nd 

etil-3-OH-butirrato 31 28 33 34 

benzaldeide 26 21 25 24 

g-butirrolattone 15 16 14 nd 

dietil succinato 63 36 247 580 

3-metil-tiopropanolo 103 115 114 127 

etil-4-OH-butirrato 1870 582 401 588 

N-(3-metil-butilacetamide) 117 134 133 192 

monoetilsuccinato 720 198 6852 14752 

Nota: I dati riportati in tabella rappresentano la media ottenuta dalle due ripetizioni eseguite per ogni prova. 

(*) le prove 1S6U TQ e 2AT1 TQ sono state condotte utilizzando i ceppi di lievito indicati in purezza mentre le prove 

3 S6U SCAL e 4 AT1 SCAL sono state condotte dai rispettivi lieviti (fino al raggiungimento di 4 % alcol) ed in seguito 

reinoculate rispettivamente con AT1 e S6U così come descritto in materiali e metodi. 

3

Analisi statistica dei composti volatili (ANOVA a una via a=0,05) (Tabella 5) 

Risultati ANOVA a una via (a=0,05) 

LSD: lettera uguale gruppi omogenei 1S6u 2At1 3S6U SCAL 4At1 SCAL 

isoamil acetato ** a b a a 

esil acetato ** a b c a 

2-fenil acetato ** a b a a 

S Acetati ** a b a a 

Acido acetico (g/L) ** a a a,b b 

(S Acetati/Ac. Acetico) x 10 -3 ** a b a a 

etil C6 ** a b c c 

etil C8 ** a a b b 

etil C10 ns 

S Esteri etilici ** a a b b 

C6 ** a a b b 

C8 ** a b c c 

C10 ns 

S Acidi grassi ** a b c c 

S Esteri etilici/S Acidi grassi ** a b c d 

C4 ns 

C12 ns 

alcol isoamilico ns 

1-pentanolo ns 

esanolo ** a b a,c c 

alcol benzilico ns 

2-feniletanolo ns 

etil lattato ** a a a b 

etil-3-OH-butirrato ns 

benzaldeide ns 

g-butirrolattone ns 

dietil succinato ** a a a,b b 

3-metil-tiopropanolo ns 

etil-4-OH-butirrato ** a b b b 

N-(3-metil-butilacetamide) ns 

monoetilsuccinato ns 

glicerina g/L ** a b a a 

3

Analisi statistica dei composti volatili (Test di Tukey) (Tabella 6) 

Risultati ANOVA a una via (a=0,05) 

Tukey: lettera uguale gruppi omogenei 1S6u 2At1 3S6u SCAL 4At1 SCAL 

isoamil acetato ** a b a a 

esil acetato ** a b a a 

2-fenil acetato ** a b a a 

S Acetati ** a b a a 

Acido acetico (g/L) ** a,b a a,b b 

(S Acetati/Ac. Acetico) x 10 -3 ** a b a a 

etil C6 ** a b c c 

etil C8 ** a a b b 

etil C10 ns 

S Esteri etilici ** a a b b 

C6 ** a a b b 

C8 ** a b c c 

C10 ns 

S Acidi grassi ** a a,b b,c c 

S Esteri etilici/S Acidi grassi ** a b c a,c 

C4 ns 

C12 ns 

alcol isoamilico ns 

1-pentanolo ns 

esanolo ** a b a a,b 

alcol benzilico ns 

2-feniletanolo ns 

etil lattato ** a a a,b b 

etil-3-OH-butirrato ns 

benzaldeide ns 

g-butirrolattone ns 

dietil succinato ** a a a,b b 

3-metil-tiopropanolo ns 

etil-4-OH-butirrato ** a b b b 

N-(3-metil-butilacetamide) ns 

monoetilsuccinato ns 

glicerina g/L ** a b a,b a 

40

Risultati e discussione 

In tabella 3 e 4 sono riportati i dati reali riscontrati nei vini; in tabella 4 e 5 vengono riportate le 

elaborazioni statistiche degli stessi. 

Dai risultati appare evidente come le caratteristiche metaboliche dei due lieviti in purezza risultino 

confermate in relazione alle aspettative; si pone l’accento sul fatto che la razza fisiologica cerevisiae 

produce maggiori quantitativi di acetati e minor contenuto in acidi grassi come pure un minor contenuto 

in glicerina. 

Nel caso di fermentazioni scalari, si evidenzia come i principali metaboliti si riscontrino in concentrazioni 

inferiori rispetto alle fermentazioni in purezza in quanto l’attività di riassorbimento cellulare comprime 

la sintesi dei composti metabolici e comprime, per conseguenza, anche la capacità esterosintetasi: questo 

fatto vale sia quando ad avviare la fermentazione sia la razza cerevisiae, sia con la razza uvarum , per 

contro i due fermentati tendono ad essere indistinti. 

Questo comportamento può essere dovuto in parte ad un impoverimento del livello nutrizionale del 

mosto, ma è soprattutto legato agli equilibri delle reazioni enzimatiche endocellulari quando, nella fase 

di crescita del lievito ad avvio della fermentazione, risulta prevalente l’assorbimento dei metaboliti dal 

mezzo. 

