Tesi completa - Università Politecnica delle Marche

UNIVERSITÀ POLITECNICA DELLE MARCHE
FACOLTÀ DI SCIENZE
Scuola di Dottorato di Ricerca in:
Scienze Biomolecolari, X ciclo
Biotecnologia dei lieviti di interesse enologico
per il miglioramento della qualità dei vini
Tesi di Dottorato del: Coordinatore:
Dott. Mirko Gobbi Prof. Mario Orena
Anno Accademico 2009/2011
Tutor :
Prof. Maurizio Ciani

INDICE
CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE .......................................................................... 1
1.1 Ecologia dei lieviti nella fermentazione vinaria..................................................... 3
1.2 Influenza dei lieviti non-Saccharomyces ............................................................... 6
1.3 Fermentazioni spontanee e inoculate ................................................................... 13
1.4 Caratteristiche dei ceppi di lievito starter per l’enologia ..................................... 19
1.5 Fermentazioni multistarter controllate. ................................................................ 22
1.6 Interazioni tra lieviti durante la fermentazione .................................................... 29
1.7 Futuro dei lieviti non-Saccharomyces.................................................................. 37
1.8 Sottoprodotti di fermentazione correlati alla qualità organolettica del vino........ 39
CAPITOLO 2 - SCOPO DEL LAVORO............................................................... 47
CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI .......................................................... 48
3.1 Allestimento delle prove sperimentali ................................................................. 48
3.1.1 Microfermentazioni su scala di laboratorio impiegando 16 ceppi di lievito
non-Saccharomyces inoculati in combinazione con S. cerevisiae ......................... 48
3.1.2 Fermentazioni miste a diversi tempi di inoculo con i due ceppi di lievito
non-Saccharomyces selezionati e lo starter S. cerevisiae....................................... 50
3.1.3 Fermentazioni miste con i due ceppi di lievito non-Saccharomyces
selezionati, condotte a diverse temperature in fermentatori da banco...................... 51
3.1.4 Vinificazioni su scala semi-industriale inoculate con i due ceppi selezionati
di lievito non-Saccharomyces in combinazione con S. cerevisiae ........................... 53
3.2 Monitoraggio delle fermentazioni........................................................................ 54
3.3 Analisi microbiologiche....................................................................................... 54
3.3.1 Terreni di coltura .......................................................................................... 55

3.3.2 Studio della dominanza dello starter S. cerevisiae inoculato mediante PCR di
sequenze interdelta .......................................................................................................... 58
3.4 Analisi chimiche................................................................................................... 60
3.4.1 Determinazione della quantità di zuccheri .................................................... 60
3.4.1.1 Reattivo di Fehling.................................................................................. 60
3.4.1.2 Aerometro Baumè................................................................................... 61
3.4.1.3 HPLC ...................................................................................................... 62
3.4.2 Analisi acidità totale...................................................................................... 62
3.4.3 Analisi acidità volatile................................................................................... 63
3.4.4 Estrazione ed analisi della componente volatile............................................ 65
3.4.5 Analisi degli alcoli superiori ......................................................................... 68
3.4.6 Determinazione degli aminoacidi prontamente assimilabili ......................... 68
3.4.7 Determinazione dell’ammonio ...................................................................... 69
3.4.8 Determinazione del glicerolo ........................................................................ 71
3.4.9 Determinazione dell’etanolo ......................................................................... 72
3.4.10 Determinazione dell’anidride solforosa ...................................................... 73
3.4.11 Determinazione dei polisaccaridi ................................................................ 74
3.4.12 Determinazione dell’acido L-lattico............................................................ 75
3.4.13 Determinazione dell’acido lattico e dell’acido malico................................ 77
3.5 Analisi sensoriale dei vini mediante descrittori (panel test) ................................ 77
3.6 Analisi statistica ................................................................................................... 78
CAPITOLO 4 - RISULTATI .................................................................................. 79
4.1 Valutazione dell’attitudine enologica di 16 ceppi di lieviti non-Saccharomyces
inoculati in fermentazioni miste con S. cerevisiae mediante microfermentazioni..... 79
4.1.1 Ceppo EC1118 di Saccharomyces cerevisiae in coltura pura (controllo)..... 79
4.1.2 Ceppo 94 e 92 di Torulaspora delbrueckii.................................................... 79

4.1.3 Ceppo 46 di Metschnikowia pulcherrima ..................................................... 93
4.1.4 Ceppo 69 di Candida tropicalis .................................................................... 96
4.1.5 Ceppo 22 di Candida zemplinina ................................................................ 100
4.1.6 Ceppo 103 e 101 di Lachancea thermotolerans.......................................... 104
4.1.7 Ceppo 32 e 25 di Hanseniaspora osmophila............................................... 112
4.1.8 Ceppo 46 di Pichia fermentans ................................................................... 120
4.1.9 Ceppo 9 di Pichia anomala ......................................................................... 124
4.1.10 Ceppo 89 di Zygosaccharomyces bailii..................................................... 128
4.1.11 Ceppo 42 di Zygosaccharomyces florentinus............................................ 133
4.1.12 Ceppo 62 e 64 di Saccharomycodes ludwigii............................................ 137
4.1.13 Ceppo 95 di Schizosaccharomyces pombe................................................ 144
Appendice: pubblicazioni scientifiche correlate
4.2 Valutazione in microfermentazioni miste su scala di laboratorio delle modalità di
inoculo (coinoculo e sequenziale) dei due ceppi selezionati di lieviti non-
Saccharomyces......................................................................................................... 149
4.2.1 Ceppo 42 di Zygosaccharomyces florentinus e S. cerevisiae ......................... 149
4.2.2 Ceppo 101 di Lachancea thermotolerans e S. cerevisiae............................ 155
4.3 Valutazione dell’influenza della temperatura sulle fermentazioni miste condotte
in coinoculo con i due ceppi di lievito selezionati................................................... 161
4.3.1 Influenza della temperatura sull’andamento fermentativo ......................... 161
4.3.2 Fermentazioni coinoculate condotte a 20 °C .............................................. 162
4.3.3 Fermentazioni coinoculate condotte a 30 °C............................................... 167
4.4 Valutazione delle fermentazioni miste con i due ceppi selezionati di lievito non-
Saccharomyces in vinificazioni su scala semi-industriale ....................................... 171
4.4.1 Fermentazioni in coinoculo e sequenziali (48h) con il ceppo 42 di Z.
florentinus e S. cerevisiae..................................................................................... 171
4.4.2 Fermentazioni in coinoculo e sequenziali (48h) con il ceppo 101 di L.
thermotolerans e S. cerevisiae.............................................................................. 176

4.5 Valutazione della dominanza del ceppo di S. cerevisiae inoculato rispetto ai ceppi
indigeni nelle vinificazioni su scala semi-industriale .............................................. 181
CAPITOLO 5 - DISCUSSIONE E CONCLUSIONI.......................................... 184
CAPITOLO 6 - BIBLIOGRAFIA ........................................................................ 191

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
La concorrenza internazionale all’interno del mercato del vino, la domanda dei
consumatori per tipologie di vino sempre nuove e le crescenti preoccupazioni
riguardo agli aspetti salutistici della produzione del vino stanno generando nuove
sfide per l’innovazione tecnologica nella fermentazione vinaria (Bisson et al., 2002;
Pretorius & Hoj, 2005).
Il flavour del vino viene definito come una percezione sensoriale che varia a livello
soggettivo in relazione al contesto delle esperienze del consumatore e alla
composizione chimica del prodotto (Fleet, 2003). Le caratteristiche percettibili dei
vini sono il risultato di complesse interazioni chimiche e sensoriali che sono
difficilmente prevedibili a causa dell’influenza di molte variabili. Tuttavia la ricerca
svolta su diversi fronti sta progressivamente cercando di capire il ruolo di queste
influenze (Thorngate, 1997).
La composizione chimica del vino sta alla base della risposta sensoriale del
consumatore e viene determinata da molti fattori, i quali includono la varietà del
vitigno, le condizioni geografiche e viticolturali delle uve utilizzate, l’ecologia dei
microrganismi presenti sulle uve e di quelli che prendono parte al processo
fermentativo e di affinamento-conservazione ed, infine, le tecniche di vinificazione
(Cole & Noble, 1997).
I microrganismi, infatti, giocano un ruolo rilevante nella determinazione della
composizione chimica del vino: essi condizionano la qualità delle uve prima della
raccolta e poi, durante la fermentazione, metabolizzano gli zuccheri e gli altri
composti presenti nel mosto d’uva in etanolo, anidride carbonica e centinaia di altri
prodotti secondari che sinergicamente contribuiscono a conferire originalità e
peculiarità al carattere del vino (Nikänen, 1986; Lambrechts & Pretorius, 2000).
Lieviti, batteri e funghi filamentosi contribuiscono insieme all’ecologia microbica
della produzione di vino e alla composizione chimica del vino stesso, sebbene i
lieviti esercitino un’influenza predominante dovuta al loro ruolo nel condurre la
fermentazione alcolica (Fleet, 1993; Fugelsang, 1997). Tra i molti fattori che
influenzano l’ecologia microbica della produzione di vino, i più importanti sono
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CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
rappresentati dalla composizione chimica del mosto d’uva e dalle metodiche di
fermentazione.
Fino agli anni ’80, il contributo dei lieviti alla produzione del vino era visto come un
concetto relativamente semplicistico, in cui il mosto d’uva era essenzialmente
soggetto ad una fermentazione alcolica naturale e spontanea che, nella maggior parte
dei casi, era dominata dai ceppi del lievito S. cerevisiae. Sebbene molte altre specie
di lievito erano note per trovarsi nel mosto e per partecipare alle prime fasi della
fermentazione, esse erano generalmente considerate di secondaria importanza e a
volte persino contaminanti del processo di vinificazione, per cui indesiderabili.
Negli ultimi 30 anni, le maggiori ricerche hanno mirato alla comprensione
dell’ecologia, della biochimica, della fisiologia e della biologia molecolare dei lieviti
coinvolti nella vinificazione e di come questi lieviti influiscano sulla chimica del
vino, sulle proprietà sensoriali e sul gradimento del prodotto finale (Pretorius, 2000;
Fleet, 2003; 2007; Swiegers et al., 2005).
Ad oggi è noto come l’ecologia dei lieviti coinvolti nel processo fermentativo risulti
essere molto più complessa di quella rappresentata dalla dominanza del ceppo di S.
cerevisiae, autoctono o inoculato che sia, e come l’impronta metabolica dei lieviti sul
carattere del vino sia molto diversa dalla semplice fermentazione degli zuccheri del
mosto d’uva.
Sulla base di questa maggiore conoscenza e comprensione, la fermentazione alcolica
è oggi vista come un processo chiave, in cui i vinificatori possono modulare in modo
creativo il carattere e la qualità del vino, attraverso una gestione ottimale del lievito,
e al tempo stesso possono “modellare” strategicamente i vini in base ai cambiamenti
di mercato (Fleet, 2008).
Di conseguenza, colture pure del lievito S. cerevisiae sono state isolate ed impiegate
come colture starter per condurre le fermentazioni vinarie, in quanto è oggi pratica
comune in vinificazione aggiungere anidride solforosa al mosto ed eseguire l’inoculo
di colture starter selezionate in modo da eliminare o minimizzare l’influenza dei
lieviti naturalmente presenti oltre al ceppo di S. cerevisiae inoculato. Con questa
tecnologia i vinificatori hanno praticamente messo a punto un buon metodo di
controllo del processo di vinificazione, eliminando il rischio insito nelle
fermentazioni spontanee di andare incontro a processi incostanti e a possibili
2

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
inconvenienti (Benda, 1982; Lafon-Lafourcade, 1983; Reed & Nagodawithana,
1988).
Negli ultimi anni, però, c’è stata una crescente domanda per nuovi e migliori ceppi di
lievito, che possano essere impiegati nella produzione di differenti tipologie di vini,
caratterizzati da una forte distinzione stilistica, frutto di una maggiore complessità di
aroma, gusto e struttura, rispetto ai prodotti ottenuti mediante inoculo di ceppi
selezionati di S. cerevisiae che, viceversa, sarebbero responsabili di un “effetto
appiattimento” (Pretorius, 2000; Lambrechts & Pretorius, 2000; Ciani et al., 2009).
In questo contesto, è stato proposto l’impiego combinato di lieviti vinari non-
Saccharomyces con ceppi di S. cerevisiae in fermentazioni multistarter controllate al
fine di apportare i vantaggi delle fermentazioni spontanee, arricchendo la
composizione chimica e sensoriale del vino e, al tempo stesso, di ridurre i rischi di
fermentazioni interrotte, assicurando un regolare decorso fermentativo (Bisson &
Kunkee, 1993; Heard, 1999; Rojas et al., 2003; Romano et al., 2003; Jolly et al.,
2006; Ciani et al., 2006; 2009).
1.1 Ecologia dei lieviti nella fermentazione vinaria
Nell'ambito dei microrganismi che prendono parte al processo di vinificazione, i
lieviti sicuramente occupano un ruolo di primaria importanza, tanto che qualcuno ha
sostenuto che "i lieviti fanno il vino e i batteri lo affinano”. (Torija et al., 2001).
Una buona conoscenza delle specie di lievito che conducono la fermentazione
alcolica e delle loro cinetiche di crescita durante tutto il processo sono i primi passi
essenziali nella comprensione di come i lieviti influiscano sulla qualità del vino e di
come orientare la ricerca.
È noto ormai da molto tempo che il mosto ottenuto dalle uve appena pigiate contenga
una varietà di specie di lievito appartenenti ai generi Hanseniaspora, Pichia,
Candida, Kluyveromyces, Metschnikowia e Saccharomyces. Occasionalmente
possono essere presenti anche specie appartenenti ad altri generi come
Zygosaccharomyces, Saccharomycodes, Torulaspora, Dekkera e
Schizosaccharomyces (Fleet & Heard, 1993; Fleet, 2003). Questi lieviti provengono
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CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
dalla microflora residente sulla bacca d’uva e dalle popolazioni microbiche che
hanno colonizzato gli ambienti di cantina. È anche ben risaputo che molte di queste
specie non-Saccharomyces (specialmente le specie dei generi Hanseniaspora,
Pichia, Candida, e Metschnikowia) iniziano la fermentazione alcolica spontanea del
mosto, ma sono molto presto sopraffatte e rimpiazzate dalla crescita di S. cerevisiae
che domina le fasi intermedie e finali del processo – essendo molto spesso l’unica
specie rinvenuta nel fermentato durante questi stadi (Fleet & Heard, 1993; Fleet,
2003).
Sulla base di questi studi ecologici, S. cerevisiae e la specie affine S. bayanus sono
considerati i lieviti di maggiore importanza per il processo fermentativo e,
logicamente, sono diventate le specie intorno alle quali si è sviluppata la tecnologia
delle colture starter (Reed & Nagodawithana, 1988; Degre, 1993).
Soltanto dopo gli anni ’80 ricerche specifiche e più approfondite migliorarono la
conoscenza riguardo la crescita quantitativa delle singole specie di lievito durante
l’intero processo di fermentazione del mosto (Fleet et al., 1984; Heard & Fleet,
1986). Questi studi hanno mostrato che le specie non-Saccharomyces di solito
raggiungono una concentrazione cellulare massima di 10 7 UFC/ml o più nelle prime
fasi della fermentazione, prima di andare incontro a progressiva morte.
Si poteva concludere, perciò, che questa quantità di biomassa fosse sufficiente ad
influenzare la composizione chimica del vino e che il contributo di questi lieviti al
carattere complessivo del prodotto fosse molto più significativo di quanto
precedentemente creduto.
In alcuni casi, come nelle fermentazioni condotte a basse temperature, molte specie
di non-Saccharomyces non muoiono e rimangono ad alte concentrazioni insieme al
S. cerevisiae fino alla fine della fermentazione (Heard & Fleet, 1988). Inoltre, è stato
dimostrato che questi lieviti non-Saccharomyces indigeni si sviluppino anche in
fermentazioni di mosto d’uva nelle quali sono state inoculate colture starter di S.
cerevisiae (Heard & Fleet, 1985).
Di conseguenza, le supposizioni generalmente accettate che le colture starter
dovessero sopraffare la crescita dei lieviti non-Saccharomyces ed impedire il loro
contributo al carattere del vino non erano più necessariamente valide. Molti studi in
varie regioni vinicole del mondo hanno ora confermato il contributo importante che
le specie di lievito non-Saccharomyces complessivamente apportano alle cinetiche di
4

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
crescita del lievito, sia durante le fermentazioni spontanee che durante quelle
inoculate con S. cerevisiae (Mora et al., 1988; Schutz & Gafner, 1994; Lema et al.,
1996; Egli et al., 1998; Granchi et al., 1999; Pramateftaki et al., 2000; Povhe-Jemec
et al., 2001; Jolly et al., 2003; Combina et al., 2005; Zott et al., 2008).
Questa conclusione è anche supportata dai più recenti studi ecologici condotti con
metodi molecolari coltura-indipendenti per le analisi dei lieviti (Cocolin et al., 2000;
Mills et al., 2002; Xufre et al., 2006; Nisiotou et al., 2007).
Perciò l’influenza esercitata dai lieviti non-Saccharomyces sulle fermentazioni
vinarie non può essere ignorata. Essi introducono nel processo un elemento di
diversità ecologica che va al di là delle specie Saccharomyces in maniera tale da
richiedere una specifica ricerca e comprensione, da una parte, per prevenire le
eventuali conseguenze indesiderate che potrebbero causare e, dall’altra, per sfruttare
al meglio i loro contributi vantaggiosi (Ciani & Picciotti, 1995; Jolly et al., 2003).
Utilizzando tecniche molecolari che permettono la differenziazione di ceppi
all’interno della singola specie sono state inoltre scoperte sofisticazioni ecologiche
della fermentazione. All’interno di ciascuna specie c’è una crescita intrinseca ed in
successione di differenti ceppi. Sono stati individuati, infatti, 10 o più ceppi
geneticamente distinti di S. cerevisiae che intervengono in contemporanea o in
successione nel corso di un’unica fermentazione (Sabate et al., 1998; Pramateftaki et
al., 2000; Cocolin et al., 2004; Ganga & Martinez, 2004; Sipiczki et al., 2004;
Santamaria et al., 2005).
In molti casi i ceppi di S. cerevisiae inoculati come colture starter non sono stati
capaci di competere con successo con i ceppi indigeni e, perciò, non hanno dominato
la fermentazione come ci si aspettasse (Querol et al., 1992; Schutz & Gafner, 1994;
Costanti et al., 1997; Egli et al., 1998; Gutierrez et al., 1999; Ganga & Martinez,
2004; Santamaria et al., 2005). Tali inconvenienti hanno evidenziato la necessità di
comprenderne le cause al fine di poterli risolvere a livello pratico.
L’evoluzione della diversità del ceppo di lievito durante l’intera fermentazione è
stata descritta anche all’interno delle specie non-Saccharomyces (Schulz & Gafner,
1994; Povhe-Jemec et al., 2001). È tuttora accettato che le fermentazioni vinarie, sia
spontanee che inoculate, siano ecologicamente complesse e non solo implichino la
crescita di una successione di specie non-Saccharomyces e Saccharomyces, ma
comportino anche lo sviluppo successivo di ceppi differenti all’interno di ciascuna
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CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
specie. Tale complessità rappresenta un ostacolo a condurre fermentazioni
controllate con particolari colture di lievito selezionate per impartire uno speciale
carattere o stile al prodotto finale. In questi casi, perciò, dovrebbe essere inoculato un
ceppo o una miscela di ceppi che dia garanzia di una crescita prevedibile e
dominante.
Molti fattori come la composizione del mosto d’uva, i pesticidi residui, l’aggiunta di
anidride solforosa, la concentrazione dell’ossigeno disciolto, l’accumulo di etanolo e
la temperatura influenzano le cinetiche di crescita del lievito durante le fermentazioni
vinarie, ma si conosce ancora poco su come questi fattori possano influenzare la
dominanza e la successione delle singole specie e dei singoli ceppi all’interno
dell’intera popolazione (Fleet & Heard, 1993; Bisson, 1999; Fleet, 2003; Zott et al.,
2008). Generalmente si considera che lo sviluppo in successione dei ceppi e delle
specie durante tutta la fermentazione sia fortemente determinato dalla loro differente
suscettibilità alle crescenti concentrazioni di etanolo. Le specie di lievito non-
Saccharomyces, infatti, muoiono precocemente durante il processo poiché sono più
sensibili all’etanolo rispetto al S. cerevisiae. Comunque, ci sono sempre più studi che
riportano di specie di Hanseniaspora, Candida e Kluyveromyces, isolate in ambito
vinario, che presentano tolleranze all’etanolo simili a quelle del S. cerevisiae (Mills
et al., 2002; Pina et al., 2004; Xufre et al., 2006; Nisiotou et al., 2007). In aggiunta
all’etanolo, anche altri fattori come la temperatura di fermentazione, la quantità di
ossigeno disciolto, le tossine killer, le molecole “quorum-sensing” e le influenze
della densità cellulare sono conosciuti per influenzare l’interazione competitiva tra le
specie e i tra i ceppi di lievito nel corso delle fermentazioni vinarie (Yap et al., 2000;
Fleet, 2003; Nissen et al., 2003; Hogan, 2006; Perez-Nevado et al., 2006).
1.2 Influenza dei lieviti non-Saccharomyces
Sebbene l’agente più importante per la fermentazione alcolica sia il S. cerevisiae, i
molti altri microrganismi presenti nel mosto d’uva possono crescere e convertire il
contenuto di zucchero iniziale in etanolo ed altri prodotti.
La comprensione di come i lieviti influenzino le caratteristiche fondamentali
dell’aroma, del flavour e del colore dei vini rappresenta una base importante per la
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CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
selezione dei ceppi di lievito che dovranno essere impiegati come colture starter nella
conduzione e gestione della fermentazione alcolica.
I primi studi fatti giudicavano i lieviti non-Saccharomyces come lieviti selvaggi o
lieviti contaminanti (Castelli, 1954; Amerine & Cruess, 1960; Ribèreau-Gayon &
Peynaud, 1960), poiché venivano spesso isolati da fermentazioni lente o interrotte, o
da vini con profili analitici e sensoriali anomali. Le fermentazioni condotte
impiegando una coltura pura di lieviti vinari non-Saccharomyces hanno mostrato
diverse caratteristiche metaboliche e fermentative negative, che generalmente ne
hanno precluso un loro impiego come colture starter. I più importanti metaboliti
alteranti prodotti da questi lieviti non-Saccharomyces sono rappresentati dall’acido
acetico, dall’acetaldeide, dall’acetoino e dall’etilacetato, senza dimenticare gli odori
sgradevoli dei vinil ed etilfenoli legati allo sviluppo del genere
Brettanomyces/Dekkera (Chatonnet et al., 1995). La maggior parte delle specie non-
Saccharomyces di ambito vinario, inoltre, mostrano limitate attitudini fermentative
come un basso potere fermentativo, un basso tasso di fermentazione e una bassa
resistenza all’anidride solforosa. Comunque in fermentazioni miste, come quelle
naturali, alcune di queste caratteristiche enologiche negative potrebbero non essere
espresse o essere modificate dalla presenza della coltura di S. cerevisiae.
I meccanismi che influenzano le caratteristiche enologiche dei ceppi di lievito vanno
al di là del semplice metabolismo glicolitico degli zuccheri presenti nel mosto, in
quanto generalmente sono coinvolti anche il metabolismo dei composti azotati,
l’idrolisi enzimatica delle macromolecole, responsabile dell’aroma, del flavour, del
colore e della limpidezza del vino, e la capacità di autolisi e di bioadsorbimento del
ceppo di lievito. Il metabolismo degli zuccheri e degli aminoacidi del mosto in
etanolo ed in una vasta gamma di altre sostanze coinvolte nella formazione del
flavour come acidi organici, glicerolo, alcoli superiori, esteri, aldeidi, chetoni,
ammine e solfuri volatili è ben conosciuto, così come le principali reazioni chimiche
attraverso cui i lieviti influenzano il carattere del vino (Lambrechts & Pretorius,
2000; Swiegers et al., 2005).
Molti studi hanno presentato i profili qualitativi e quantitativi di questi metaboliti
prodotti da diversi ceppi di lieviti Saccharomyces e non-Saccharomyces (Fleet, 1992;
Heard, 1999; Lambrechts & Pretorius, 2000; Romano et al., 2003; Swiegers et al.,
2005; Viana et al., 2008), evidenziando che essi variano significativamente sia tra le
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CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
diverse specie sia tra i differenti ceppi di lievito, così che è necessario uno screening
approfondito per la selezione di quei ceppi con caratteri enologici positivi e
l’esclusione di quelli con definite influenze negative.
In questo contesto, le specie appartenenti ai generi Hanseniaspora, Candida, Pichia,
Zygosaccharomyces, Kluyveromyces ed altri ancora posseggono il potenziale per
contribuire ad incrementare la diversità e la complessità del flavour nella produzione
dei vini (Ciani & Maccarelli, 1998; Heard, 1999; Romano et al., 2003; Jolly et al.,
2003b). Prove sperimentali, infatti, hanno sottolineato il ruolo positivo che i lieviti
non-Saccharomyces possono svolgere nella fermentazione vinaria (Cabrera et al.,
1988; Herraiz et al., 1990; Moreno et al., 1991; Lema et al., 1996), sia migliorando il
comportamento fermentativo della coltura di lievito starter sia aumentando la
complessità della composizione analitica del vino. Conseguentemente, ormai da
diversi anni, c’è stata una rivalutazione del ruolo dei lieviti non-Saccharomyces in
vinificazione (Fleet & Heard, 1993; Ciani, 1997; Esteve-Zarzoso et al., 1998; Heard,
1999; Fleet, 2008), per cui oggi si sta facendo maggiore attenzione all’ecologia dei
lieviti fermentanti, al fine di poter capire ancora meglio l’influenza di questi ceppi di
lieviti non-Saccharomyces sulle proprietà chimiche e sensoriali del vino (Pretorius,
2000; Romano et al., 2003a; Swiegers et al., 2005).
La trasformazione biochimica dei costituenti base del mosto d’uva in composti
aromatici rappresenta un meccanismo importante, attraverso il quale i lieviti possono
influenzare significativamente l’aroma ed il flavour del vino e facilitare una migliore
espressione del carattere varietale del vitigno. Sebbene la conoscenza nei riguardi
della specificità e della complessità di queste reazioni sia ancora in divenire
(Swiegers et al., 2005; Hernandez-Orte et al., 2008), molte attenzioni si sono
concentrate su quelle che riguardano la liberazione dei terpeni.
Gli alcoli monoterpenici come il citronellolo, il geraniolo, il linalolo ed il nerolo sono
presenti naturalmente nelle uve, specialmente in vitigni quali il Moscato, il Riesling
ed in altre varietà a bacca bianca, alle quali conferiscono aromi caratteristici di
fruttato, di speziato e di note vegetali. La maggior parte di questi terpeni presenti
nelle uve, comunque, sono covalentemente legati al glucosio o ai disaccaridi del
glucosio e di altri carboidrati, dove la particolare configurazione molecolare
impedisce loro di essere biologicamente attivi in modo da poter contribuire al flavour
del vino. Le glicosidasi prodotte dai lieviti sono enzimi che idrolizzano questi legami
8

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
rilasciando la forma volatile del terpene, che può svolgere la propria attività
aromatica. La produzione delle glicosidasi da parte delle varie specie e dei vari ceppi
di lievito, in particolare dai non-Saccharomyces, riveste un ruolo importante nel
rilascio degli aromi terpenici (Fia et al., 2005; Swiegers et al.,2005; Villena et al.,
2007).
In particolare, le β-glucosidasi, una specifica sottoclasse di glicosidasi, sono enzimi
che svolgono un’importante attività biocatalitica, associata a molte specie di lieviti
non-Saccharomyces di ambito vinario (Vasserot et al., 1989; Günata et al., 1990;
Rosi et al., 1994; Manzanares et al., 1999; Ferreira et al., 2001; Rodriguez et al.,
2004; Fia et al., 2005; Gonzalez-Pombo et al., 2008). La presenza importante di
questa attività tra i lieviti vinari non-Saccharomyces è stata confermata dal ruolo
svolto da questi lieviti nell’arricchire e migliorare il profilo aromatico del vino
(Manzanares et al., 1999; Fernandez et al., 2000; Ferriera et al., 2001; Strauss et al.,
2001; Gonzalez-Pombo et al., 2008).
Inoltre, ricerche svolte sulla produzione di poligalatturonasi e β-D-xylosidasi da parte
dei lieviti non-Saccharomyces di ambito vinario hanno dimostrato che queste attività
enzimatiche sono generalmente caratteristiche di questi lieviti e possono essere
sfruttate per migliorare la qualità del vino (Manzanares et al., 1999; Fernandez et al.,
2000; Strass et al., 2001).
In modo simile, i lieviti possono aumentare significativamente la concentrazione di
tioli volatili nel vino, che conferiscono caratteri aromatici desiderabili, come note di
frutto della passione, di pompelmo e di cedro, che sono molto importanti nei
Sauvignon-Blanc, ma possono essere di grande interesse anche in altre varietà come
il Riesling, il Semillon, il Merlot ed il Cabernet-Sauvignon. Questi tioli si trovano
nelle uve sotto forma di molecole non volatili coniugate alla cisteina; durante la
fermentazione, i lieviti S. cerevisiae e S. bayanus producono l’enzima cistein-liasi
che libera questi tioli trasformandoli nella loro forma volatile aromaticamente attiva.
Questa capacità idrolitica nel rilasciare i tioli volatili dipende dal ceppo di
Saccharomyces (Swiegers et al., 2005; Dubourdieu et al., 2006; Swiegers &
Pretorius, 2007). Comunque, finora si sa ancora poco sulla produzione di questi tioli
volatili da parte dei lieviti non-Saccharomyces.
9

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
Perciò, quei lieviti che posseggono buone proprietà di liberare i terpeni e i tioli
volatili possono svolgere un ruolo significativo nell’accrescere gli aromi varietali per
molti tipi di uvaggio.
In aggiunta a queste attività enzimatiche, i ceppi di lievito non-Saccharomyces
possono essere selezionati anche in base alla loro capacità di produrre metaboliti
desiderabili, che contribuiscono alla formazione del bouquet finale del vino.
Nel 2008 alcuni ricercatori hanno riportato i dati relativi ad uno screening su 38
ceppi di lievito appartenenti ai generi Candida, Hanseniaspora, Pichia, Torulaspora
e Zygosaccharomyces per la produzione di esteri acetati (Viana et al., 2008). Durante
questo studio hanno identificato un ceppo di Hanseniaspora uvarum come buon
candidato per essere impiegato in fermentazioni con inoculo misto, grazie alla sua
natura glucofilica, alla capacità di produrre acetaldeide all’interno di un intervallo
accettabile per il vino e alla capacità di produrre esteri acetati, in particolare il 2-
feniletil acetato.
Sempre nello stesso anno, invece, Moreira et al. (2008), hanno studiato il ruolo di
Hanseniaspora guillermondii e Hanseniaspora uvarum come colture starter pure ed
in combinazione con S. cerevisiae, per la produzione di composti solforati ed esteri. I
loro risultati sottolineano che questi lieviti apiculati incrementano la produzione di
composti desiderabili, come gli esteri, senza aumentare al tempo stesso la produzione
degli indesiderati composti solforati.
Alcuni anni prima, inoltre, altri ricercatori hanno proposto un metodo rapido per
valutare le “performance” enologiche dei lieviti, basato sulla capacità delle diverse
specie di lievito di produrre livelli di metaboliti che contribuiscano a migliorare la
qualità del vino (Romano et al., 2003). In particolare, attraverso la determinazione
del 2,3-butandiolo e dell’acetoino, che è stato dimostrato essere composti
caratteristici per le specie S. cerevisiae e Kloeckera apiculata (Romano et al., 2003),
confermando che S. cerevisiae è un maggior produttore di 2,3-butandiolo rispetto a
K. apiculata.
I lieviti producono molti altri enzimi come esterasi, decarbossilasi, solfito reduttasi,
proteasi e pectinasi che, in vari modi, potrebbero andare ad agire sul flavour e su
altre proprietà dei vini (Charoenchai et al., 1997; Fernandez et al., 2000; Strass et al.,
2001), ma servirebbero ulteriori studi per valutare e capire queste possibilità.
10

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
La decarbossilazione degli acidi idrossicinnamici presenti nel mosto d’uva con la
conseguente formazione degli indesiderati fenoli volatili, come il 4-etilfenolo ed il 4-
etilguaiacolo, è molto ben conosciuta per le specie del genere Dekkera, ma può darsi
che avvenga anche in altri lieviti vinari (Dias et al., 2003; Suarez et al., 2007).
I ruoli svolti dall’autolisi e dal bioadsorbimento del lievito nell’influenzare il flavour
del vino non sono stati tenuti particolarmente in considerazione nel passato, tuttavia
può darsi che questi effetti precedentemente sottovalutati potrebbero acquisire un
certo valore in sviluppi futuri.
È ben documentato comunque che l’autolisi del lievito conferisce un carattere unico
e maggior pregio allo Champagne e ad altri vini frizzanti (Alexandre & Guilloux-
Benatier, 2006); per tale motivo la capacità autolitica è considerata essere una
proprietà importante nella selezione dei ceppi di S. cerevisiae impiegati nella
rifermentazione di questi vini (Martinez-Rodriguez et al., 2001).
Durante la fermentazione alcolica il lievito cresce fino a produrre livelli significativi
di biomassa cellulare (10 8 - 10 9 UFC/ml), costituita da una miscela di cellule morte e
vitali di differenti specie e di differenti ceppi. Queste cellule, che comprendono
lieviti Saccharomyces e non-Saccharomyces, sedimentano verso la fine della
fermentazione andando a costituire la maggior parte delle fecce. Tale biomassa non è
inerte. L’autolisi delle cellule morte di lievito è caratterizzata dalla degradazione
enzimatica delle proteine cellulari, degli acidi nucleici e dei lipidi con formazione di
prodotti come aminoacidi, peptidi, acidi grassi e nucleotidi, e con il conseguente
rilascio delle mannoproteine solubili della parete cellulare (Hernawan & Fleet, 1995;
Zhao & Fleet, 2005; Alexandre & Guilloux-Benatier, 2006). Sicuramente molti di
questi composti possono andare ad influenzare il flavour o quantomeno ad
aumentarne il potenziale (Charpentier et al., 2004; 2005; Comuzzo et al., 2006), ma i
lori specifici contributi al carattere dei vini richiedono una ricerca più accurata.
Tuttavia, sembra logico supporre che quantitativamente tale effetto dipenderà dal
protrarsi del tempo che il vino sosta sulle fecce (Perez-Srradilla & Luque de Castro,
2008). Inoltre, vari studi hanno provato che i peptidi rilasciati durante l’autolisi del
lievito possono avere proprietà antiossidanti e bioattive (Alcaide-Hidalgo et al.,
2007) e che le mannoproteine del lievito possono modulare la percezione sia dei
metaboliti che costituiscono il flavour sia del carattere tannico vino (Feuillat, 2003;
Caridi, 2007; Chalier et al., 2007).
11