Per i motivi di cui abbiamo discusso, appare evidente come la condotta delle fermentazioni debba 

essere operata da un solo lievito al fine di poter ottenere il migliore risultato metabolico possibile e 

che, nel corso di fermentazioni scalari, il risultato metabolico complessivo non può essere considerato 

come il rafforzativo delle singole peculiarità ma, bensì, come l’appiattimento delle specifiche tendenze 

metaboliche. 

Questo fatto appare importante soprattutto quando si vogliono esaltare le qualità compositive del mosto 

di partenza, quindi delle uve e dell’ambiente di provenienza. 

Dall’analisi bibliografica si evince come, recentemente, Berovic e Herga (2007) asseriscono che un 

inoculo di lievito sottoposto a shock termico da 18°C a 45°C per 20 minuti raggiunti in 5 minuti, causa 

un incremento di glicerina nel corso della fermentazione alcolica del 74% . 

Questo risultato si conseguirebbe in quanto l’innalzamento termico determina, nella cellula, una abnorme 

espressione di triosofosfato isomerasi persistente durante la fermentazione a giudizio degli Autori; per 

conseguenza risulterebbe incrementata la conversione di diossiacetone fosfato in glicerolo. 

Per verificare tale ipotesi, abbiamo allestito diverse prove sperimentali nelle stesse condizioni operative 

dettate dagli Autori e impiegando anche dosi di lievito inoculo differenti a partire da quella impiegata 

nell’esperimento, sia allo stato secco che fresco senza riscontrare, però, alcuna variazione nella 

concentrazione di glicerolo a fine fermentazione e impiegando due stipiti di lievito differenti (AT1 allo 

stato fresco e S6U allo stato secco). 

41

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42

nuovi approcci per la tipizzazione molecolare di lieviti di interesse 

enologico 

Responsabile: Prof. claudio Falcone * 

Partecipanti alla ricerca: dr.ssa Maria Luisa Sponziello 

* Prof. Claudio Falcone 

TEL: (39) 0649912278 

FAX: (39) 0649912256 

E-MAIL: claudio.falcone@uniroma1.it 

dr. Michele Saliola 

43

Tipizzazione molecolare di lieviti saccharomyces di interesse enologico 

PREMESSA 

L’identificazione della composizione della flora dei lieviti all’interno del mosto si rende necessaria 

per il miglioramento delle caratteristiche qualitative del vino. Tradizionalmente, l’identificazione e 

la caratterizzazione di specie di lievito e di specifici ceppi all’interno della stessa specie si basavano 

sull’analisi di tratti morfologici e soprattutto sulle loro caratteristiche fisiologiche specifiche. 

Queste caratteristiche sono però fortemente influenzate dalle condizioni di coltura e possono produrre 

risultati incerti e talvolta non corretti. 

Recentemente sono state sviluppate numerose tecniche molecolari innovative che costituiscono validi 

metodi alternativi in grado di mettere in risalto la diversità genetica dei ceppi (Kellis et al.,2003; Richard 

e Dujon 2006; Schuller et al., 2004). In tale ambito, l’amplificazione di sequenze di DNA specifiche 

tramite PCR è divenuto un metodo molecolare largamente utilizzato in quanto altamente riproducibile. 

A questa tecnica sono stati successivamente affiancati metodi di analisi più sensibili quali la RAPD 

(Random Amplification of Polymorphic DNA) (Quesada e Cenis, 1995), la RFLP (Restriction Fragment 

Length Polymorphism) (Guillamon et al.., 1998) e la AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 

(Azumi and Goto-Yamamoto, 2001). 

Negli anni più recenti tali tecniche sono state impiegate per lo studio della variabilità di sequenza di 

alcune regioni del genoma, soprattutto di quelle in cui sono localizzati i geni che codificano per gli RNA 

ribosomiali (rRNA). In particolare, sono stati analizzati i domini D1/D2 dei geni codificanti per il 26S 

rRNA (Laitila et al.., 2006) e le regioni interne spaziatrici trascritte (ITS) del cluster dei geni ribosomiali 

(26S, 18S e 5S) (Guillamon et al.., 1998; Granchi et al.., 1999; Esteve-Zarzoso et al.., 1999) . 

L’attenzione e stata rivolta anche allo studio del polimorfismo di singoli geni specifici conservati nei 

lieviti quali il 5S, Actina e Metionina 2 (Daniel e Meyer,2003; Antunovics et al.., 2005). 

Ad onor del vero, nessuno di questi metodi fino ad oggi si è rivelato in grado di garantire da solo risultati 

che consentano l’identificazione certa di una specie o di un ceppo di lievito. 

A queste tecniche si possono affiancare altre metodiche che però presentano lo svantaggio di essere 

più complesse e che possono richiedere costose apparecchiature, quali l’analisi del cariotipo mediante 

l’impiego della tecnica PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) (Cardinali e Martini, 1994). Va 

menzionata infine l’analisi del DNA mitocondriale (mtDNA) che presenta una variabilità genetica 

intrinseca maggiore rispetto al DNA nucleare. 