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
Mentre ci sono significative conoscenze riguardo all’autolisi di S. cerevisae, poco si
è capito ancora riguardo all’autolisi di altre specie di lieviti non-Saccharomyces
associate alla fermentazione vinaria. Il comportamento autolitico di K. apiculata,
infatti, risulta essere piuttosto differente da quello mostrato da S. cerevisiae e
Candida stellata (Hernawan & Fleet, 1995).
La parete cellulare delle cellule di lievito è composta prevalentemente da
polisaccaridi glucanici e mannoproteine (Klis et al., 2006) che hanno la capacità di
modulare i costituenti aromatici del vino attraverso il bioadsorbimento dei
componenti del mosto d’uva, per mezzo di meccanismi che finora sono relativamente
sconosciuti (Feuillat, 2003; Moruno et al., 2005; Chalier et al. 2007). Per aver
un’idea dell’importanza che può rivestire tale effetto, basti pensare che le cellule di
lievito sono rivestite da una parete cellulare che può rappresentare fino al 30% del
peso secco della cellula. Le proprietà di bioadsorbimento delle mannoproteine,
inoltre, sembrano essere particolarmente significative, in quanto contribuiscono alla
stabilità colloidale dei vini mediante l’interazione con i tartrati e con le proteine
presenti nel mosto (Caridi, 2007; Perez-Serradilla & Luque de Castro, 2008). Oltre a
ciò, la struttura fine delle mannoproteine varia in base alle diverse specie di lievito
(Klis et al., 2006) e potrebbe introdurre peculiarità differenti nelle proprietà di
bioadsorbimento.
I lieviti influenzano i profili di colore e di pigmentazione dei vini, in modo
particolare dei vini rossi. Tali influenze variano con il ceppo di S. cerevisiae ed è
necessario considerarle nel ventaglio delle proprietà, quando si opera una selezione
di lieviti per lo sviluppo di una coltura starter (Medina et al., 2005; Hayasaka et al.,
2007; Caridi et al., 2007). L’influenza dei lieviti non-Saccharomyces sul colore del
vino è un argomento relativamente inesplorato; anche se è ben noto che possono
influenzare il colore dei vini rossi attraverso vari meccanismi. In primo luogo, i
lieviti producono etanolo ed altri metaboliti che estraggono i pigmenti antocianici
dalle bucce delle uve. Molti lieviti, inoltre, producono pectinasi extracellulari, enzimi
che possono facilitare la disgregazione dei tessuti dell’uva e la conseguente
estrazione dei pigmenti. Sta aumentando anche l’evidenza che i lieviti possano
influenzare la stabilità dei costituenti antocianici e polifenolici responsabili del
colore, dopo la loro estrazione. Molti degli antociani, infatti, sono molecole
glicosilate, per cui la produzione di glicosidasi da parte dei lieviti può rompere
12

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
questo legame e conseguentemente far diminuire il colore (Manzanares et al., 2000);
anche i polisaccaridi della parete cellulare del lievito possono adsorbire le
antocianine e, in questo modo, sottrarre il colore dal vino (Caridi, 2007; Caridi et al.,
2007).
Viceversa, i lieviti possono contribuire indirettamente alla stabilizzazione del colore
del vino durante la fase di maturazione, attraverso la produzione di acetaldeide e di
acido piruvico, che facilitano la formazione chimica delle pirantocianine (Morata et
al., 2006; Monagas et al., 2007).
La tendenza a subire autolisi e l’attività di adsorbimento parietale, quindi,
rappresentano proprietà relativamente nuove e da tenere in considerazione nella
selezione e nello sviluppo di nuovi lieviti vinari (Caridi, 2007; Giovani & Rosi,
2007).
1.3 Fermentazioni spontanee e inoculate
Dal punto di vista microbiologico le fermentazioni possono essere condotte sia come
processi “in batch”, cioè in un singolo stadio, sia come processi in continuo. Quasi
tutti i vini vengono prodotti attraverso una fermentazione in batch; questo vuol dire
che il mosto è posto in una vasca e l’intero processo viene mantenuto lì fino a che la
fermentazione non sia completa, di solito dopo 5-10 giorni (Divies, 1993).
Le fermentazioni in continuo, d’altro canto, permettono di avere un processo molto
più veloce e più efficace, e rappresentano una nuova frontiera per l’industria del
vino, che dovrebbe essere maggiormente esplorata.
Con le fermentazioni in batch ci sono due possibili tecnologie di produrre vino: la
fermentazione spontanea (o naturale) e la fermentazione con inoculo di coltura starter
(Pretorius, 2000).
La fermentazione spontanea è un processo complesso durante il quale è possibile
osservare la sostituzione sequenziale di molte specie di lievito; la conversione dello
zucchero del mosto d'uva ad etanolo, CO2 ed altri metaboliti è affidata dapprima ai
lieviti selvaggi, indigeni, cioè quelli naturalmente presenti sull’uva e poi trasferiti nel
mosto con la pigiatura e successivamente a quelli presenti nell’ambiente di cantina
(superficie dei vasi vinari e delle varie attrezzature) e quindi capaci di contaminare in
13

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
modo più o meno importante il mosto appena pigiato. Sull'origine e sui tipi di lieviti
che provocano la fermentazione spontanea dei mosti d'uva e, più in generale, sugli
habitat dei lieviti, sono state eseguite numerose ricerche, le prime delle quali
risalgono all'800.
La microflora delle uve, (generi Nadsonia, Hanseniaspora, Saccharomycodes,
Wiekerhamiella e Kloeckera), varia con la varietà dell'uva, con la temperatura, la
piovosità e altri fattori climatici, con il suolo, la fertilizzazione, l'irrigazione e le
pratiche viticolturali, con la fase di sviluppo in cui le uve sono esaminate, con i danni
fisici causati dalle muffe, dagli insetti e dagli uccelli e con i fungicidi utilizzati nel
vigneto (Pretorius et al., 1999). Anche le attrezzature di raccolta, che comprendono
raccoglitori meccanici, cesti di raccolta ed altri contenitori di distribuzione non
frequentemente puliti, possono rappresentare siti per l'accumulo dei lieviti e per
attività microbiche prima che le uve raggiungano la cantina (Fugelsang, 1997).
A conferma di quanto descritto precedentemente, una serie di analisi microbiologiche
della flora lievitiforme associata alla fermentazione naturale del mosto ha rivelato
che, nella maggior parte delle aree enologiche, c’è un uso sequenziale del substrato:
inizialmente i lieviti apiculati asporigeni e sporigeni (Hanseniaspora/Kloeckera)
sono i più abbondanti, sebbene dopo 3-4 giorni di fermentazione essi vengano
rimpiazzati dai lieviti ellittici del genere Saccharomyces, ed in particolare dal S.
cerevisiae, i quali prendono il sopravvento sui primi portando a termine il processo
fermentativo (Martini, 1993; Pretorius, 2000). Per di più, durante le varie fasi di
fermentazione è possibile isolare altri lieviti appartenenti ai generi Candida, Pichia,
Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces e
Metschnikowia (Fleet et al., 1984; Heard & Fleet, 1985; 1986; Pardo et al., 1989). La
crescita di specie non-Saccharomyces appartenenti ai generi
Kloeckera/Hanseniaspora e Candida è generalmente limitata ai primi giorni di
fermentazione, a causa della loro scarsa tolleranza all’alcol. Comunque, studi
microbiologici quantitativi sulla fermentazione del mosto d’uva hanno mostrato che
Kloeckera apiculata e Candida stellata possono sopravvivere a livelli significativi
(fino a 10 6 -10 7 UFC/ml) durante il processo fermentativo, e per periodi più lunghi di
quanto precedentemente creduto (Fleet et al., 1984; Heard & Fleet, 1985; Pardo et
al., 1989).
14

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
La presenza e la permanenza di questi lieviti non-Saccharomyces durante tutta la
fermentazione sono influenzate da diversi fattori fisico-chimici e microbiologici.
Alcuni ricercatori, inoltre, hanno mostrato che K. apiculata e C. stellata presentano
maggiore tolleranza all’etanolo alle temperature più basse (10-15°C) (Gao & Fleet,
1988). Questo comportamento è stato confermato anche in fermentazioni condotte
con colture miste di K. apiculata e S. cerevisiae (Erten, 2002). Tali aumenti riguardo
alla tolleranza all’etanolo da parte dei lieviti non-Saccharomyces alle basse
temperature sembra essere un fattore di un’importanza tale da rappresentare un
vantaggio per il loro impiego nelle fermentazioni a bassa temperatura.
Studi più recenti hanno sottolineato il ruolo importante della concentrazione
dell’ossigeno sulla sopravvivenza di alcuni lieviti non-Saccharomyces durante la
fermentazione, come Torulaspora delbrueckii e Kluyveromyces thermotolerans
(Hansen et al., 2001).
Inoltre è stato dimostrato che le interazioni intercellulari sono coinvolte
nell’inibizione di queste due specie di non-Saccharomyces (vedi cap. 1.6), dal
momento che in presenza di elevate concentrazioni di cellule vitali di S. cerevisiae,
viene inibita la crescita di T. delbrueckii e K. thermotolerans (Nissen & Arneborg,
2003; Nissen et al., 2003).
È stato ipotizzato anche che una causa della morte precoce di Hanseniaspora
guillermondii nelle fermentazioni miste sia rappresentata dalla produzione di
composti tossici da parte di S. cerevisiae (Perez-Nevado et al., 2006). Infatti, alcuni
composti prodotti dai lieviti durante la fermentazione del mosto possono svolgere
una funzione inibitoria verso altre specie o altri ceppi di lievito.
In aggiunta all’etanolo, anche l’acido acetico, gli acidi grassi a media catena,
l’acetaldeide e l’azione sinergica svolta dalla combinazione di questi composti
possono giocare un ruolo importante nel meccanismo inibitore che può instaurarsi
durante la fermentazione vinaria (Edwards et al., 1990; Bisson, 1999; Ludovico et
al., 2001; Fleet, 2003).
In definitiva, numerose specie di lieviti possono essere presenti nelle varie fasi di
fermentazione dei mosti, ma quelle che giocano un ruolo costante e preponderante
sono soltanto due: Kloeckera apiculata e Saccharomyces cerevisiae. Il primo, è
dominante nelle prime fasi della fermentazione; il secondo, lo è in un momento
successivo; quando cioè gli apiculati rallentano e arrestano la loro attività, essendo
15

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
dotato del più elevato potere alcoligeno, diventa padrone assoluto del mezzo in cui
completa la fermentazione fino ad esaurimento degli zuccheri. Questo fatto potrebbe
essere messo in rapporto con la grande diffusione di K. apiculata e con la sua
preponderante presenza anche sull’uva; invece, Saccharomyces cerevisiae ricorre in
numero assai basso sugli acini sani, non danneggiati ed è raramente isolato su di essi,
come pure dal suolo del vigneto (Martini, 1993). S. cerevisiae, d’altro canto, è
abbondante nel succo d'uva e nel mosto che ricopre le superfici delle attrezzature di
cantina, formando un'importante componente della cosiddetta flora "residenziale" o
"di cantina" (Fleet & Heard, 1993). Il suo predominio nei vini è conseguenza
esclusiva di diverse condizioni, quali l’elevato grado alcolico, che lo favoriscono
rispetto a tutti gli altri lieviti, guadagnandosi in tal modo il titolo di "lievito del vino"
(Zambonelli, 1988).
Le fermentazioni spontanee possono dare vini di alta qualità con un carattere
regionale unico, che fornisce distinzione ed un valore commerciale aggiunto in un
mercato molto competitivo. Sfortunatamente, affidarsi alla natura implica una minore
prevedibilità dell’esito del processo, dovuta al rischio di insorgenza di problemi di
natura microbiologica nel decorso della fermentazione, come fermentazioni lente o
interrotte, ed incostanza nella qualità del vino. Ciò nonostante, una buona parte del
vino viene commercialmente prodotto mediante questo processo, soprattutto nei
paesi europei, specialmente in Italia ed in particolare per i vini di pregio (Rainieri &
Pretorius, 2000; Mannazzu et al., 2002). Generalmente per condurre con successo
questo tipo di fermentazioni è necessaria una combinazione di competenze tecniche e
artigianali, tali da ridurre al minimo il rischio di andare incontro a processi incostanti
e a possibili inconvenienti.
La fermentazione si definisce, invece, inoculata o “indotta” quando si utilizzano
lieviti selezionati del commercio (direttamente o previa riattivazione), al fine di
indurre e portare a termine la fermentazione alcolica con una certa garanzia dell’esito
della trasformazione, sia in termini di andamento del processo fermentativo sia in
termini di qualità del prodotto finale. Ci si aspetta che, attraverso l’impiego di tale
tecnica, le colture inoculate di S. cerevisiae sopprimano sia le specie non-
Saccharomyces sia i ceppi Saccharomyces indigeni, e che dominino la
fermentazione. Inoltre, l’uso di agenti antisettici, come l’anidride solforosa, alla
16

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
quale la maggior parte dei lieviti non-Saccharomyces è scarsamente resistente,
potrebbe garantire la dominanza dei ceppi inoculati.
In questo contesto, dunque, l’uso di colture starter selezionate di S. cerevisiae può
giocare un ruolo importante nella soppressione dei lieviti selvaggi.
Le fermentazioni inoculate con colture starter offrono i vantaggi di un processo più
rapido e prevedibile, portando alla produzione di vini con una maggiore costanza
qualitativa. Queste rappresentano tecniche fermentative adatte alla produzione di vini
destinati alla maggior parte dei mercati, ed il loro apprezzamento da parte
dell’industria del vino è stato accresciuto dalla disponibilità commerciale di preparati
secchi di ceppi di lievito selezionati, che possono essere facilmente reidratati per
essere inoculati nel mosto (Degre, 1993; Manzano et al., 2006). Parecchi ceppi di S.
cerevisiae e S. bayanus sono disponibili come preparati commerciali, e questi lieviti
sono stati selezionati sulla base di vari criteri (vedi cap. 1.4), che includono la loro
capacità di conferire al vino un determinato carattere (Pretorius, 2000; Bisson, 2004).
In effetti, un lievito selezionato è tale se risponde meglio di altri a criteri di selezione
prestabiliti in funzione del tipo di azione e di prodotto che si vuole ottenere.
I criteri di selezione includono non solo l’assenza di caratteri indesiderati
(fermentazione a lenta accensione per vari motivi quali: presenza di residui di
fitofarmaci, solfitazione, scarsa presenza di lieviti specie nella vinificazione di
piccoli volumi, formazione di quantità eccessive di acidi volatili, formazione di
schiume alte e persistenti, sviluppo di microbi non graditi), ma anche, e oggi
soprattutto, la presenza e l’espressione di caratteri desiderati. (Delfini & Ciolfi,
1979). Il ceppo selezionato è quindi addizionato, sotto forma di lievito secco e attivo
(LSA), e porta a termine il processo fermentativo, impartendo al vino la sua
“impronta aromatica”.
Tuttavia, sta sempre di più aumentando la convinzione che le colture starter di lieviti
vinari possano essere carenti dal punto di vista della complessità aromatica e possano
essere troppo standardizzate da conferire poco carattere al vino (Rainieri & Pretorius,
2000; Mannazzu et al., 2002). Comunque, tali critiche stanno generando nuove sfide
per aumentare il gradimento ed il valore del vino prodotto con questa tecnologia di
fermentazione. Questo si sta ottenendo sia, come abbiamo già descritto, mediante la
selezione e lo sviluppo di nuovi ceppi di colture starter di lievito sia attraverso la
17

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
conduzione di fermentazioni con miscele controllate di diverse specie e differenti
ceppi di lievito.
Tali approcci hanno ora una maggiore possibilità di successo, in quanto c’è una più
chiara comprensione dell’ecologia del lievito nelle fermentazioni vinarie, e su come
questa ecologia possa essere gestita nelle condizioni operative di cantina. Una
maggiore conoscenza della biochimica e della fisiologia del lievito, inoltre, sta
permettendo la selezione e lo sviluppo di ceppi di lievito che abbiano definite e
specifiche influenze sull’efficienza del processo e sulla qualità del vino.
Ritornando all’ecologia della fermentazione, alcuni studi condotti più di 25 anni fa
hanno mostrato che la crescita di K. apiculata e C. stellata non viene soppressa nelle
fermentazioni inoculate con colture selezionate di S. cerevisiae (Heard & Fleet,
1985; Martinez et al., 1989), mentre altri studi hanno rivelato una loro presenza
quantitativamente significativa anche durante le varie fasi di fermentazione condotta
da ceppi di S. cerevisiae inoculati (Bouix et al., 1981; Martinez et al., 1989; Ciani &
Rosini, 1993; Mannazzu et al., 2007).
La dominanza dei ceppi inoculati non viene così sempre assicurata e potrà dipendere
dalle specifiche condizioni di vinificazione, come la quantità e la vitalità dell’inoculo
ed il suo corretto uso, le caratteristiche fisiologiche e metaboliche delle colture di
lievito selezionate per l’inoculo e la tecnologia impiegata nella vinificazione
(chiarifica, temperatura di fermentazione, addizione di anidride solforosa, ecc…)
(Amerine & Cruess, 1960; Benda, 1982; Reed & Nagodawithana, 1988; Ciani &
Rosini, 1993).
Con la disponibilità commerciale di colture secche attive di S. cerevisiae, l’inoculo
del mosto d’uva è diventato interessante e conveniente (Kraus et al., 1983; Barre &
Vezinhet, 1984). Come tale, al momento, l’impiego di colture selezionate di lievito è
molto diffuso sia nei paesi che più di recente si sono dedicati alla produzione di vino,
come gli Stati Uniti, il Sud Africa e l’Australia, sia nei paesi produttori più
tradizionali, come l’Italia, la Francia e la Germania (Reed & Nagodawithana, 1988;
Fleet & Heard, 1993).
In questo contesto, l’uso massiccio di colture starter in tutte le aree vitivinicole del
mondo rappresenta un importante vantaggio nella biotecnologia del vino.
18