Rimane pertanto importante identificare nuove regioni variabili del genoma che possano consentire 

l’identificazione certa dei ceppi a livello della loro specie e, possibilmente, mettere in evidenza le 

differenze all’interno della stessa specie. 

A tale scopo, si è cercato di mettere a punto un sistema discriminante basato sull’amplificazione dei geni 

ADH, presenti in tutti i lieviti, che codificano per attività alcool deidrogenasiche. 

I ceppi di lievito analizzati, isolati prevalentemente dall’uva, dai mosti e dal vino, sono stati forniti 

dall’Istituto Sperimentale per l’Enologia di Velletri (ora CRA-Unità di ricerca per le produzioni enologiche 

dell’Italia centrale Velletri), e dal Dipartimento di Biologia Vegetale dell’Università di Perugia. 

44

MESSA A PUNTO DI UN NUOVO CRITERIO DI IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE 

AMPLIFICAZIONE DEL SISTEMA GENICO ADH 

Il metodo di screening genetico molecolare da noi utilizzato per discriminare i ceppi di lievito isolati 

dall’Istituto Sperimentale per l’Enologia di Velletri (ora CRA-Unità di ricerca per le produzioni 

enologiche dell’Italia centrale Velletri) si basa sull’analisi del sistema delle alcool deidrogenasi (ADH). 

Questo sistema è costituito da tre geni principali, chiamati ADH1, ADH2 e ADH3, che codificano per 

attività alcool deidrogenasiche coinvolte nel metabolismo dell’etanolo (Cyriacy 1975; 1979; Young 

e Pilgrim 1985). L’espressione dei geni che compongono il sistema delle alcool deidrogenasi viene 

regolata a livello trascrizionale, in funzione del tipo di fonte di carbonio disponibile per le cellule. 

In particolare i geni ADH1e ADH2 codificano rispettivamente per le proteine enzimatiche Adh1p e 

Adh2p, entrambe localizzate nel citoplasma. ADH1 viene espresso in modo semicostitutivo e viene 

indotto da glucosio. Il gene ADH2 codifica per un’attività responsabile dell’utilizzazione dell’etanolo 

accumulato durante la fermentazione e catalizza la conversione dell’etanolo ad acetaldeide, con 

concomitante riduzione del NAD + a NADH. L’espressione del gene ADH2 viene repressa in presenza di 

glucosio e indotta su fonti di carbonio respirabili, come etanolo e glicerolo. 

In S.cerevisiae esiste un terzo gene, ADH3, che codifica per un alcool deidrogenasi a localizzazione 

mitocondriale. La presenza di Adh3p aumenta di circa tre volte durante la crescita su glicerolo. L’isozima 

Adh3p partecipa ad un sistema navetta etanolo-acetaldeide capace di regolare l’equilibrio redox NAD + / 

NADH tra il citoplasma e il mitocondrio (Bakker et al., 2000). 

Esistono inoltre altri geni ADH, quali ADH5, che sembrano essere coinvolti nel metabolismo degli alcoli 

superiori (Dickinson et al., 2003). 

La scelta di questo sistema genico per il lavoro di caratterizzazione è stata effettuata principalmente per 

due motivi: 

- i geni ADH sono presenti in tutti i lieviti fermentativi in quanto necessari per la produzione di etanolo 

durante la vinificazione a partire dalle alte concentrazioni zuccherine presenti nei mosti; 

- i geni ADH mostrano tra loro un’alta omologia e potrebbero quindi costituire un buon substrato per 

analizzare le variazioni ceppo e/o specie dipendente nella sequenza del loro DNA . 

Nel nostro lavoro di caratterizzazione è stato analizzato il polimorfismo dei geni ADH1, ADH2, 

ADH3 e ADH5 mediante amplificazione per PCR utilizzando specifici DNA primers per ciascun gene. 

L’amplificazione dei geni ADH è stata condotta sia separatamente sui singoli geni (PCR) che utilizzando 

contemporaneamente le coppie di tutti i primers (vedi Tabella in Materiali e Metodi) relativi ai 4 geni 

nello stesso tubo di reazione (PCR-multiplex). 

Per ottenere un profilo più dettagliato del pattern dei DNA amplificati, questi sono stati sottoposti 

successivamente a digestione mediante Sau3AI, un enzima di restrizione che taglia con alta frequenza 

le molecole di DNA riconoscendo sequenze specifiche. 

Infine, abbiamo cercato di mettere in relazione l’assenza dell’amplificato dei singoli geni con la presenza/ 

4

assenza del corrispondente enzima. A tale scopo, dopo estrazione delle proteine cellulari, le singole 

attività ADH sono state separate mediante elettroforesi su gel nativi di acrilamide e la loro presenza è 

stata confermata mediante un saggio di attività basato su una colorazione specifica. 