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
Tuttavia, l’uso generalizzato di colture starter selezionate è una semplificazione della
popolazione microbica fermentante che provoca la standardizzazione e
l’appiattimento delle proprietà analitiche e sensoriali dei vini (Ciani et al., 2009).
1.4 Caratteristiche dei ceppi di lievito starter per l’enologia
I criteri per la selezione e lo sviluppo di lieviti per le fermentazioni vinarie sono
oggetto di studio già da molti anni (Degre, 1993; Rainieri & Pretorius, 2000;
Mannazzu et al., 2002; Pretorius & Bauer, 2002; Bisson, 2004; Schuller & Casal,
2005). Sostanzialmente questi criteri possono essere considerati appartenere a tre
categorie: proprietà che influenzano la performance del processo fermentativo,
proprietà che determinano il carattere e la qualità del vino e proprietà che riguardano
la produzione commerciale dei lieviti vinari. All’interno di ciascuna categoria ci sono
proprietà più o meno variabili per significato ed importanza, alcune delle quali sono
essenziali, mentre altre sono desiderabili.
La fermentazione veloce, vigorosa e completa degli zuccheri del mosto d’uva con la
produzione di alte concentrazioni di etanolo (> 8% v/v) rappresenta un requisito
essenziale per i lieviti vinari. Il lievito, inoltre, dovrebbe essere tollerante alle
concentrazioni di anidride solforosa aggiunta al mosto come antiossidante ed
antimicrobico, dovrebbe mostrare una distribuzione uniforme e mescolarsi
completamente nel mezzo di fermentazione, dovrebbe produrre poca schiuma e
dovrebbe sedimentare velocemente a fine fermentazione. Queste caratteristiche
biotecnologiche dovrebbero essere bene espresse a basse temperature (circa 15°C)
per le fermentazioni dei vini bianchi e a più alte temperature (circa 25°C) per le
fermentazioni dei vini rossi. È molto importante, inoltre, che il lievito non provochi
fermentazioni lente o interrotte (Bisson, 1999).
Per quanto riguarda la qualità ed il carattere del vino, è essenziale che questi lieviti
producano una bilanciata quantità di metaboliti aromatici, senza eccessi di composti
volatili indesiderati come acido acetico, etil acetato, idrogeno solforato e anidride
solforosa. Tali lieviti non dovrebbero produrre, una volta terminata la fermentazione,
aromi autolitici indesiderabili e non dovrebbero influenzare negativamente il colore
del vino e le sue caratteristiche tanniche. Essenzialmente, il lievito deve dare un vino
19

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
con un flavour ben definito, privo di difetti sensoriali, e che consenta al consumatore
di percepire il carattere sensoriale del vitigno (Lambrechts & Pretorius, 2000; Bisson,
2004; Swingers et al., 2005).
Le aziende che producono lieviti per l’industria enologica hanno anche necessità
essenziali che devono essere considerate nel processo di selezione e sviluppo (Degre,
1993). Il costo di produzione ha bisogno di essere contenuto in modo che il prodotto
finale sia accessibile per l’industria del vino. Di conseguenza, il lievito deve poter
essere prodotto su larga scala impiegando substrati relativamente poco costosi come
il melasso. Successivamente tale lievito ha bisogno di essere resistente agli stress di
seccaggio, di confezionamento ed immagazzinamento e, alla fine, di reidratazione e
riattivazione da parte del vinificatore (Soubeyrand et al., 2006). Questi requisiti
devono essere posseduti senza la perdita delle proprietà essenziali e desiderabili per
la vinificazione.
Sebbene le tecnologie per la selezione, lo sviluppo e la produzione di lieviti vinari
con buone caratteristiche enologiche siano ben comprovate, stanno crescendo le
pressioni ambientali per un’industria enologica che sia più efficiente e sostenibile, e
stanno aumentando anche le domande da parte dei consumatori per vini con carattere
più specifico e definito, che comprendono quelli con proprietà più salutari, come un
minor contenuto di etanolo e maggiori livelli di composti antiossidanti (Bisson et al.,
2002; Bisson, 2004). Questi obiettivi richiedono un approccio nello sviluppo di
lieviti vinari più strategico rispetto al passato. A questo scopo è necessario definire
quel carattere enologico desiderato e quella proprietà qualitativa per indirizzare il
processo di selezione e sviluppo del lievito nella direzione voluta, senza però
compromettere le caratteristiche enologiche essenziali già menzionate. Molti
specialisti del settore, in genere, descrivono questi obiettivi, che riguardano la ricerca
e lo sviluppo, appartenenti a cinque categorie (Pretorius & Bauer, 2002; Bisson,
2004; Pretorius & Hoj, 2005; Verstrepen et al., 2006). Supportate da alcuni esempi,
tali categorie vengono qui di seguito descritte. Una migliore performance di
fermentazione determinata da lieviti con una maggiore efficienza nell’utilizzare gli
zuccheri e l’azoto, con una maggiore tolleranza all’etanolo e con una minore
produzione di schiuma. Una migliore efficienza di processo determinata da lieviti
con una maggiore produzione di enzimi extracellulari come proteasi, glucanasi e
pectinasi, per facilitare la chiarificazione dei vini, da lieviti con alterate proprietà
20

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
superficiali per accrescerne all’occorrenza la sedimentazione, il galleggiamento e la
formazione del “flor” e da lieviti capaci di condurre fermentazioni alcoliche e malo-
lattiche combinate. Un miglior controllo dei microrganismi contaminanti del vino
determinato da lieviti che producono lisozima, batteriocine e anidride solforosa che
limitano i batteri alterativi. Una migliore salubrità del vino determinata da lieviti che
producono meno etanolo, meno etilcarbammato e meno amine biogene, e che sono
caratterizzati da una maggiore produzione di resveratrolo e antiossidanti. Infine, una
migliore qualità sensoriale del vino determinata da lieviti che causano un maggiore
rilascio di terpenoidi e tioli volatili dal mosto, che incrementano la produzione di
glicerolo ed esteri desiderabili, che possono modulare l’acidità e che hanno la
capacità di ottimizzare la presenza dei polifenoli nel mosto (Fleet, 2008).
Durante gli ultimi 50 anni, la produzione vinaria si è trasformata in un processo
moderno e industrializzato, in gran parte basato sull’attività di due sole specie di
lievito: S. cerevisiae e S. bayanus. Gli sviluppi futuri continueranno ad essere
indirizzati verso l’applicazione e la valorizzazione di queste specie di lievito, ma non
possiamo trascurare le opportunità di innovazione che prevedono l’impiego di altre
specie di lievito. Come sappiamo, varie specie di Hanseniaspora, Candida,
Kluyveromyces e Pichia giocano importanti ruoli nelle prime fasi della
fermentazione vinaria, ma ora sta crescendo l’interesse verso un più strategico
impiego di queste specie come nuove colture starter (Ciani & Maccarelli, 1998;
Heard, 1999; Ciani et al., 2002; Jolly et al., 2003). Le loro limitazioni riguardo la
tolleranza all’etanolo possono rappresentare un ostacolo nella produzione di vini con
un accettabile contenuto di etanolo finale. Varie specie di Zygosaccharomyces,
Saccharomycodes e Schizosaccharomyces sono forti fermentanti e al tempo stesso
sono etanolo tolleranti. Sebbene questi vengano generalmente considerati lieviti
contaminanti, non c’è motivo di dubitare che un buon programma di selezione e
valutazione potrebbe portare alla scoperta di ceppi con proprietà enologiche
desiderabili tra questi lieviti non-Saccharomyces (Romano & Suzzi, 1993; Fleet,
2000). È necessario ricordare che non tutti i ceppi di S. cerevisae determinano la
produzione di vini accettabili e che anche all’interno di questa specie è stato
effettuato un processo sistematico di selezione e valutazione per ottenere i ceppi con
le caratteristiche desiderate (Degre, 1993). Nella ricerca e nello sviluppo di nuovi
lieviti, dunque, l’industria enologica del futuro dovrebbe anche guardare al di là delle
21

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
specie Saccharomyces; dovrebbe anche guardare al di là dell’uva e dare una
maggiore considerazione ad altri frutti da impiegare come materia prima
fermentabile. Con tale visione, molti nuovi lieviti e prodotti enologici aspettano di
essere scoperti.
Essenzialmente ci sono due strategie per ottenere nuovi ceppi di lieviti vinari da
sviluppare come colture starter commerciali: l’isolamento da fonti naturali e il
miglioramento genetico degli isolati naturali. Una volta che è stato ottenuto un
isolato con buone prospettive, viene sottoposto ad uno screening attraverso prove di
laboratorio utili a ricercare i criteri enologici essenziali, come già menzionato. Gli
isolati con proprietà accettabili individuati sono poi usati in microfermentazioni di
laboratorio e i risultanti vini sono poi sottoposti a valutazione sensoriale. I ceppi che
hanno mostrato buone proprietà fermentative e hanno prodotto vini di qualità
accettabile in tali condizioni sono poi selezionati per lo sviluppo e la preparazione di
nuove colture starter. Alcuni ricercatori del settore hanno proposto una strategia
sperimentale per la selezione e la valutazione di ceppi di lievito da sviluppare come
colture starter (Mannazzu et al., 2002). Molte applicazioni di questo approccio sono
state sfruttate anche da altri ricercatori (Regodon et al., 1997; Perez-Coello et al.,
1999; Esteve-Zarzoso et al., 2000; Cappello et al., 2004; Cocolin et al., 2004;
Nikolaou et al., 2006).
In genere, i lieviti vinari per lo sviluppo di colture starter vengono isolati da due
ambienti ecologici, cioè dal vigneto, in particolare dalle uve, e dalle fermentazioni
spontanee o naturali che hanno portato alla produzione di vini con qualità accettabili
e peculiari.
1.5 Fermentazioni multistarter controllate
Ci sono state polemiche sia sull’uso delle fermentazioni spontanee sia sull’impiego
di quelle inoculate con ceppi di lieviti selezionati, con particolare riferimento alle
qualità organolettiche del vino finale; perciò, sulla base di test sensoriali del vino,
alcuni autori hanno sostenuto i vantaggi di entrambi. Nel caso della fermentazione
spontanea, l’impatto dei diversi tipi di lieviti sull’aroma e sul sapore del vino può
essere poco consistente e, in aggiunta, tale processo risulta essere incontrollato.
22

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
Dall’altra parte, la totale soppressione delle specie indigene dei lieviti non-
Saccharomyces può ridurre la complessità aromatica del vino finale. Infatti, l’inoculo
di un ceppo di S. cerevisiae selezionato non solo può comportare l’inibizione dei
lieviti potenzialmente dannosi, ma anche di altre specie di lievito, la cui presenza nel
processo di fermentazione in quantità definite e per tempi definiti può contribuire
positivamente all’aroma del vino (Ciani et al., 2009). Quindi la presa di coscienza
che altri lieviti, oltre alle specie dei Saccharomyces, svolgano un ruolo importante
nelle fermentazioni vinarie sia dal punto di vista ecologico che metabolico, sta
ponendo le basi per un loro impiego più strategico e controllato nella produzione di
vino (Fleet, 2008). È stata già fatta menzione di un loro potenziale utilizzo come
unica coltura starter nello sviluppo di nuove tipologie di bevande fermentate, ma fino
ad oggi non sono stati studiati approfonditamente. Ad ogni modo, alcune specie di
questi lieviti non-Saccharomyces presentano una scarsa capacità di fermentare
completamente gli zuccheri del mosto d’uva e di produrre sufficienti concentrazioni
di etanolo; altre specie presentano una crescita troppo lenta rispetto ai lieviti indigeni
da non riuscire a permanere nel mezzo di fermentazione. Nonostante ciò, posseggono
altre proprietà di rilevanza enologica tali da doverne esaminare il valore. Per
esempio, alcune specie di Hanseniaspora/Kloeckera possono produrre maggiori
concentrazioni di aromi volatili desiderabili e quantità più elevate di glicosidasi e
proteasi rispetto alle specie Saccharomyces (Zironi et al., 1993; Capace et al., 2005;
Mendoza et al., 2007; Moreira et al., 2008), C. stellata fornisce accresciuti livelli di
glicerolo (Ciani & Comitini, 2006), K. thermotolerans offre aumentati livelli di acido
lattico (Mora et al., 1990), T. delbrueckii produce meno acido acetico (Lafon-
Lafourcade et al., 1981; Ciani et al., 2006; Bely et al., 2008) e le specie del genere
Schizosaccharomyces abbassano l’acidità del vino attraverso il metabolismo
dell’acido malico (Gao & Fleet, 1995; Taillandier et al., 1995).
La conduzione di fermentazioni vinarie avvalendosi dell’inoculo controllato di
miscele di colture starter di lieviti differenti rappresenta una strategia per sfruttare le
peculiari attività di tali lieviti, in quanto le fermentazioni multistarter naturali
rimangono un processo incontrollato, per cui devono essere impiegate in condizioni
meglio definite possibile (Ciani et al., 2009). In questo contesto, l’uso combinato o
23

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
sequenziale di differenti specie di lieviti starter nello sviluppo di nuove tecnologie di
fermentazione dovrebbe essere studiato attentamente.
Già da tempo, è stato suggerito l’impiego come colture starter di alcune specie di
lieviti non-Saccharomyces associate alla vinificazione, per le loro specifiche
caratteristiche metaboliche. È quindi possibile promuovere l’attività dei lieviti non-
Saccharomyces nella vinificazione, limitando o ritardando l’inoculo di colture starter
selezionate di S. cerevisiae. Questo concetto dunque non è nuovo, in quanto già molti
anni fa Castelli (1955) ha incoraggiato l’inoculo sequenziale di T. delbrueckii e S.
cerevisiae.
Comunque, questo approccio attira oggi sempre più interesse per il suo potenziale di
impartire specifiche caratteristiche ai vini e anche perché i produttori vinicoli hanno
una conoscenza più approfondita dell’ecologia e della biochimica della
fermentazione vinaria e di come gestire tale processo (Jolly et al., 2003). Questo
aspetto della tecnologia di vinificazione sarà molto probabilmente sviluppato in
applicazioni future.
Molti studi sono stati rivolti alla comprensione di come specie di lieviti non-
Saccharomyces interagiscano con S. cerevisiae durante la crescita e confrontati con il
comportamento delle monocolture degli stessi lieviti. Tali studi riportano
generalmente le cinetiche di crescita e di utilizzo del glucosio e del fruttosio, la
produzione di metabolici chiave come l’etanolo, l’acido acetico, il glicerolo,
l’etilacetato e in alcuni casi, anche vari alcoli superiori, acidi grassi e altri esteri
(Jolly et al., 2003). Essenzialmente, questi studi confermano che i lieviti non-
Saccharomyces crescono seguendo cinetiche simili a quelle osservate nelle
fermentazioni spontanee, ma determinate condizioni come la temperatura, l’aggiunta
di anidride solforosa, i livelli ed i tempi di inoculo, possono essere modulate per
aumentare la loro permanenza e quindi il loro contributo nel corso del processo
fermentativo. Non sempre i dati sono capaci di spiegare come queste interazioni
durante la crescita influenzino la produzione di metaboliti aromatici, ma molti studi
mostrano che caratteri indesiderati come l’eccessiva acidità volatile e l’elevata
concentrazione di esteri, prodotti da alcune specie di Hanseniaspora/Kloeckera, non
si manifestano quando questi lieviti crescono in colture miste con S. cerevisiae
(Herraiz et al., 1990; Zironi et al., 1993; Zorhe & Ertern, 2002; Mendoza et al., 2007;
24

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
Moreira et al., 2008). In alcuni casi, l’eccessiva produzione di etanolo risulta
diminuita nelle fermentazioni con colture miste, ma in altri casi questo non si
verifica. Le colture miste incidono sulla performance metabolica dei singoli ceppi e
delle diverse specie all’interno della miscela (Howell et al., 2006). I vini risultanti da
fermentazioni con colture miste di lieviti presentano una composizione di metaboliti
aromatici volatili diversa da quelli ottenuti mischiando semplicemente insieme i vini
prodotti da monocolture degli stessi ceppi di lievito (Fleet, 2008). Così, potrebbe
essere assai complesso e difficile predire in quale modo le interazioni metaboliche tra
i lieviti durante le fermentazioni miste possano influenzare la produzione di aromi
volatili nel vino. Di conseguenza, la valutazione finale di tali fermentazioni dovrebbe
essere basata su prove di analisi sensoriale, ma sfortunatamente pochi studi riportano
questi dati. In questo contesto, risulta essere molto significativo uno studio che
riporta il risultato dell’analisi chimico-sensoriale di un vino Chardonnay prodotto
dalla fermentazione con una coltura mista di C. stellata e S. cerevisiae (Soden et al.,
2000). L’impatto sensoriale della C. stellata, come pure la sua produzione di elevati
livelli di glicerolo, risultavano evidenti solo quando tale lievito veniva impiegato
seguendo un protocollo di inoculo sequenziale, cioè inoculo prima della C. stellata e
poi del S. cerevisiae, rispetto a quando le due specie venivano inoculate entrambe al
tempo zero. In un lavoro di ricerca sono state allestite delle fermentazioni in scala di
laboratorio inoculando S. cerevisiae insieme rispettivamente a ciascuna specie
Candida collicosa, C. stellata, K. apiculata e Candida pulcherrima (Jolly et al.,
2003). I vini caratterizzati da migliori proprietà sensoriali sono stati quelli ottenuti
dalle fermentazioni con inoculo misto di lieviti, ma questa qualità sensoriale può
dipendere anche dalla varietà dell’uvaggio e dal tempo di invecchiamento del vino.
L’impatto dei lieviti non-Saccharomyces sulle fermentazioni in coltura mista con S.
cerevisiae può essere più definito quando si ricercano determinati caratteri enologici,
come la disacidificazione biologica del mosto e/o vino attraverso la diminuzione
della concentrazione di acido malico o per prevenire l’eccesso di acidità volatile e
valorizazzare i profili organolettici nella produzione di vini dolci (Fleet, 2008).
Da qualche tempo è stato suggerito l’impiego di S. pombe per ridurre la
concentrazione di acido malico sia nei mosti che nei vini (Peinaud & Sudrad, 1962;
Rankine, 1966; Munyon & Nagel, 1977). Alcuni autori hanno proposto l’inoculo
25

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
sequenziale di S. pombe e S. cerevisiae per migliorare la competizione tra lieviti e
ridurre o eliminare le caratteristiche sensoriali negative dovute a S. pombe (Snow &
Gallender, 1979). Probabilmente anche un programma di selezione per questo lievito
potrebbe essere utile per risolvere tali problemi. È stata valutata, inoltre, la
disacidificazione dei vini in condizioni industriali di vinificazione, utilizzando un
mutante di Schizosaccharomyces malidevorans (Thornton & Rodriguez, 1996). Un
processo di disacidificazione biologica più controllato è stato ottenuto utilizzando S.
cerevisiae e le cellule immobilizzate di S. pombe (Magyar & Panyik, 1989;
Yokotsuka et al., 1993; Ciani, 1995). In questo processo, S. cerevisiae ha condotto la
fermentazione utilizzando quasi tutti gli zuccheri disponibili, mentre le cellule
immobilizzate di S. pombe hanno consumato l’acido malico; in queste condizioni, gli
effetti indesiderati di S. pombe sulla qualità del vino sono stati limitati o quasi
completamente eliminati. Già da qualche anno, ormai, sono state proposte le cellule
immobilizzate essiccate di S. pombe per il consumo di acido malico durante la
vinificazione (Silva et al., 2003), ed è ora disponibile un ceppo commerciale di S.
pombe in forma immobilizzata per ridurre il contenuto di acido malico nel vino.
Oltre a S. pombe, anche un ceppo di Issatchenkia orientalis può degradare
rapidamente l’acido malico (Seo et al., 2007), per cui è stato proposto in coltura
mista con S. cerevisiae per ridurre l’acido malico contenuto nel vino (Kim et al.,
2008).
Recentemente è stata valutata l’influenza delle colture miste e sequenziali di T.
delbrueckii e S. cerevisiae nella fermentazione al fine di migliorare la qualità dei vini
e ridurre il contenuto di acido acetico (Bely et al., 2008). Le colture miste T.
delbrueckii-S. cerevisiae in rapporto 20:1 hanno determinato la riduzione del 53%
dell’acidità volatile e del 60% dell’acetaldeide, mentre le colture sequenziali hanno
mostrato effetti minori sulla riduzione di questi metabolici.
A causa del fatto che K. thermotolerans presenta delle caratteristiche enologiche
positive, come la bassa produzione di acidità volatile e l’alta produzione di acidità
fissa (acido L-lattico), alcuni ricercatori ne hanno esaminato un suo impiego nella
fermentazione vinaria per migliorare le caratteristiche analitiche e sensoriali dei vini
(Mora et al., 1990). Allo scopo di ottenere l’acidificazione biologica del vino, è stata
studiata una coltura mista di K. thermotolerans e S. cerevisiae, che ha fornito un
26

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
aumento fino al 70% dell’acidità titolabile e di conseguenza una riduzione di 0,3
unità del pH (Kapsopoulou et al., 2005; 2007).
L’uso di un processo di fermentazione multistarter è stato proposto anche per
simulare una fermentazione naturale, al fine di conferire maggiore complessità al
vino. È stata analizzata l’influenza di colture pure, miste e sequenziali di K.
apiculata, T. delbrueckii e S. cerevisiae sulla componente volatile dei risultanti vini,
mostrando evidenti differenze nel metabolismo di S. cerevisiae in coltura pura e
mista (Herraiz et al., 1990). Altre valutazioni dei metaboliti volatili prodotti da
colture miste e sequenziali di lieviti apiculati e S. cerevisiae hanno confermato questi
risultati (Zironi et al., 1993). Sono state valutate anche le fermentazioni multistarter
(miste e sequenziali) di T. delbrueckii e K. thermotolerans con S. cerevisiae per
ottimizzare le fermentazioni vinarie con inoculi misti di queste specie di lieviti non-
Saccharomyces (Ciani et al., 2006). In questo contesto, sono ora disponibili in
commercio miscele di lieviti secchi attivi di S. cerevisiae-K. thermotolerans-T.
delbrueckii denominate Vinfloras Harmony.nsac (Christian Hansen) e della
monocoltura di Zygosaccharomyces bailii.
Recentemente, diversi studi hanno indagato le fermentazioni multistarter con lieviti
apiculati e S. cerevisiae. È stata studiata l’influenza della temperatura e dell’anidride
solforosa sulla crescita e sul metabolismo di K. apiculata e S. cerevisiae in
fermentazione mista, mostrando un incremento della vitalità da parte di K. apiculata
(Mendoza et al., 2007). Studi sull’influenza di H. uvarum e H. guillermondii nella
produzione di composti solforati, di alcoli superiori e di esteri durante le
fermentazioni miste con S. cerevisiae hanno evidenziato un miglioramento della
produzione dei composti desiderabili (Moreira, 2005; Moreira et al., 2008). In
particolare, nella fermentazione mista H. uvarum ha determinato l’aumento di
acetato di isoamile contenuto nel vino, mentre H. guillermondii ha causato un
incremento di 2-feniletil acetato (Moreira et al., 2008).
Come già detto, l’uso combinato dei lieviti vinari S. cerevisiae e non-Saccharomyces
è stato anche proposto allo scopo di migliorare il contenuto di glicerolo nel vino
(Ciani & Ferraro, 1996). In questo processo di fermentazione, un ceppo di C.
stellata, che è stato recentemente riclassificato come Starmerella bombicola
(Sipiczki et al., 2005) è stato usato come biocatalizzatore in forma immobilizzata. La
27

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
fermentazione del mosto d’uva svolta dalla combinazione di cellule immobilizzate di
C. stellata e S. cerevisiae ha comportato il miglioramento della composizione
analitica del vino ottenuto (Ciani & Ferraro, 1998).
Questi risultati sono stati confermati anche mediante un processo di vinificazione su
scala pilota (Ferraro et al., 2000).
Anche Candida cantarellii, un’altra specie di lievito fermentante di ambito vinario, è
stata proposta in fermentazioni multistarter per migliorare il contenuto di glicerolo e
per sviluppare vini con caratteristiche peculiari (Toro & Vazquez, 2002).
Le fermentazioni miste sono state proposte anche per migliorare la produzione di
specifici composti volatili che determinano l’aroma del vino. Garcia et al. (2002)
hanno proposto l’uso di una coltura mista di Debaryomyces vanriji e S. cerevisiae
per aumentare i composti volatili, in particolare il geraniolo, nel vino Moscato. Più
recentemente è stata proposta la cofermentazione con S. cerevisiae e Pichia Kluyveri
per aumentare la concentrazione dei tioli varietali nel Sauvignon Blanc (Anfang et
al., 2009). Questo studio ha dimostrato che un rapporto di inoculo iniziale pari a 1:9
tra S. cerevisiae e Pichia kluyveri ha incrementato le concentrazioni di 3-
mercaptoesil acetato nel Sauvignon Blanc. Pichia fermentans, un altro lievito di
interesse vinario, è stato proposto per la fermentazione multistarter con S. cerevisiae
(Clemente-Jimenez et al., 2005); da cui è emerso che un’influenza positiva da parte
del lievito non-Saccharomyces sui diversi composti volatili e sui sottoprodotti di
fermentazione è stata mostrata solo nella coltura sequenziale con l’inoculo del S.
cerevisiae dopo 2 giorni. In un'altra indagine, alcuni lieviti non-Saccharomyces sono
stati studiati per un possibile utilizzo nell’invecchiamento dei vini rossi sulle feccie
(Palomero et al., 2009).
Pertanto, i lieviti vinari non-Saccharomyces presentano alcune specifiche
caratteristiche enologiche che non si trovano nella specie S. cerevisiae e che possono
avere effetti positivi sui vini. L’uso controllato di colture miste di lieviti vinari S.
cerevisiae e non-Saccharomyces può migliorare i parametri analitici ed il profilo
aromatico attraverso le interazioni metaboliche tra le diverse specie di lievito
(Languet et al., 2005; Salmon et al., 2007). In questo contesto, l’uso della tecnica di
28

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
immobilizzazione nelle colture miste permette il controllo accurato del processo
multistarter, e diversi studi hanno proposto il suo utilizzo.
Tutti questi studi forniscono un’ottima base per il futuro sviluppo di tecnologie di
fermentazione vinaria basate sull’impiego controllato di colture miste di lieviti. Una
ricerca più approfondita, inoltre, è necessaria per capire i meccanismi biologici di
come i lieviti interagiscano ecologicamente e metabolicamente quando si sviluppano
in colture miste, sia coinoculate che sequenziali, durante un processo di
vinificazione. Questi essenziali studi devono essere corroborati da accurate
valutazioni sensoriali dell’aroma e del colore del vino così da ottenere risultati di
utilità pratica.
1.6 Interazioni tra lieviti durante la fermentazione
In ambito ecologico viene descritta una vasta serie di associazioni interattive tra
microrganismi (Boddy & Wimpenny, 1992). Queste sono il neutralismo, il
commensalismo, il mutualismo o sinergismo, l’amensalismo o antagonismo, la
predazione o parassitismo e la competizione. Per quanto concerne la pratica della
vinificazione, i risultati più interessanti di queste interazioni riguardano la capacità di
migliorare o inibire la crescita di particolari specie o ceppi. All’interno
dell’ecosistema vino ci sono numerosi meccanismi attraverso cui un lievito può
influenzare la crescita di un altro lievito o di altri microrganismi, come batteri e
funghi.
La crescita precoce di lieviti nel mosto d’uva determina il consumo completo o
parziale dei nutrienti in esso contenuti, rendendo il risultante vino un ambiente meno
favorevole per un successivo sviluppo microbico. Per di più, tale crescita produce
una serie di metaboliti, molti dei quali potrebbero risultare tossici per altre specie. Gli
effetti inibitori dell’etanolo e degli acidi grassi a corta catena verso molti
microrganismi sono ben documentati (Bisson, 1999; Bauer & Pretorius, 2000; Fleet,
2001). La produzione e la liberazione di anidride carbonica causano nel mosto-vino
la carenza di ossigeno, una condizione che limita fortemente la crescita delle specie
29

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
aerobiche. Molte specie possono produrre peptidi inibitori, proteine o glicoproteine,
come le tossine killer, ed enzimi in grado di uccidere altre specie attraverso la lisi
della loro parete cellulare. Al tempo stesso, ci sono anche meccanismi che inducono
una maggiore crescita microbica. L’enorme quantitativo di biomassa di lievito
prodotto durante la fermentazione finirà per morire e subire autolisi, rilasciando
aminoacidi e vitamine che possono promuovere la crescita di altre specie in fasi
successive del processo fermentativo (Fleet, 2001). Questa biomassa, inoltre,
potrebbe essere impiegata come agente bioadsorbente per rimuovere sostanze
tossiche, come ioni metallici e fenoli, dall’ecosistema. Le specie di lievito con
capacità proteolitiche e pectinolitiche possono idrolizzare le proteine e le pectine del
mosto per produrre substrati nutritivi che permettano la crescita di altre specie
(Charoenchai et al., 1997).
Il concetto di “quorum-sensing”, inteso come un meccanismo attraverso il quale le
cellule microbiche comunicano tra loro e regolano la crescita della popolazione
microbica è già stato preso in considerazione nell’ambito della microbiologia
enologica (Bisson et al., 1999). Ormai da più di dieci anni, è stato dimostrato che le
popolazioni batteriche regolano il loro comportamento e l’espressione di determinate
proprietà attraverso la produzione di molecole segnale a basso peso molecolare
(Whitehead et al., 2001). Queste molecole, chiamate segnali quorum-sensing,
vengono prodotte durante la crescita e, quando la loro concentrazione raggiunge una
certa soglia, esse attivano o inibiscono l’espressione genica per modificare il
comportamento dell’intera popolazione. Per quanto riguarda i lieviti, ci sono
evidenze sperimentali che il bicarbonato (Ohkuni et al., 1998), l’acetaldeide (Richard
et al., 1996) e l’ammonio (Palkova et al., 1997) possono funzionare come segnali di
comunicazione cellulare. Anche il farnesolo è stato identificato come molecola
quorum-sensing che inibisce il passaggio della specie Candida albicans dalla forma
di lievito allo stadio ifale e la propria capacità di formare biofilm (Hornby et al.,
2001; Ramage et al., 2002). Il quorum-sensing rappresenta un nuovo concetto in
enologia microbica e la ricerca si rende necessaria per capire la sua importanza
nell’ambito della produzione vinicola.
I lieviti sono i microrganismi più importanti nella produzione di vino,
determinandone il flavour ed altre caratteristiche organolettiche, attraverso una serie
30

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
di meccanismi ed attività. Sebbene S. cerevisiae rappresenti la principale specie per
la produzione di vino, altre specie di lievito possono svolgere ruoli importanti. Le
interazioni tra le diverse specie di lievito si stabiliscono durante le varie fasi della
fermentazione. La varietà di queste interazioni e la loro influenza sull’efficienza del
processo e sulla qualità del prodotto è necessario che siano identificate e valutate. È
ben chiaro che differenti ceppi all’interno della specie S. cerevisiae possono avere
diversi effetti sull’aroma del vino, come la variazione della produzione di glicerolo,
di acido acetico e di idrogeno solforato (Henschke, 1997). In modo simile accadrà
per i differenti ceppi di lievito che fanno parte di altre specie. Perciò, è necessario
considerare un comportamento interattivo tra lieviti, sia a livello di specie sia a
livello di ceppo.
La fermentazione alcolica è la principale attività attraverso cui i lieviti forniscono un
contributo più o meno positivo al flavour del vino (Henschke, 1997). Essi fanno
questo attraverso vari meccanismi: utilizzando i costituenti del mosto, producendo
etanolo ed altri solventi che aiutano ad estrarre le componenti aromatiche dalle parti
solide delle uve, producendo enzimi che trasformano i componenti neutri del mosto
in composti aromaticamente attivi, producendo molte centinaia di metaboliti
secondari aromaticamente attivi (acidi, alcoli, esteri, polioli, aldeidi, chetoni e solfuri
volatili) e determinando la degradazione autolitica delle cellule morte di lievito (Cole
& Noble, 1997; Lambrechts & Pretorius, 2000). Queste reazioni, in particolar modo
la produzione di metaboliti secondari, variano in base alla specie ed al ceppo di
lievito. Così, l’unicità e la peculiarità del contributo analitico e sensoriale dei lieviti
dipende dall’ecologia delle specie e dei ceppi fermentanti e dai molti fattori che
determinano questa ecologia (Fleet & Heard, 1993; Fleet, 2001).
Nell’ultima decade, ci sono stati notevoli progressi nella comprensione dell’ecologia
dei lieviti di interesse enologico (Fleet, 2001). La fermentazione del mosto d’uva
rappresenta un complesso ecosistema che comporta la crescita interattiva e le attività
biochimiche di una miscela di diverse specie e di diversi ceppi di lievito. Questi
lieviti provengono dalla microflora delle uve, dalla microflora associata alle superfici
delle attrezzature e dell’ambiente di cantina e dalle colture starter inoculate, se usate.
Generalmente, specie appartenenti ai generi Hanseniaspora, Candida e
Metschnikowia iniziano la fermentazione, e provengono in maggior parte dalle uve.
31

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
Talvolta, possono crescere in questa fase anche specie del genere Pichia,
Issatchenkia e Kluyveromyces. Questi lieviti crescono fino a concentrazioni di 10 6 -
10 7 UFC/ml ma, da metà fermentazione in poi, cominciano una fase di declino fino
alla completa scomparsa. A questo punto, S. cerevisiae diventa dominante e continua
al fermentazione fino a portarla a termine. Occasionalmente, la fermentazione può
non decorrere fino al suo completamento ed un’inaccettabile elevata concentrazione
(> 2-5 g/l) di zuccheri non fermentati rimane nel vino. Queste fermentazioni vengono
spesso definite incomplete o interrotte e rappresentano uno dei maggiori problemi
pratici per il vinificatore (Bisson, 1999). In aggiunta alla crescita in successione di
differenti specie di lievito durante il corso della fermentazione, c’è il sottostante
succedersi dello sviluppo di ceppi differenti all’interno di ciascuna specie.
Quest’ultima scoperta è divenuta più evidente con l’uso di tecniche molecolari, che
hanno permesso la differenziazione ed il riconoscimento dei ceppi (Pretorius, 2000;
Fleet, 2001). Fino a cinque o più ceppi di S. cerevisiae sono stati trovati in un unico
fermentato, e risultati analoghi sono stati ottenuti per molte specie non-
Saccharomyces (Schulz & Gaffner, 1993; Henick-Kling et al., 1998; Sabate et al.,
1998; Fleet, 2001).
Molti fattori influenzano la presenza e la crescita dei lieviti durante la fermentazione
alcolica. Questi comprendono la popolazione iniziale e la diversità delle specie e dei
ceppi nel mosto d’uva, l’inoculo del mosto con colture starter selezionate, la
composizione chimica del mosto che include alcuni residui di fungicidi e pesticidi, le
condizioni operative come la concentrazione in cui viene aggiunta l’anidride
solforosa e la temperatura di fermentazione, e le interazioni tra le differenti specie e i
differenti ceppi di lievito (Fleet & Heard, 1993; Bisson, 1999; Fleet, 2001).
La produzione di etanolo da parte di S. cerevisiae viene considerato uno dei fattori
più importanti che regola la crescita e influenza la persistenza delle specie di non-
Saccharomyces durante la fermentazione. Generalmente, le specie di Hanseniaspora,
Candida, Pichia, Kluyveromyces, Metschnikowia e Issatchenkia che si trovano nel
mosto non sono tolleranti a concentazioni di etanolo che superano il 5-7 %, e questo
spiega il loro decremento e la loro morte nella seconda metà del processo
fermentativo (Heard & Fleet, 1988; Gao & Fleet, 1988). Le basse temperature, però,
riducono la sensibilità di queste specie all’etanolo e, di conseguenza, le
32