Per verificare la capacità discriminante del metodo di identificazione, l’analisi effettuata su ceppi vinari 

di lievito forniti dal CRA-Unità di ricerca per le produzioni enologiche dell’Italia centrale Velletri, è stata 

estesa a ceppi ottenuti dalla collezione del Dipartimento di Biologia Vegetale (DBVPG) dell’Università di 

Perugia, utilizzando il ceppo di laboratorio BY 4741 appartenente alla specie Saccharomyces cerevisiae 

come riferimento. 

4

Materiali e Metodi 

Ceppi, terreni e condizioni di coltura 

Le cellule di lievito sono state coltivate a 28°C in terreno YP liquido (1% estratto di lievito, 2% peptone) 

su agitatore rotante addizionato con Glucosio 1% . 

Tabella dei ceppi analizzati nel lavoro. 

* C-S6u deriva da un incrocio tra un ceppo di S.cerevisiae e un ceppo di S.uvarum 

CEPPO SIGLA GENERE E SPECIE PROVENIENZA 

BY 4741 WT Saccharomyces cerevisiae r.f. cerevisiae 

A-270 1 Saccharomyces cerevisiae r.f. uvarum 

B-S11c 2 Saccharomyces cerevisiae r.f. cerevisiae 

C-SbC2 3 Saccharomyces bayanus 

C-S6u* 4 Saccharomyces cerevisiae r.f. uvarum 

D-S16b 5 Saccharomyces bayanus 

E-AT1 6 Saccharomyces cerevisiae r.f. cerevisiae 

F-S12c 7 Saccharomyces cerevisiae r.f. cerevisiae 

DBVPG 1708 C2 Saccharomyces cerevisiae r.f. cerevisiae 

DBVPG 1180 U1 Saccharomyces cerevisiae r.f. uvarum 

DBVPG 1391 U2 Saccharomyces cerevisiae r.f. uvarum 

DBVPG 6032 B1 Saccharomyces bayanus r.f. bayanus 

DBVPG 6131 B2 Saccharomyces bayanus r.f. tubiformis 

DBVPG 1648 I2 Saccharomyces cerevisiae r.f. italicus 

DBVPG 1369 H2 Saccharomyces cerevisiae r.f. chevalieri 

DBVPG 1976 H3 Saccharomyces cerevisiae r.f. chevalieri 

Dipartimento Biologia Cellulare e 

dello Sviluppo 

ROMA 

CRA 

Unità di ricerca per le produzioni 

enologiche dell’Italia centrale 

VELLETRI 

Dipartimento di 

Biologia Vegetale 

PERUGIA 

4

Estrazione di DNA totale da lievito 

I ceppi sono stati inoculati in terreno liquido e fatti crescere fino ad una densità di 10 8 cellule/ml alla 

temperatura di 28°C sotto agitazione. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione, lavate 

con TE (Tris EDTA), e trattate con tampone di estrazione (Triton X-100, SDS 1%, NaCl 100mM, TE 

pH 8). La sospensione è stata trattata con PCI (fenolo,/CHCl 3 /alcool isoamilico in rapporto 25:24:1 

rispettivamente) e le cellule sono state sottoposte a rottura meccanica con palline di vetro su vortex per 

4 minuti. Dopo aggiunta di 0,2 ml di TE e dopo centrifugazione è stata recuperata la fase acquosa ed il 

DNA è stato precipitato con l’aggiunta di tre volumi di etanolo 95°. Dopo centrifugazione e rimozione 

dell’etanolo il DNA veniva ridisciolto in TE+RNAasi per eliminare la contaminazione dovuta allo 

RNA. 

Amplificazione del DNA tramite PCR 

L’amplificazione è stata eseguita utilizzando il kit della TaKaRa SHUZO CO., LTD con le seguenti 

modalità: 

DNA 50ng 

MgCl 2 25mM 

Tampone PCRII 10X 

dNTP 50µM 

Oligo Forward 50pmole/l 

Oligo Reverse 50pmole/l 

Taq polimerasi 2,5U/l 

H 2 O dd Fino a volume di 50μl 

Le condizioni di tempo e temperatura delle reazioni erano le seguenti: 

DENATURAZIONE: 5 minuti 94°C 

30 CICLI 

· Denaturazione 30 secondi a 94°C 

· Ibridazione 30 secondi a 58°C 

· Allungamento 45 secondi a 72°C 

TERMINE ALLUNGAMENTO: 4 minuti a 72°C 

I prodotti di amplificazione sono stati controllati su gel di agarosio alla concentrazione del 1,2% . Il DNA 

è stato messo in evidenza mediante l’aggiunta al gel di agarosio di bromuro di etidio alla concentrazione 

finale di 0,5mg/ml e mediante illuminazione con raggi UV. 