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
fermentazioni vinarie condotte a temperature inferiori ai 15-20 °C possono ricevere
un maggior contributo da parte delle specie di Hanseniaspora e Candida. In certi
casi, possono risultare dominanti a fine fermentazione a livello di S. cerevisiae e, di
conseguenza, dovrebbero avere un impatto importante sul flavour del vino (Heard &
Fleet, 1988; Erten, 2002). Interessanti ricerche hanno dimostrato che alcuni ceppi di
Candida possono avere tolleranza all’etanolo simile a quella di S. cerevisiae
(Cocolin et al., 2001; Mills et al., 2002).
Schizosaccharomyces pombe, Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces
fermentanti sono ben noti per la loro tolleranza ad elevate concentrazioni di etanolo
(> 10 %) e per trovarsi negli ambienti di cantina (Romano & Suzzi, 1993; Fleet,
2000). Stranamente, solo di rado vengono identificati come microrganismi che
contribuiscono alla fermentazione del mosto, per cui tale aspetto richiede delle
specifiche ricerche. Probabilmente crescono più lentamente di altri lieviti vinari e, di
conseguenza, risultano scarsamente competitivi e possono venire inibiti dai fattori
prodotti dagli altri lieviti. Tutte e tre queste specie hanno la capacità di utilizzare
l’acido malico, che è una caratteristica positiva in molti casi di vinificazione.
Sebbene molti ceppi di queste specie sono noti per produrre composti indesiderati, un
programma di selezione e valutazione potrebbe identificare ceppi che esprimono
caratteri aromatici desiderabili. L’aumento della concentrazione di etanolo durante la
fermentazione alcolica potrebbe anche spiegare la crescita sequenziale dei ceppi
all’interno della stessa specie. Ceppi di S. cerevisiae, come pure quelli di altre specie
di lievito, variano per la loro tolleranza verso l’etanolo (Fleet, 1992; Bauer &
Pretorius, 2000; Bisson & Block, 2002). I ceppi dotati di elevata tolleranza
all’etanolo tendono probabilmente di più a dominare la seconda parte, piuttosto che
le prime fasi del processo fermentativo. Questo comportamento è stato dimostrato
sperimentalmente, insieme all’effetto interattivo della temperatura di fermentazione
(Torija et al., 2002), e diventa un aspetto importante nell’allestimento di miscele di
ceppi di lievito (oligo-ceppi) da impiegare come colture starter per incrementare la
complessità del flavour del vino (Grossman et al., 1996).
Gli acidi grassi a corta catena e a media catena, come gli acidi esanoico, ottanico e
decanoico, vengono prodotti durante la fermentazione alcolica e, oltre determinate
concentrazioni soglia, svolgono un’azione inibente nei confronti di S. cerevisiae e,
33

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
probabilmente, di altre specie di lievito (Viegas et al., 1989; Edward et al., 1990;
Bisson, 1999).
La disponibilità e la limitazione dei nutrienti possono rappresentare dei fattori che
modulano l’ecologia dei lieviti durante la fermentazione; una specie o un ceppo di
lievito, ad esempio, può produrre o utilizzare una determinata sostanza fondamentale
per il metabolismo di altre specie o di altri ceppi di lievito. Le prove sperimentali a
supporto di questo tipo di interazioni non sono molte, ma potrebbero essere avanzate
diverse ipotesi. I lieviti non-Saccharomyces sembrano essere meno tolleranti rispetto
al S. cerevisiae per quanto riguarda la scarsa disponibilità di ossigeno. Il consumo di
ossigeno residuo nel mosto in fermentazione da parte della crescita vigorosa di S.
cerevisiae potrebbe portare alla morte anticipata di queste specie non-Saccharomyces
(Hansen et al., 2001). Le specie non-Saccharomyces, sviluppandosi durante la prima
parte della fermentazione, potrebbero utilizzare aminoacidi e vitamine, limitando in
questo modo la successiva crescita di S. cerevisiae. Pubblicazioni scientifiche
riportano che K. apiculata potrebbe privare il mosto di tiamina e di altri
micronutrienti, causando una crescita insufficiente del S. cerevisiae (Bisson, 1999;
Mortimer, 2000). Allo stesso tempo, molte specie di non-Saccharomyces, come K.
apiculata e M. pulcherrima, sono fortemente proteolitiche (Charoenchai et al., 1997;
Dizzy & Bisson, 2000) e potrebbero produrre gli aminoacidi necessari al
metabolismo di S. cerevisiae. La morte precoce e l’autolisi di questi lieviti non-
Saccharomyces (Hernawan & Fleet, 1995) rappresenta un’altra possibile fonte di
nutrienti per S. cerevisiae e per i lieviti contaminanti. I polisaccaridi della parete
cellulare, principalmente mannoproteine, vengono rilasciati anche dall’autolisi del
lievito e questi potrebbero combinarsi con i tannini e gli antociani per influenzare
l’astringenza ed il colore del vino (Escot et al., 2001).
È ampiamente riportato in letteratura l’isolamento dal mosto in fermentazione di
ceppi di S. cerevisiae che producono tossine killer, di ceppi killer-sensibili e di ceppi
killer-resistenti (van Vuuren & Jacobs, 1992; Shimizu, 1993; Musmanno et al., 1999;
Gurierrez et al., 2001). Sebbene molti parametri del processo di vinificazione
influenzino l’espressione del fenotipo killer e killer-sensibile, ci sono prove evidenti
che le interazioni killer possono determinare lo sviluppo di certe specie e di certi
ceppi durante la fermentazione. Ceppi killer di ambito vinario sono stati isolati
34

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
all’interno dei generi Candida, Pichia, Kluyveromyces e Hanseniaspora e molti di
questi possono svolgere la loro azione killer nei confronti dei ceppi vinari di S.
cerevisiae (Fleet & Heard, 1993). Comunque, sono necessari studi mirati per
determinare la relazione tra le interazioni killer e l’influenza sul flavour del vino.
Quanto riportato finora dimostra che, quando i lieviti si sviluppano insieme durante
un processo fermentativo, non coesistono passivamente, ma piuttosto interagiscono e
producono un’imprecisabile varietà di composti e a differenti livelli di
concentrazione, che possono influenzare in vario modo la composizione chimica ed
aromatica dei vini; per cui appare di fondamentale importanza studiare le interazioni
fisiologiche e metaboliche tra S. cerevisiae e ceppi vinari di lieviti non-
Saccharomyces nelle fermentazioni multistarter controllate (Howell et al., 2006;
Anfang et al., 2009).
Possibili interazioni sinergiche tra i differenti lieviti potrebbero rappresentare uno
strumento per nuove tecnologie di fermentazione. Durante le fermentazioni miste la
produzione della biomassa dei lieviti Saccharomyces e non-Saccharomyces è
inferiore a quella prodotta dai singoli ceppi in coltura pura (Mendoza et al., 2007).
Comunque, la presenza contemporanea dei lieviti Saccharomyces e non-
Saccharomyces può determinare un aumento della persistenza dei non-
Saccharomyces durante il processo fermentativo (Ciani et al., 2006; Mendoza et al.,
2007). Sulla base di questi studi e di altre prove sperimentali, infatti, le interazioni tra
lieviti vinari Saccharomyces e non-Saccharomyces hanno effetto non solo sulla
persistenza del lievito non-Saccharomyces, ma anche sul comportamento dei ceppi di
S. cerevisiae. Questo può essere visto attraverso il cambiamento del grado di
flocculazione di K. apiculata e S. cerevisiae in coltura mista. Nelle fermentazioni
miste, il ceppo flocculante di K. apiculata interagisce con il ceppo non flocculante di
S. cerevisiae, inducendo la coflocculazione di questi due lieviti (Sosa et al., 2008).
L’influenza della fermentazione mista sui tassi di crescita e di morte dei lieviti S.
cerevisiae e non-Saccharomyces e sulle possibili interazioni sono tuttora oggetto di
studio. Le ricerche condotte sulle colture miste per valutare l’influenza del contatto
cellula-cellula tra i non-Saccharomyces, T. delbrueckii e K. thermotolerans, e S.
cerevisiae indicano la minore capacità di questi lieviti di competere per lo spazio in
35

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
confronto a S. cerevisiae. La causa di questo comportamento non è ancora chiara
(Nissen & Arneborg, 2003; Nissen et al., 2003).
I profili metabolici prodotti dalla fermentazione mostrano la presenza di interazioni
tra le colture starter di S. cerevisiae in coltura mista (Howell et al., 2006); anche
l’inoculo multistarter confrontato con la fermentazione in coltura pura rivela delle
differenze. Se, infatti, per riprodurre la composizione chimica dei vini ottenuti da
coltura mista, si mescolano i vini prodotti da coltura pura, non vengono spiegate
queste differenze. Più di recente, fermentazioni coinoculate utilizzando diverse
colture starter di S. cerevisiae hanno mostrato differenze nei profili chimici e
sensoriali sia rispetto alle fermentazioni in coltura pura sia rispetto ai vini prodotti
miscelando nello stesso rapporto quelli ottenuti dall’inoculo del singolo ceppo (King
et al., 2008).
Nelle colture miste Saccharomyces/non-Saccharomyces, le interazioni dovute
all’ampia diversità metabolica tra i differenti generi microbici dovrebbero essere più
marcate. Nel caso dell’interazione tra S. cerevisiae e S. bombicola, è stato visto un
consumo complementare di glucosio e di fruttosio (Ciani & Ferraro, 1998).
L’impiego di una fermentazione sequenziale in continuo e di cellule di lievito
immobilizzate, ha permesso di evidenziare lo scambio di acetaldeide tra queste due
specie di lievito. L’eccesso di acetaldeide prodotto da S. bombicola, dovuto alla
bassa attività dell’enzima alcol deidrogenasi (Ciani et al., 2000) veniva rapidamente
metabolizzato da S. cerevisiae, che è una specie più attiva nella fermentazione
alcolica (Ciani & Ferraro, 1998). Queste interazioni nella produzione-riduzione di
acetaldeide sono state riscontrate anche nelle fermentazioni miste con S. cerevisiae-
T. delbrueckii (Ciani et al., 2006; Bely et al., 2008) e con S. cerevisiae-K.
thermotolerans (Ciani et al., 2006).
L’acetoino rappresenta un altro composto coinvolto nelle interazioni tra due specie di
lievito nelle fermentazioni miste; questo viene abbondantemente prodotto da S.
bombicola in coltura pura e completamente metabolizzato da S. cerevisiae in
fermentazione mista (Ciani & Ferraro, 1998).
In letteratura sono state riportate anche prove di interazioni positive per la
produzione di composti volatili tra lieviti selvaggi e colture starter di S. cerevisiae
36

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
(Garde-Cerdan & Ancin-Azpilicueta, 2006), mostrando un incremento della
concentrazione degli esteri rispetto alle fermentazioni in coltura pura. Più
recentemente, ruoli importanti sono stati assegnati ai composti volatili nel
differenziare i vini prodotti con lieviti indigeni selvaggi da quelli ottenuti da lieviti
inoculati (Varela et al., 2009). Dal punto di vista chimico, la fermentazione con i
lieviti selvaggi era caratterizzata dall’incremento di 2-metilpropanolo, acido 2-
metilbutanoico, etil 2-metilpropanoato, etil decanoato ed etil dodecanoato. Le colture
miste con S. cerevisiae-H. uvarum e S. cerevisiae-H. guillermondii hanno
confermato la maggiore produzione di esteri e la riduzione di etil acetato nelle
fermentazioni miste rispetto a quelle in coltura pura (Moreira et al., 2008).
Per studiare l’efficacia delle fermentazioni miste nel migliorare i profili analitici, è
stato impiegato un ceppo mutante di P. anomala che produceva bassi livelli di etil
acetato (Kurita, 2008). In questo caso, la ridotta concentrazione di etil acetato ha
causato le interazioni tra il mutante di P. anomala e S. cerevisiae. La produzione di
etil acetato da parte di questo ceppo di P. anomala ha determinato l’aumento
dell’attività dello specifico enzima esterasico in S. cerevisiae. Come risultato, nei
fermentati da coltura mista si sono accumulate desiderate quantità di isoamil acetato,
senza un eccesso di etil acetato. Interazioni positive nelle fermentazioni miste sono
state mostrate anche per quanto riguarda la produzione di tioli (Anfang et al., 2009).
Infatti, la fermentazione mista con P. kluyveri e S. cerevisiae ha determinato un
incremento di 3-mercaptoesil acetato rispetto alle colture pure. Questa interazione
sembra essere a livello di ceppo piuttosto che a livello di specie, ma la natura
dell’interazione rimane sconosciuta.
1.7 Futuro dei lieviti non-Saccharomyces
Le fermentazioni miste impiegando colture starter controllate di lieviti S. cerevisiae e
non-Saccharomyces rappresenta un pratico metodo per incrementare la complessità e
per migliorare specifiche caratteristiche del vino. Comunque, le interazioni tra le
diverse colture starter che si instaurano durante la fermentazione e le modalità di
37

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
inoculo devono essere studiate ulteriormente. Infatti, la nostra conoscenza riguardo le
interazioni metaboliche tra lieviti vinari S. cerevisiae e non-Saccharomyces in
condizioni di vinificazione è ancora limitata. Poche ricerche, inoltre, sono state
condotte per conoscere le caratteristiche organolettiche dei vini, per cui dovrebbe
essere effettuata anche la valutazione del profilo sensoriale dei vini prodotti
attraverso le fermentazioni multistarter controllate.
Al fine di studiare le basi biochimiche, fisiologiche e molecolari delle interazioni tra
i lieviti in condizioni di vinificazione sono necessari approcci di diverso tipo. Studi
sulle proprietà fisiologiche di lieviti S. cerevisiae naturali e commerciali sono stati
condotti impiegando metodi riguardanti l’espressione genica (Cavalieri et al., 2000;
Hauser et al., 2001; Rossignol et al., 2003; Varela et al., 2005; Wu et al., 2006) e
l’analisi comparativa del genoma (Borneman et al., 2008). L’adattamento delle
cellule di lievito alle condizioni di fermentazione è stato studiato anche attraverso i
livelli di mRNA e di proteine (Zuzuarregui et al., 2006; Rossignol et al., 2009). Una
recente ricerca ha proposto l’impiego di un approccio metabolomico basato sulla
risonanza magnetica nucleare al fine di comprendere il comportamento dei ceppi di
lievito vinari durante il processo fermentativo (Son et al., 2009). Dei ricercatori,
inoltre, si sono serviti di un approccio comparativo trascrittomico e metabolomico
per studiare l’influenza dell’espressione dei singoli geni sulla produzione dei
composti aromatici volatili da parte dei lieviti vinari (Rossouw et al., 2008).
In questo contesto, per spiegare i meccanismi metabolici coinvolti nelle interazioni
tra lieviti durante le fermentazioni miste, tutti i tipi di approccio, trascrittomico,
proteomico e metabolomico, potrebbero potenzialmente chiarire questi fenomeni. Ad
oggi, comunque, le nostre limitate conoscenze riguardo al profilo genetico e alla
regolazione metabolica nei lieviti non-Saccharomyces limitano l’impiego dei metodi
molecolari per lo studio dei meccanismi di regolazione delle interazioni tra lieviti
durante la fermentazione vinaria. Per questi motivi, si rende ancora necessaria una
maggiore conoscenza sui meccanismi di regolazione genetica e metabolica nei lieviti
non-Saccharomyces.
38

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
1.8 Sottoprodotti di fermentazione correlati alla qualità
organolettica del vino
I sottoprodotti di fermentazione sono fondamentalmente rappresentati da quei
composti secondari prodotti dall’attività metabolica del lievito durante la
fermentazione vinaria e possono influenzare il bouquet finale del vino. I lieviti delle
diverse specie che intervengono a vario livello nel processo fermentativo svolgono
complesse attività metaboliche, determinando la trasformazione del mosto in un
prodotto finale, il vino, significativamente differente in funzione del tipo di lievito
che ha dominato il processo. Così, accanto all’etanolo, il composto primario della
fermentazione alcolica, troviamo nel vino numerosi composti che ne determinano la
qualità organolettica finale. I lieviti vinari possiedono la capacità comune di produrre
questi composti, ma è il livello quantitativo che determina la differenza tra le diverse
specie e poi, nell’ambito della stessa specie, tra i diversi ceppi (Lambrechts &
Pretorius, 2000). La capacità del lievito di trasformare o di influenzare il contenuto
dei diversi composti è quindi definita come carattere di qualità organolettica,
riconducibile ad un’azione positiva o negativa esercitata dal lievito sulla
composizione finale del vino (Romano, 2005).
Il glicerolo, dopo l’etanolo e l’anidride carbonica, è il composto prodotto in
maggiore quantità durante la fermentazione alcolica. Esso è uno dei principali
componenti dell’estratto secco di un vino e quindi influenza notevolmente il
cosiddetto corpo del vino. Questo prodotto secondario della fermentazione alcolica
contribuisce significativamente alla viscosità e alla morbidezza del vino con un
effetto positivo sul gusto, impartendo i caratteri di dolcezza (soglia di percezione 5,2
g/l) (Noble & Bursick, 1984), di corposità e di pienezza. Il contenuto di glicerolo nel
vino è variabile ed oscilla in un intervallo tra 1 e 12 g/l; in genere, concentrazioni
elevate di glicerolo ne aumentano la qualità. Queste concentrazioni dipendono dalle
condizioni chimico-fisiche del mosto, quali la composizione, il contenuto iniziale di
zuccheri e di azoto assimilabile, la temperatura di fermentazione, il pH, l’ossigeno,
l’acidità, la solfitazione, ma in modo rilevante dipendono dai lieviti che hanno
partecipato al processo fermentativo. La maggiore variabilità di produzione di
glicerolo è determinata dalla specie di lievito. Confrontando i livelli di glicerolo in
vini ottenuti per fermentazione con ceppi appartenenti a specie diverse, si osserva un
39

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
contenuto di glicerolo molto diverso, riconducibile al comportamento tipico di
ciascuna specie (Romano et al., 1997). Rispetto ai ceppi di S. cerevisiae vinari, i
lieviti apiculati producono generalmente minori quantità di glicerolo (in un intervallo
di 2-3,5 g/l), mentre altri lieviti non-Saccharomyces, come un ceppo vinario di
Candida stellata (riclassificata S. bombicola) (Sipiczki et al., 2005), sono
caratterizzati da elevate produzioni di glicerolo (Ciani & Picciotti, 1995). La capacità
di produrre determinate quantità di glicerolo, dunque, oltre ad essere un carattere di
specie, è anche un carattere di ceppo, che permette di identificare fenotipi diversi in
funzione del livello prodotto. Dal punto di vista tecnologico la diversità di ceppo
conferma il ruolo importante della componente lievito nel definire il flavour ed il
bouquet del vino (Romano et al., 2003).
L’acido acetico è il principale acido volatile del vino, prodotto in misura variabile da
tutti i lieviti vinari durante la fermentazione. Oltre un certo limite, che varia per
ciascun vino, l’acido acetico ha effetti dannosi sul profilo organolettico e, quindi,
sulla qualità dei vini (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Generalmente, il contenuto di
acido acetico nei vini è compreso tra 0,3 e 0,6 g/l, concentrazioni superiori sono
indesiderate perché conferiscono al vino caratteristiche sensoriali negative. Tale
soglia è maggiore nei vini che hanno un residuo zuccherino, come i passiti, in quanto
esso può mascherare, fino ad un certo livello, la sensazione di spunto dovuta
all’acido acetico. Come per il glicerolo, anche la formazione di acido acetico è
correlata alla specie di lievito e, nell’ambito della stessa specie, al ceppo; ma pure
alla concentrazione iniziale degli zuccheri (non alla quantità di zuccheri fermentati),
alla disponibilità di azoto e al pH. L’alta produzione di acido acetico è un pattern
specifico dei lieviti apiculati, che per questo motivo e per molto tempo, sono stati
considerati microrganismi indesiderati e definiti contaminanti. Gli studi condotti sui
lieviti apiculati hanno dimostrato una variabilità significativa di ceppo (Romano,
2002). La specie S. cerevisiae è in genere caratterizzata da una bassa produzione di
acido acetico, ma fra tutti i lieviti vinari per bassa produzione si distingue la specie T.
delbrueckii (Castelli, 1969), con livelli medi intorno a 150 mg/l. Glicerolo e acido
acetico, inoltre, sono ottimi indici di stress osmotico dei lieviti vinari: quanto più alto
è il contenuto iniziale di zuccheri nel mosto, tanto maggiore sarà la quantità di acido
acetico (e di glicerolo) prodotta durante la fermentazione. Per questa ragione, i vini
40

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
ottenuti da mosti ad elevato tenore in zuccheri hanno, di norma, acidità volatili più
elevate (Romano, 2005).
Nel metabolismo dei lieviti, l’idrogeno solforato H2S rappresenta il prodotto finale
della riduzione assimilatoria dei solfati e il prodotto iniziale della seconda fase di
biosintesi degli aminoacidi solforati (Rauhut, 1993). I lieviti utilizzano solo una parte
dell’idrogeno solforato per condurre la seconda parte della biosintesi, cosicché la
parte eccedente è secreta nel mezzo, quindi nel vino. Di conseguenza, durante la
fermentazione alcolica, i lieviti producono quantità più o meno elevate di questo
composto. Il valore soglia di accettabilità nel vino varia in funzione della varietà
dell’uva da 50 a 80 µg/l, mentre quantità superiori causano un odore sgradevole che
ricorda l’odore di uova marce (Fedrizzi et al., 2007). In basse quantità (20-30 µg/l)
l’idrogeno solforato può contribuire positivamente, apportando un aroma di lievito al
vino. Generalmente durante la fermentazione l’idrogeno solforato è formato in
piccole quantità dai lieviti vinari delle diverse specie, e in S. cerevisiae la sua
produzione è compresa tra pochi µg/l e alcuni mg/l (Spiropoulos et al., 2000).
Numerosi fattori influenzano la produzione di questo composto nel vino. Il fattore
primario è senz’altro il ceppo di S. cerevisiae, che può produrre anche quantità
superiori a 1 mg/l, creando un inconveniente importante al vino dal punto di vista
commerciale. Numerosi altri fattori come la composizione del mosto dal punto di
vista dell’azoto assimilabile (Bell & Henschke, 2005) e le condizioni di
fermentazione possono influenzarne la produzione da parte dei lieviti (Karagiannis &
Lanaridis, 1999).
Gli alcoli superiori sono importanti prodotti secondari formati dai lieviti durante la
fermentazione alcolica e sono rappresentati principalmente da n-propanolo,
isobutanolo, alcol amilico attivo (2-metil-1-butanolo), alcol isoamilico (3-metil-1-
butanolo) e 2-feniletanolo. Questi composti derivano per via catabolica dagli
aminoacidi corrispondenti (treonina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina) presenti
nel mosto, ma anche dal metabolismo del glucosio senza coinvolgimento degli
aminoacidi precursori. Non c’è, infatti, una relazione diretta tra le quantità di
aminoacidi presenti nel mosto e quelle degli alcoli superiori nel vino. Gli alcoli
superiori occupano un posto importante tra gli elementi che prevalentemente
conferiscono l’aroma al vino e la loro produzione è dovuta principalmente all’azione
41

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
dei lieviti. Piccole quantità di alcoli superiori contribuiscono positivamente alla
qualità del vino, mentre quantità elevate (> 300-350 mg/l) conferiscono al prodotto
qualità negative (Amerine et al., 1980); in particolare l’alcol isoamilico dà un
caratteristico odore di bruciato. Fa eccezione il 2-feniletanolo, che libera una
fragranza floreale di rosa e in concentrazione anche elevata contribuisce
positivamente all’aroma del vino (Swiegers et al., 2005). Il contenuto di alcoli
superiori nel vino varia considerevolmente, da 100 a 500 mg/l, e la quantità prodotta
dipende da diversi fattori: composizione del mezzo, disponibilità di ossigeno, fonte
azotata, temperatura e concentrazione iniziale dello zucchero. La capacità di produrre
alcoli superiori è una caratteristica generale di tutti i lieviti e le quantità variano in
funzione del genere e della specie. La specie S. cerevisiae ne produce elevate
quantità, seguita da Saccharomycodes ludwigii e Zygosaccharomyces fermentanti,
mentre Hanseniaspora uvarum e Candida stellata ne sono bassi produttori. Il 2-
feniletanolo, che deriva dall’aminoacido fenilalanina, è presente in quantità differenti
secondo il tipo di vino e dell’area in cui è prodotto e la sua concentrazione è
strettamente legata alla composizione dei mosti e all’attività del lievito che ha
dominato durante la fermentazione alcolica. Isobutanolo e n-propanolo, pur presenti
in piccole quantità, concorrono con il loro profumo alla formazione dell’aroma e del
bouquet del vino e svolgono un’azione di solvente nei confronti di altre sostanze
odorose esaltandone la volatilità (Romano, 2005).
L’acetaldeide è il composto carbonilico più importante che si forma durante la
fermentazione. È un precursore dell’acetato, dell’acetoino e dell’etanolo; gioca un
ruolo chiave nella biosintesi di due alcoli superiori, isobutanolo e alcol amilico
attivo, in quanto insieme al piruvato è un precursore nella sintesi di valina e leucina,
da cui derivano i due alcoli. Il contenuto di acetaldeide nel vino può variare
notevolmente da 10 ad oltre 300 mg/l; la valutazione del suo contenuto è usata come
indicatore del grado di ossidazione di un vino. Generalmente un alto livello di
acetaldeide è indesiderabile e già a concentrazioni di 100-125 mg/l libera un odore
pungente e irritante. I vini bianchi, in generale, hanno un contenuto medio di
acetaldeide di 80 mg/l, maggiore di quello dei vini rossi, che mediamente
contengono 30 mg/l; presente nel vino a livelli bassi conferisce un gradevole aroma
vegetale erbaceo e fruttato. La produzione di acetaldeide da parte dei lieviti dipende
42

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
da molti fattori, come la fase di fermentazione (massima produzione nella fase
tumultuosa), la composizione del mezzo, la natura dei materiali insolubili usati per la
chiarificazione dei mosti, le condizioni di anaerobiosi e la temperatura di
fermentazione. L’anidride solforosa, inoltre, induce la produzione di acetaldeide da
parte dei lieviti: vini fermentati in presenza di SO2 hanno un contenuto di acetaldeide
considerevolmente più alto di quelli fermentati in assenza di SO2. Questa produzione
indotta dall’anidride solforosa sembra essere correlata alla resistenza dei lieviti nei
confronti della SO2 stessa. Comunque, il fattore principale che determina la maggiore
variabilità di contenuto di acetaldeide è la specie di lievito (Romano, 2005).
L’acetoino è un costituente naturale del vino, prodotto dall’attività metabolica di
lieviti e batteri e presente di norma in quantità da 2 a 32 mg/l. Esso svolge un ruolo
importante per la sua potenzialità aromatica e per essere un precursore nella
produzione di diacetile e di 2,3-butandiolo, che in quantità elevate influenzano
fortemente l’aroma delle bevande alcoliche. Il 2,3-butandiolo, prodotto dai lieviti
attraverso la riduzione dell’acetoino, è contenuto nel vino in un intervallo che può
variare considerevolmente da 0,2 a 3 g/l. I lieviti non-Saccharomyces, dominatori
della prima fase fermentativa, quali le specie di Hanseniaspora/Kloeckera e C.
stellata, sono alti produttori di acetoino come caratteristica di specie, e raramente
sono stati trovati ceppi producenti quantità più basse. L’acetoino, prodotto da questi
lieviti nella prima parte della fermentazione alcolica, è poi utilizzato dal lievito
principale della fermentazione, S. cerevisiae, per la formazione del 2,3-butandiolo e
di altri composti secondari o per aumentare il grado alcolico. Pochissimi ceppi di S.
cerevisiae sono capaci di produrre alte quantità di acetoino nel vino. La produzione
di acetoino dipende da vari fattori, tra cui il pH, la temperatura di fermentazione, le
condizioni di aerazione, il substrato, l’ossigeno, la consistenza della popolazione di
lieviti, ma soprattutto la specie di lievito che ha dominato la fermentazione (Romano,
2005).
Gli esteri sono prodotti dai lieviti durante la fermentazione alcolica e i fattori più
importanti che influenzano il loro contenuto nel vino sono la composizione del mosto
e le condizioni di fermentazione, ma soprattutto la specie ed il ceppo di lievito che ha
condotto quest’ultima. Essi sono in genere derivati da condensazione di acido acetico
e lattico con etanolo ed altri alcoli del vino. Il principale estere è l’acetato di etile,
43

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
che contribuisce più marcatamente degli altri all’aroma del vino, conferendo un
tipico profumo di aceto e di frutta. Concentrazioni variabili da 50 a 80 mg/l sono
favorevoli alla qualità del vino, mentre quantità maggiori, fino a 120-150 mg/l,
conferiscono qualità organolettiche negative. L’acetato di etile, durante la
fermentazione, può essere ottenuto per condensazione dell’acetil-CoA con l’etanolo
tramite una trasferasi o dall’etanolo e dall’acetato per mezzo di una esterasi prodotta
dal lievito. L’acetato di etile è un prodotto della fermentazione dei lieviti e, sulla base
della sua produzione, si evidenziano comportamenti differenti da parte delle diverse
specie (Rojas et al., 2001). In particolare, i lieviti vinari non-Saccharomyces ne
producono quantità relativamente alte (30-120 mg/l), mentre S. cerevisiae produce
concentrazioni minori (Romano, 2005).
Esteri volatili importanti per contribuire all’arricchimento con note fruttate e floreali
del bouquet del vino (Russell, 2003) sono gli esteri etilici e gli esteri acetati degli
alcoli superiori. Per quanto riguarda la prima categoria possiamo menzionare l’etil
butirrato, che conferisce note di frutta matura nera come mora e mirtillo, l’etil
esanoato, che ha un esotico aroma di ananas e l’etil ottanoato, che apporta una
fragranza di tostato, riportando alla mente il sapore della crosta di pane.
Relativamente agli esteri acetati degli alcoli superiori, invece, possiamo descrivere la
percezione dell’isoamil acetato come un fruttato dolce che richiama l’aroma di
banana, e quella del feniletil acetato caratterizzata da note di rosa e di miele (Lee et
al., 2012).
Da tempo è noto che la cellula di lievito è in grado di rilasciare nel vino polisaccaridi
di origine parietale, durante il contatto prolungato delle cellule con il vino stesso, per
il fenomeno dell’autolisi. Più recentemente è emerso che tale rilascio avviene anche
durante la fermentazione alcolica, arricchendo così il mezzo di macromolecole,
essenzialmente mannoproteine. La composizione chimica delle mannoproteine è
rappresentata da 85-90 % di carboidrati (mannosio) e da 10-15 % di proteine.
Durante la fermentazione alcolica il rilascio di mannoproteine è stato associato alla
sintesi della parete cellulare. Nelle cellule viventi, infatti, le mannoproteine sono
sintetizzate nel citoplasma e trasportate all’esterno per essere utilizzate nella
costruzione della parete; la parte di queste in eccesso potrebbe andare a solubilizzarsi
nel mezzo, arricchendolo così in tali polimeri. La quantità di polisaccaridi riversati
44

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
nel mezzo di fermentazione dipende sia dal ceppo di lievito sia dalle condizioni di
fermentazione (Moine Ledoux, 2001). Il rilascio di polisaccaridi durante la
fermentazione alcolica è associato alla crescita cellulare: esso è massimo quando le
cellule si trovano in fase esponenziale di sviluppo e si mantiene a questi livelli fino
alla fine della fermentazione. Solo se il vino viene mantenuto, dopo la fine della
fermentazione, a contatto con le fecce di lievito si può notare un ulteriore
arricchimento in polisaccaridi. Quindi, nella prima parte del processo di
vinificazione, l’arricchimento dei vini in polisaccaridi parietali è dovuto all’attività di
cellule vive, nella seconda parte, al fenomeno dell’autolisi che si instaura a carico
delle cellule morte (Llaubères et al., 1987). Oltre allo stato fisiologico delle cellule,
altri fattori ambientali (grado di torbidità, pH e concentrazione zuccherina del mosto,
temperatura di fermentazione) incidono sulla quantità di polisaccaridi parietali
rilasciata dal lievito. In particolare, è stata osservata una relazione diretta tra il
contenuto iniziale di macromolecole dei mosti e la quantità di polisaccaridi di origine
parietale ritrovata nel vino, nel senso che più i mosti sono torbidi (ricchi in colloidi),
meno polisaccaridi sono rilasciati dalle cellule di lievito. È stato ipotizzato che la
crescita in mosti meno torbidi e più ricchi in zuccheri comporti un aumento della
porosità della parete cellulare, che si traduce in un maggiore rilascio di
mannoproteine da parte del lievito (Guilloux-Benatier et al., 1995). Anche il pH del
mezzo di fermentazione influisce sul rilascio di polisaccaridi nel fermentato: un
aumento di acidità (pH più basso) provoca una netta diminuzione del contenuto di
colloidi, a causa degli equilibri di solvatazione e di solubilità dei colloidi stessi. Per
quanto riguarda l’effetto temperatura di fermentazione, è stato osservato che
all’aumentare di questo parametro aumenta la solubilizzazione dei polisaccaridi della
parete e quindi il loro contenuto nel mezzo. La temperatura diventa estremamente
importante anche dopo la fine della fermentazione, cioè durante l’autolisi ed il
contatto del lievito con le fecce. Le mannoproteine rilasciate dal lievito svolgono un
ruolo importante nell’esaltare i caratteri di qualità dei vini, migliorandone il profilo
sensoriale, la stabilità chimico-fisica e favorendo l’instaurarsi della fermentazione
malolattica (FML). Per quanto riguarda l’influenza sul profilo sensoriale dei vini, le
mannoproteine svolgono un ruolo attivo nel mantenimento dell’aroma, in quanto
sono in grado di interagire con alcuni composti volatili, o aumentandone la volatilità
o preservandoli più a lungo nella matrice del vino. Tali interazioni dipendono
45

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE
essenzialmente dalla natura del composto aromatico e dalla parte proteica delle
macromolecole di origine parietale. In particolare, è il tenore proteico delle
mannoproteine a essere responsabile, almeno in parte, della ritenzione del composto
volatile, mentre la porzione polisaccaridica sembra aumentare la volatilità degli
aromi. Sempre riguardo all’influenza sul profilo sensoriale dei vini, un altro
intervento positivo di queste macromolecole è quello di conferire ai vini rossi un
colore più stabile, grazie al legame con i composti fenolici. Vini ricchi in
polisaccaridi hanno una ridotta perdita di colore prima dell’imbottigliamento e
durante la conservazione in cantina. Inoltre, all’interazione tannini-polisaccaridi
viene imputata l’attenuazione della sensazione di astringenza dei vini. A questo
proposito, sebbene i meccanismi molecolari del fenomeno non siano ancora
completamente noti, sembra che i polisaccaridi circondino le molecole di tannino,
riducendone la reattività con le proteine della saliva e quindi diminuendo la
sensazione di astringenza alla degustazione. In generale, i vini, sia rossi sia bianchi,
più ricchi in polisaccaridi rilasciati dal lievito vengono descritti all’analisi sensoriale
come più rotondi, più morbidi e con maggiore corpo (Rosi et al., 2005).
46