4

SCHEMA DI AMPLIFICAZIONE DEI GENI AdH 

GENE Primers 

AdH1 

AdH2 

AdH3 

AdH5 

Diretto 

5’ ATCCCAGAAACTCAAAAAGGTG 3’ 

Inverso 

5’ AGTGTCAACAACGTATCTACCA 3’ 

Diretto 

5’ CAAGTTGGAGCATAAGGATATC 3’ 

Inverso 

5’ AGTGTCAACAACGTATCTACCA 3’ 

Diretto 

5’ ACGTCAACATTGTTCACCAGG 3’ 

Inverso 

5’ AGTATCGACGACGTATCTACCC 3’ 

Diretto 

5’ TGGCCATTTCAATTGAAATTTCC 3’ 

Inverso 

5’ AGTCTCAACAACATATCTACCA 3’ 

Taglia amplificato 

PCR 

Temperatura di 

ibridazione 

1.033 bp 58°C 

990 bp 58°C 

1.100bp 58°C 

876 bp 58°C 

Primers, dimensioni in paia di basi (bp) dei prodotti di PCR attesi e temperatura di ibridazione. 

4

PCR (Polymerase Chain Reaction) 

La PCR è una tecnica che prevede l’amplificazione di una sequenza di DNA di cui si conoscono gli estremi. 

Per realizzarla si ha bisogno di: 

- Sequenza da amplificare 

- nTP (nucleoclosidi tri fosfati, come ATP, cTP, GTP, TTP) 

- Primer (Sequenze complementarie agli estremi della sequenza da amplificare 

- TAQ (una polimerasi estratta da un termofilo, in grado di non denaturarsi ad alte temperature) 

- Buffer (i tamponi necessari per la reazione di elongazione) 

La PcR avviene in una serie di cicli composti da tre fasi: 

- nella prima abbiamo la separazione dei frammenti, fase che avviene ad alte temperature 

- una fase di Annealing, appaiamento, in cui i primer si appaiono a filamenti 

- a fase in cui la TAQ polimerasi sfruttando l’OH libero fornito dai primer, polimerizza usando come stampo la 

sequenza. 

Nel primo ciclo si ha una duplicazione dal primer fino alla fine del frammento, ma ne cicli successivi si ha la 

amplificazione della sola sequenza compreso tra i due primers. 

0

Digestione di molecole di DNA con endonucleasi di restrizione e loro analisi 

Per la digestione delle molecole di DNA è stata usata 1 unità di enzima per µg di DNA. La reazione 

di taglio è stata effettuata in una opportuna soluzione tampone specifica per l’ enzima Sau3AI) alla 

temperatura di 37°C . 

L’esito della digestione è stato controllato mediante elettroforesi su gel di agarosio alla concentrazione 

finale del 2%. 

La corsa elettroforetica è stata effettuata ad un voltaggio costante tra 50 e 150 Volts nel tampone TBE 

(Tris Base 89mM, acido borico 89mM, EDTA pH 8,3 2mM). 

I frammenti di DNA prodotti sono stati messi in evidenza mediante l’aggiunta al gel di agarosio di 

bromuro di etidio alla concentrazione finale di 0,5 mg/ml. 

Estrazione di proteine totali di lievito 

Le cellule provenienti da una precoltura contenente glucosio 2%, vengono seminate in tubi batteriologici 

sterili contenenti 5 ml di terreno YP oppure in 20 ml di terreno minimo in beute, supplementato con 

le opportune fonti di carbonio. Dopo crescita fino alla fase tardo-esponenziale, le cellule vengono 

centrifugate per 10 minuti a 3000 rpm a 4 °C e risospese in 180 µl di soluzione contenente TE 1X ( 

Tris-EDTA pH 7.4) e Triton-X100 allo 0.1% per ogni 0,1g di cellule. La rottura della parete cellulare 

viene effettuata meccanicamente per agitazione della sospensione di cellule su vortex, dopo aggiunta di 

sferette di vetro del diametro di 0.5mm. Tale trattamento dura circa 10 minuti e l’avvenuta rottura viene 

verificata al microscopio ottico. I campioni vengono quindi centrifugati per 5 minuti a 14000 rpm per 

eliminare il pellet cellulare e il supernatante recuperato viene centrifugato per altri 5 minuti a 15000 rpm 

permettendo la separazione di una fase solubile. 

La quantità delle proteine totali presenti nei campioni in esame viene determinata mediante un saggio 

colorimetrico alla lunghezza d’onda di 595 nanometri utilizzando il reattivo Bradford (Coomassie 

Brillant Blu G250 0,01%, etanolo 4,7%, acido fosforico 8,5%) (Bradford, 1976). 

Separazione elettroforetica delle proteine in condizioni non denaturanti 

Le proteine degli estratti cellulari sono state separate sulla base alla carica elettrica posseduta mediante 

elettroforesi in condizioni non denaturanti su gel di poliacrilamide al 5%. Il tampone impiegato nella 

corsa elettroforetica è così composto: Tris base 25 mM, glicina 192 mM, in acqua bidistillata. Sono stati 

caricati su ogni pozzetto del gel circa 10 µg di proteine totali di ciascun campione diluito in un volume 

finale di 8-15µl di una soluzione contenente Tris-HCl pH 6.8 50 mM, glicerolo 25%, ß-mercaptoetanolo 

100mM e blu di bromofenolo come tracciante. La corsa elettroforetica è stata effettuata a 4°C per circa 

1 ora ad un amperaggio costante di 25mA in un apparato per elettroforesi BioRad Mini protean II. 

Colorazione degli enzimi ADH mediante saggi di colorazione per attività 

L’attività alcool deidrogenasica (ADH) è stata evidenziata incubando il gel per 10-15 minuti a temperatura 

ambiente in 5 ml di una soluzione contenente: 10mg di NAD + , 0,4 mg di fenazina metasolfato (PMS) e 

1 mg di Sali di blu di nitro tetrazolio (NTB) e 15 µl di etanolo 95%. 

L’attività enzimatica è stata rilevata mediante la formazione specifica di bande di colore viola-blu nelle 

regioni del gel in cui è migrata l’attività. 

Il saggio è basto su reazioni di ossidoriduzione catalizzate dagli enzimi stessi. La colorazione è dovuta 

alla riduzione del sale di tetrazolio, accettore finale degli elettroni nella reazione innescata dall’enzima. 

1

RISULTATI 

Analisi degli amplificati del sistema genico AdH 

L’analisi degli amplificati dei geni ADH condotta su ceppi ottenuti dalle collezioni del CRA di Velletri 

e del DBVPG è riportata in Figura 1. 

L’analisi è stata eseguita da tre a cinque volte per ciascun ceppo. 

Come si può osservare, utilizzando primers specifici per i singoli geni ADH, si ottengono i rispettivi 

amplificati che mostrano migrazioni tra loro diverse mediante gel-elettroforesi. 

Nel ceppo 2 (S.cerevisiae B-S11c) della collezione di Velletri, il gene ADH2 mostra più prodotti di 

amplificazione che tendono a scomparire quando vengono amplificati contemporaneamente tutti 

e quattro i geni (Figura 1a). Per tale motivo, sui ceppi della collezione di Perugia è stata utilizzata 

direttamente quest’ultimo tipo di tecnica (Figura 1b). 

La mancata amplificazione di un singolo gene può essere interpretata come indice dell’assenza del gene 

stesso. 

I risultati, riassunti nella Tabella 1, sono esposti qui di seguito. 

- Nel ceppo di riferimento di S.cerevisiae sono presenti gli amplificati di tutti i geni saggiati. 

Dal confronto degli altri ceppi con questo, si può osservare che: 

- ADH1, che codifica il principale enzima responsabile dell’attività fermentativa, è presente in tutti i 

ceppi di tutte le specie saggiate appartenenti a entrambe le collezioni. 

Inoltre, la taglia del DNA amplificato per PCR rimane la stessa in tutti i casi. 

- ADH2, nella collezione di Velletri, è presente negli uvarum mentre è del tutto assente nel ceppo di 

S.cerevisiae E-AT1 e nei bayanus C-SbC2 e D-S16b. 

Quest’ultimo risultato non si riscontra nei bayanus B1 e B2 della collezione di Perugia nei quali 

l’amplificato ADH2 è presente e di taglia attesa, così come in tutti gli altri ceppi saggiati di questa 

collezione. 

- ADH3 è presente in tutti i cerevisiae di entrambe le collezioni ma mostra una presenza variabile nelle 

altre specie analizzate. Infatti, per quanto riguarda i ceppi classificati come uvarum, l’amplificato è 

presente nel ceppo C-S6u della collezione di Velletri e mostra bande di taglia diversa nel ceppo A-270. 

Nel caso degli uvarum della collezione di Perugia, l’amplificato è presente nel ceppo U1 mentre è del 

tutto assente nel ceppo U2. 

Per quanto riguarda la specie bayanus, l’amplificato ADH3 è presente nei ceppi C-SbC2 e D-S16b della 

collezione di Velletri e assente nei ceppi B1 e B2 della collezione di Perugia. 

- ADH5 è presente in tutti i ceppi di tutte le specie saggiate appartenenti ad entrambe le collezioni. 

2

Digestione degli amplificati del sistema genico AdH ottenuti per PCR 

Per ottenere un pattern di identificazione molecolare più affidabile, i prodotti di PCR dei geni ADH sono 

stati sottoposti a restrizione utilizzando Sau3AI, un enzima di restrizione che taglia con alta frequenza il 

DNA specifico per la sequenza GATC. 

Questo approccio consente di evidenziare più in dettaglio il polimorfismo di ciascun ceppo. 

L’analisi è stata effettuata dapprima sul ceppo di laboratorio di riferimento BY4741 (Fig.2) e 

successivamente sui ceppi della collezione di Velletri (Fig.3) e di Perugia (Fig.4). 

Come si può vedere, la digestione degli amplificati genici, ottenuti sia singolarmente che insieme dal 

ceppo di controllo BY4741, ha fornito una serie di frammenti di restrizione caratteristici di ciascun gene 

e concordi con la loro sequenza nucleotidica. 

Il pattern RFLP che si ottiene sembra essere caratteristico per ciascun ceppo in quanto questi differiscono 

tra loro per la dimensione di alcuni frammenti e nel loro numero, coerentemente con il numero di geni 

amplificati in ciascun ceppo. 

Per quanto riguarda la collezione di Perugia, il ceppo C2 di S. cerevisiae mostra un pattern di restrizione 

identico al cerevisiae di controllo, a conferma dell’affidabilità della tecnica. 

Con piccole differenze, questo pattern si osserva sia nel ceppo di italicus (I2) che nei due ceppi di 

chevalieri (H2, H3) che, notoriamente, sono sinonimi di cerevisiae. 

Un diverso profilo è risultato comune per i ceppi U2, classificato nella collezione di Perugia come S. 

uvarum, e i ceppi B1 e B2 di bayanus. Dal momento che avevamo precedentemente osservato che nel 

ceppo U2 non è presente l’amplificato del gene ADH3, peculiarità mostrata anche dai ceppi di bayanus 

della stessa collezione, possiamo ipotizzare che la classificazione di questo ceppo sia stata erroneamente 

attribuita alla specie uvarum. 

Un discorso simile può essere fatto per il ceppo U1 di uvarum che mostra un pattern di restrizione più 

simile al ceppo H3 di chevalieri e al C2 di cerevisiae. 

Analisi del pattern proteico delle alcool deidrogenasi 

L’assenza in un determinato ceppo di lievito dell’amplificato di un gene della taglia attesa può essere 

dovuta alla mancanza del gene stesso o al riarrangiamento della regione codificante del gene. 

Per verificare che all’assenza dell’amplificato corrispondesse effettivamente l’assenza del gene, abbiamo 

cercato di stabilire una relazione con la presenza/assenza del corrispondente enzima. 

A tale scopo, dopo rottura delle cellule ed estrazione delle proteine cellulari, le singole attività ADH 

sono state separate mediante elettroforesi su gel nativi di acrilamide e la loro presenza è stata messa in 

evidenza mediante un saggio di attività per colorazione specifica. 

I risultati di questa analisi sui ceppi della collezione di Velletri hanno mostrato, che all’assenza degli 

amplificati ADH2 e ADH3 corrisponde effettivamente la mancanza delle corrispondenti attività 

enzimatiche (Figura 5a). E’ interessante notare che i ceppi 1 e 4 (uvarum) mostrano un pattern enzimatico 

3

sovrapponibile ma comunque nettamente diverso da quello osservato nei ceppi della specie cerevisiae 

e bayanus. 

Per quanto riguarda i ceppi della collezione di Perugia, questi mostrano tutti dei profili enzimatici identici 

tra loro e con i cerevisiae e bayanus della collezione di Velletri. 

Fanno eccezione i ceppi B1 e B2 di bayanus e U2 di uvarum che mostrano un profilo simile tra loro 

e pertanto, come già sottolineato sulla base dell’analisi degli RFLP, sembrano appartenere alla stessa 

specie. 

Inoltre, il loro zimogramma ADH è parzialmente sovrapponibile a quello osservato negli uvarum della 

collezione di Velletri. 

Nella Tabella 2 è riassunta in modo schematico la relazione tra l’assenza dell’amplificato dei singoli 

geni con la presenza/assenza del corrispondente enzima. 

4

FIGURE E TABELLE 

a) b) 

Figura 1. 

a) Amplificazione mediante PCR dei geni ADH nel ceppo di riferimento BY 4741 e nei ceppi di 

lievito della collezione di Velletri. Sono indicati con 1, 2, 3 e 5 rispettivamente gli amplificati dei geni 

ADH1/2/3/5; con T gli amplificati totali dei quattro geni ottenuti mediante PCR-multiplex. 

b) Amplificazione mediante PCR-multiplex dei geni ADH nei ceppi di lievito della collezione di 

Perugia. 

M indica i marcatori di peso molecolare.

Tabella 1. Riassunto schematico della presenza/assenza degli amplificati corrispettivi ai geni ADH nei 

ceppi di lievito delle collezioni di Velletri e di Perugia. 

* L’asterisco indica la presenza di un amplificato che mostra una migrazione diversa da quella osservata 

nel ceppo di riferimento o la presenza di amplificati multipli per lo stesso gene.

Figura 2. Profilo di restrizione dei DNA amplificati dei geni ADH ottenuti dal ceppo 

di laboratorio di riferimento BY 4741. 

Figura 3. Profilo di restrizione ottenuto con l’enzima Sau3AI degli amplificati ADH 

dei ceppi della collezione di Velletri. Le frecce indicano la dimensione dei frammenti 

del ceppo di controllo.

. 

1000 

700 

500 

400 

200 

100 

DI G E ST I ONE Sau3A I 

C E PPI DE L L A C OL L E Z I ONE DI PE R UG I A 

M B 1 H 2 B 2 H 3 I 2 U1 U2 C 2 W T M 

Figura 4. Profilo di restrizione ottenuto con l’enzima Sau3AI degli amplificati dei geni ADH ottenuti 

dai ceppi della collezione di Perugia.

a) 

b) 

Figura 5. Profilo elettroforetico delle alcool deidrogenasi (ADH) nei ceppi delle collezioni di Velletri 

(a) e di Perugia (b).

Tabella 2. Riassunto schematico della correlazione tra presenza/assenza degli amplificati relativi ai 

singoli geni ADH e le rispettive attività enzimatiche nei ceppi di lievito delle collezioni di Velletri e 

di Perugia. La presenza dell’ attività Adh5p non è rilevabile con questo tipo di colorazione (N.D.). 

0

CONCLUSIONI 

Per una migliore identificazione e tracciabilità dei lieviti appartenenti al genere Saccharomyces, è stato 

messo a punto un nuovo approccio enzimatico-molecolare basato sull’analisi delle alcool deidrogenasi 

(ADH), un sistema genico che risulta essere altamente conservato nei lieviti nel corso dell’evoluzione. 

Ai fini dello studio della variabilità tra le varie specie, il sistema ADH presenta il doppio vantaggio di poter 

esser analizzato sia a livello del DNA dei geni che lo costituiscono che dei loro prodotti enzimatici. 

Infatti, da quanto scaturisce dalla nostra indagine, utilizzando primers basati sulle sequenze note dei 

geni ADH del ceppo di S. cerevisiae di controllo si possono ottenere frammenti di DNA di taglia diversa 

specifici per ciascun gene. Allo scopo di ottenere più velocemente un’impronta molecolare dei ceppi 

in esame, è possibile effettuare l’amplificazione di tutti e quattro i geni contemporaneamente mediante 

PCR multiplex. 

Inoltre, la successiva digestione dei prodotti di PCR con l’enzima Sau3AI consente di ottenere un 

polimorfismo di restrizione più dettagliato per ciascun lievito da analizzare. 

Una volta rilevata la presenza/assenza dei singoli geni ADH, è possibile procedere alla conferma dei 

risultati ottenuti sulla base dell’analisi del DNA mediante confronto con quelli ottenuti dallo studio delle 

attività enzimatiche ADH codificate dai singoli geni. 

Infatti, l’analisi degli zimogrammi ADH ottenuti nell’ambito del presente progetto per ciascun ceppo ha 

permesso di confermare che: 

a) l’assenza dell’amplificato di uno specifico gene è sempre associata alla mancanza del rispettivo 

enzima, a conferma che i primers utilizzati sono altamente specifici per ciascun gene. 

b) la presenza/assenza degli enzimi ADH in un determinato ceppo ben si correla con il polimorfismo 

di restrizione del relativo DNA. 

Riassumendo i risultati, l’analisi combinata DNA-enzima suggerisce che i ceppi di chevalieri e italicus 

della collezione di Perugia mostrano la presenza di tutti i geni ADH e, pertanto, possono essere 

considerati delle varietà di cerevisiae. Al contrario, i ceppi B1 e B2 (S.bayanus) e U2 (S.uvarum) 

della stessa collezione risultano privi del gene ADH3. Inoltre, questi tre ceppi presentano un profilo 

RFLP e uno zimogramma tra loro sovrapponibili ma molto diversi da quelli delle altre specie di lieviti 

analizzati. Questi dati suggeriscono che B1, B2 e U2, classificati sulla base delle loro caratteristiche 

fisio-morfologiche in specie diverse del genere Saccharomyces, possono invece appartenere alla stessa 

variante di specie. 

E’ interessante inoltre sottolineare che il pattern enzimatico del ceppo A-270 di uvarum della collezione 

di Velletri, privo del gene ADH3, è sovrapponibile con quello dei ceppi B1, B2 e U2 della collezione di 

Perugia. 

Al contrario, il ceppo C-S6u uvarum della collezione di Velletri mostra uno zimogramma che somiglia 

in parte a quello al ceppo A-270 uvarum e in parte a quello dei cerevisiae var. bayanus della stessa 

collezione. 

Questo dato conferma la capacità discriminante del nostro metodo dal momento che C-S6u, classificato 

1

come uvarum sulla base della proprietà di fermentare il raffinosio, è il prodotto di un incrocio tra due 

ceppi appartenenti rispettivamente alle specie uvarum e cerevisiae,. 

Per quanto riguarda i possibili sviluppi di questa tecnica, resta la necessità di ottenere una migliore 

definizione dei pattern di restrizione degli amplificati ottimizzando le condizioni di digestione del DNA, 

la separazione dei frammenti e mediante l’eventuale impiego di altri enzimi di restrizione. 

Questi miglioramenti consentirebbero di eliminare le incertezze dovute a digestioni parziali del DNA e 

alla sovrapposizione nella corsa elettroforetica dei frammenti di taglia simile. 

Sarà interessante infine il confronto, effettuato sugli stessi ceppi, di questo metodo con altri sistemi 

molecolari oggi disponibili per la tipizzazione dei lieviti vinari. 

In conclusione, l’impiego dell’analisi combinata DNA-enzima del sistema genico ADH può costituire 

sin da oggi un approccio innovativo per determinare le percentuali d’impianto dei ceppi starter e le 

eventuali contaminazioni dei mosti da parte di lieviti indigeni durante la fermentazione. 

2

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3

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