CAPITOLO 2 - SCOPO DEL LAVORO
CAPITOLO 2 - SCOPO DEL LAVORO
Nel campo dell’industria alimentare è ampiamente diffuso l’utilizzo di colture
microbiche selezionate, per la conduzione di fermentazioni in purezza. In particolare
nell’industria enologica, l’utilizzo di colture starter determina un rapido avvio ed un
buon controllo del processo fermentativo. Tuttavia, la semplificazione dei lieviti
fermentanti che concorrono al processo determina un appiattimento organolettico
del prodotto finito. Nonostante esista un rischio insito nelle fermentazioni spontanee,
queste vengono considerate da molti produttori vinicoli superiori alle fermentazioni
in purezza microbiologica, determinando un aumento della qualità e complessità del
vino, e conferendo caratteristiche organolettiche peculiari al prodotto finito.
Resta, tuttavia, il problema che la fermentazione spontanea è un processo
incontrollato, casuale e rischioso, anche se sappiamo che alcuni lieviti non-
Saccharomyces opportunamente selezionati possono contribuire positivamente alla
composizione analitica e sensoriale del vino.
In questo contesto, le fermentazioni multistarter controllate, ossia inoculi misti di
lieviti non-Saccharomyces e S. cerevisiae, possono contribuire a conferire al vino le
caratteristiche desiderate garantendo un regolare svolgimento della fermentazione.
In questo lavoro di ricerca è stata valutata l’influenza di alcuni lieviti non-
Saccharomyces di interesse enologico in fermentazioni multistarter con una coltura
starter di S. cerevisiae del commercio. Con tali colture, precedentemente selezionate
sulla base delle principali caratteristiche enologiche, sono state allestite delle
fermentazioni valutando i diversi parametri biotecnologici, differenti strategie di
inoculo ed impiegando volumi crescenti di substrato, al fine di ottenere lo scale-up
necessario alla valutazione su scala industriale del processo di vinificazione
multistarter. In particolare sono stati valutati l’andamento fermentativo, i principali
caratteri enologici ed i più importanti metaboliti secondari con l’intento di studiare il
reale apporto di tali lieviti non-Saccharomyces al prodotto finale.
47

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
3.1 Allestimento delle prove sperimentali
CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
3.1.1 Microfermentazioni su scala di laboratorio impiegando 16
ceppi di lievito non-Saccharomyces inoculati in combinazione con S.
cerevisiae
16 ceppi di lievito non-Saccharomyces, selezionati precedentemente, sono stati
utilizzati in prove di fermentazione in combinazione con uno starter commerciale
appartenente alla specie S. cerevisiae (EC1118). In particolare i ceppi di lievito non-
Saccharomyces, appartenenti a diversi generi e specie (tabella 1), sono stati
coinoculati con il ceppo starter commerciale di Saccharomyces secondo il seguente
schema:
Tesi 1 10 7 cell/ml di non-Saccharomyces + 10 7 cell/ml di S. cerevisiae
Tesi 2 10 7 cell/ml di non-Saccharomyces + 10 5 cell/ml di S. cerevisiae
Tesi 3 10 7 cell/ml di non-Saccharomyces + 10 3 cell/ml di S. cerevisiae
Per ciascuna tesi è stata allestita anche una prova di controllo con la coltura pura del
ceppo commerciale di Saccharomyces cerevisiae con le medesime concentrazioni
della tesi corrispondente (10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml). Ulteriori prove di
controllo sono state allestite con i 16 ceppi di non-Saccharomyces e condotte in
purezza (alla concentrazione di 10 7 cell/ml) come descritto nello schema allegato.
S. cerevisiae EC 1118 (coltura pura) 10 7 cell/ml
S. cerevisiae EC 1118 (coltura pura) 10 5 cell/ml
S. cerevisiae EC 1118 (coltura pura) 10 3 cell/ml
non-Saccharomyces (coltura pura) 10 7 cell/ml
Le microfermentazioni sono state condotte a 25 °C in doppio su 450 ml di mosto
Folicello in beute equipaggiate di valvole di Müller. Tale mosto presentava le
seguenti caratteristiche analitiche:
• pH 3.55
48

• Acidità totale 5.58 g/l (acido tartarico)
• Zuccheri 231 g/l
• α-aminoacidi 154.4 mg/l
• Ammonio 21.68 mg/l
• Polisaccaridi 237 mg/l
CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
Il mosto in ciascuna beuta è stato inoculato con un volume della precoltura di ciascun
ceppo selezionato, sviluppata a 25 °C per 72 h nel medesimo substrato. Il volume
inoculato è stato calcolato mediante conta cellulare al Thoma in modo da
standardizzare l’inoculo iniziale secondo le tre combinazioni sopra riportate.
Tutte le fermentazioni sono state eseguite in doppio effettuando le repliche in tempi
successivi. In totale, in questa fase, sono state condotte e monitorate 140 prove di
fermentazione (16 combinazioni × 3 modalità di inoculo + 11 fermentazioni di
controllo in coltura pura x 2 repliche).
Codice ceppo Lievito non-Saccharomyces
22 Candida zemplinina
69 Candida tropicalis
25 Hanseniaspora osmophila
32 Hanseniaspora osmophila
101 Lachancea thermotolerans
103 Lachancea thermotolerans
46 Metschnikowia pulcherrima
4 Pichia fermentans
9 Pichia anomala
62 Saccharomycodes ludwigii
64 Saccharomycodes ludwigii
95 Schizosaccharomyces pombe
92 Torulaspora delbrueckii
94 Torulaspora delbrueckii
42 Zygosaccharomyces florentinus
89 Zygosaccharomyces bailii
Tabella 1: lieviti non-Saccharomyces impiegati in coinoculo
49

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
Dal punto di vista tassonomico, la specie Lachancea thermotolerans era
precedentemente classificata come Kluyveromyces thermotolerans (Van der Walt,
1956). La recente applicazione dell’analisi filogenetica delle sequenze geniche ha
permesso di ridefinire la sistematica della specie Kluyveromyces thermotolerans,
assegnandola al nuovo genere Lachancea (Kurtzman, 2003).
3.1.2 Fermentazioni miste a diversi tempi di inoculo con i due ceppi
di lievito non-Saccharomyces selezionati e lo starter S. cerevisiae
Il substrato utilizzato per l’allestimento delle microfermentazioni è stato sempre
mosto Folicello, un succo d’uva naturale avente le seguenti caratteristiche chimico-
fisiche:
• pH 3.61
• Acidità totale 5.55 g/l (acido tartarico)
• Zuccheri 224 g/l
• α-aminoacidi 154.4 mg/l
• Ammonio 21.68 mg/l
• Polisaccaridi 171.12 mg/l
Abbiamo utilizzato due ceppi non-Saccharomyces selezionati per la buona attitudine
enologica mostrata nella sperimentazione precedente ed il ceppo Saccharomyces
cerevisiae EC1118; i lieviti non-Saccharomyces erano il ceppo 101 di Lachancea
thermotolerans ed il ceppo 42 di Zygosaccharomyces florentinus.
Queste fermentazioni miste sono state allestite in beute da 1000 ml provviste di
valvola di Muller, contenenti 750 ml di mosto ciascuna e condotte alla temperatura di
25 °C.
Le precolture di ciascun ceppo di lievito (S. cerevisiae EC1118, L. thermotolerans
101 e Z. florentinus 42) sono state preparate nello stesso mosto utilizzato
successivamente per l’inoculo; tale precoltura è stata incubata a 25 °C per 72 ore a
150 rpm.
50

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
L’inoculo delle beute è stato eseguito calcolando la concentrazione cellulare della
precoltura mediante conta microbica totale con camera di Thoma, da cui abbiamo
potuto stimare il volume di inoculo per avere la concentrazione desiderata.
Tutte le prove di fermentazione sono state allestite in triplo, secondo il seguente
schema:
Tesi 1) coinoculo : inoculo contemporaneo del ceppo EC1118 (10 6 UFC/ml) e del
ceppo non-Saccharomyces (10 7 UFC/ml);
Tesi 2) inoculo sequenziale a 24 ore : inoculo del ceppo non-Saccharomyces (10 7
UFC/ml) al tempo zero e dopo 24 ore inoculo del ceppo EC1118 di Saccharomyces
cerevisiae (10 6 UFC/ml);
Tesi 3) inoculo sequenziale a 48 ore : inoculo del ceppo non-Saccharomyces (10 7
UFC/ml) al tempo zero e dopo 48 ore inoculo del ceppo EC1118 di Saccharomyces
cerevisiae (10 6 UFC/ml);
Abbiamo allestito anche tre tesi di controllo con il ceppo EC1118, il ceppo 101 ed il
ceppo 42 in coltura pura, alle stesse concentrazioni di inoculo impiegate per le altre
prove; tutte le prove sono state effettuate in triplo.
3.1.3 Fermentazioni miste con i due ceppi di lievito non-
Saccharomyces selezionati, condotte a diverse temperature in
fermentatori da banco
Il substrato utilizzato per le prove in fermentatore era un mosto rosso misto
(Sangiovese e Cabernet) avente le seguenti caratteristiche:
• Zuccheri 25,4 %
• pH 3,19
• Ammonio 36,12 mg/l
• α-aminoacidi 159,6 mg/l
• Polisaccaridi 100 mg/l
51

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
Sono state effettuate sei prove in doppio, per un totale di dodici fermentazioni.
Abbiamo utilizzato due fermentatori che effettuano il monitoraggio automatico del
pH, della temperatura e della percentuale di ossigeno disciolto (Figura 1).
Le prove condotte in duplicato sono state:
Fig 1: fermentatori da banco
• Fermentazione con il solo inoculo di Saccharomyces cerevisiae (EC1118),
condotta alle temperature di 20 °C e 30 °C ;
• Fermentazione con inoculo misto Saccharomyces cerevisiae (EC1118) +
Zygosaccharomyces florentinus (42) alla temperatura di 20 °C;
• Fermentazione con inoculo misto Saccharomyces cerevisiae (EC1118) +
Zygosaccharomyces florentinus (42) alla temperatura di 30 °C;
• Fermentazione con inoculo misto Saccharomyces cerevisiae (EC1118) +
Lachancea thermotolerans (101) alla temperatura di 20 °C;
• Fermentazione con inoculo misto Saccharomyces cerevisiae (EC1118) +
Lachancea thermotolerans (101) alla temperatura di 30 °C.
52

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
3.1.4 Vinificazioni su scala semi-industriale inoculate con i due ceppi
selezionati di lievito non-Saccharomyces in combinazione con S.
cerevisiae
Lo starter commerciale S. cerevisiae EC1118 e i due lieviti non-Saccharomyces
(ceppo 101 e 42) sono stati inoculati in fermentini da 10 hl secondo il seguente
schema:
• Coinoculo non-Saccharomyces/Saccharomyces: 10 7 cell/ml di non-
Saccharomyces + 10 6 cell/ml di S. cerevisiae
• Inoculo sequenziale dopo 48 ore del Saccharomyces: 10 7 cell/ml di non-
Saccharomyces + 10 6 cell/ml di S. cerevisiae
• Inoculo del S. cerevisiae a concentrazione di 10 6 cell/ml (controllo)
In totale in questa fase sono state condotte 12 prove di fermentazione: 2 ceppi di non-
Saccharomyces per 2 modalità di inoculo, sequenziale e contemporaneo, per 3
repliche; 3 prove di fermentazione di controllo con un ceppo commerciale di S.
cerevisiae per 3 repliche.
Tali fermentazioni sono state condotte ad una temperatura di circa 25 °C.
Il mosto di uve Sangiovese utilizzato per le prove aveva la seguente composizione:
• pH 3.24
• Acidità totale 7.35 g/l (acido tartarico)
• Zuccheri 22.23 %
• Solforosa totale 39.5 mg/l
• Polisaccaridi 185,15 mg/l
Dopo la svinatura, 200 litri del vino fiore di ciascuna prova sono stati suddivisi in
due serbatoi di acciaio da 100 litri. Per standardizzare le prove nei confronti della
fermentazione malolattica, in 15 serbatoi sono stati inoculati batteri lattici del
commercio (previo adattamento). Al fine di valutare un’eventuale influenza delle
colture miste sull’avvio della FML spontanea, nei restanti 15 serbatoi non è stato
effettuato alcun inoculo. I serbatoi sono stati quindi collocati in stanza termostatata a
20 °C in attesa del termine della fermentazione malolattica, per una loro successiva
valutazione sensoriale dopo opportuna stabilizzazione.
53

3.2 Monitoraggio delle fermentazioni
CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
L’evoluzione delle fermentazioni, condotte ai punti 3.1.1 e 3.1.2, è stata monitorata
per via gravimetrica registrando giornalmente la perdita in peso espressa come
grammi di CO2 svolta. Il calo in peso è stato monitorato fino al termine della
fermentazione (peso costante per tre giorni consecutivi) e la quantità di CO2 prodotta
è stata utilizzata per esprimere l’attività fermentativa.
L’evoluzione delle fermentazioni, condotte ai punti 3.1.3 e 3.1.4, invece, è stata
seguita attraverso l’analisi periodica degli zuccheri residui, rispettivamente con
reattivo di Fehling e con aerometro Baumè.
Per tutta la durata delle fermentazioni è stata fatta la valutazione dell’evoluzione
della microflora fermentante mediante conte vitali su piastra con terreni generici e
selettivi, eseguite al tempo 0 (momento dell’inoculo) e ad intervalli di diversi giorni
per avere una stima precisa del numero di UFC/ml dei lieviti inoculati. Quando ne è
parso opportuno, inoltre, sono stati monitorati i parametri analitici più interessanti.
3.3 Analisi microbiologiche
Al fine di valutare la crescita dei due ceppi di lievito in coltura mista durante la
fermentazione, è stata effettuata per ciascuna prova la conta vitale su due differenti
terreni: WL nutrient agar (per la rilevazione dei lieviti S. cerevisiae e per la conta
totale dei lieviti) e Agar Lisina (per la conta dei lieviti non-Saccharomyces). Mentre
per i lieviti inoculati in coltura pura la conta è stata effettuata su YPD-agar. Da
ciascuna beuta sono stati quindi effettuati i prelievi immediatamente dopo l’inoculo
e dopo vari giorni di fermentazione. Per effettuare le conte vitali sono state eseguite
delle diluizioni seriali (Figura 2).
Queste metodiche di valutazione della microflora fermentante sono state le stesse per
tutte le prove di fermentazione.
54

Campione
originario
100 µl
3.3.1 Terreni di coltura
Figura 2: metodo delle diluizioni seriali
I terreni utilizzati per gli isolamenti e le conte sono:
1) WL Nutrient Agar (Oxoid) 75 g/l così composto:
Estratto di lievito 4 g/l;
Triptone 5 g/l;
Glucosio 50 g/l;
KH2PO4 0.55 g/l;
KCl 0.425 g/l;
CaCl2 0.125 g/l;
MgSO4 0.125 g/l;
CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
9 ml di H2O
Diluizione
1/10
100 µl
9 ml di H2O
Diluizione
1/100
100 µl
9 ml di H2O
Diluizione
1/1000
100 µl
9 ml di H2O
Diluizione
1/10000
100 µl
9 ml di H2O
Diluizione
1/100000
100 µl
55

FeCl3 0.0025 g/l;
MnSO4 0.0025 g/l;
Verde di Bromocresolo 0.022 g/l;
Agar-agar 15 g/l;
CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
Il WLA permette la crescita delle principali specie di lievito presenti nella
vinificazione, e le loro colonie assumono colorazione e/o morfologia diverse per cui
sono facilmente riconoscibili.
2) Agar Lisina (Oxoid) 6.6 g/100 ml così composto:
Destrosio 44.5 g/l;
K2HP4O 1.78 g/l;
MgSO4 0.89 g/l;
Ca2Cl 0.178 g/l;
NaCl 0.089 g/l;
Adenina 0.00178 g/l;
D,L-Metionina 0.000891 g/l;
L-Istidina 0.000891 g/l;
D,L-Triptofano 0.000891 g/l;
H3BO3 0.0000089 g/l;
ZnSO4 0.0000356 g/l;
56

MONH4 0.0000178 g/l;
MnSO4 0.0000356 g/l;
FeSO4 0.0002225 g/l;
Lisina 1 g/l;
Inositolo 0.02 g/l;
Calcio Pantotenato 0.002 g/l;
Aneurina 0.0004 g/l;
Piridossina 0.0004 g/l;
Riboflavina 0.0002 g/l;
A. p-aminobenzoico 0.0002 g/l;
Acido nicotinico 0.0004 g/l;
Biotina 0.000002 g/l;
Acido folico 0.000001 g/l;
Agar 17.8 g/l.
CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
Si aggiunge 1 ml di potassio lattato al 50 % per ogni 100 ml di terreno e si porta ad
ebollizione fino a sciogliere completamente. È un terreno selettivo che inibisce la
crescita del S. cerevisiae e consente la crescita degli altri lieviti; infatti la lisina non è
una fonte di azoto assimilabile dal S. cerevisiae, che quindi viene inibito nello
57

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
sviluppo, mentre può essere metabolizzata da quasi tutte le altre specie associate alla
vinificazione (Morris e Eddy, 1957).
3) YPD agar per il mantenimento e la conservazione delle colture isolate e per
la conta generica dei lieviti:
Estratto di lievito (10 g/l);
Peptone (20 g/l);
Glucosio (20 g/l);
Agar (20 g/l);
YPD-broth: come sopra ma senza l’aggiunta di agar. Terreno utilizzato per lo
sviluppo delle colture di lievito.
3.3.2 Studio della dominanza dello starter S. cerevisiae inoculato
mediante PCR di sequenze interdelta
I ceppi di S. cerevisiae isolati dopo dieci giorni di fermentazione sono stati
sottoposti a caratterizzazione molecolare (Perez et al., 2001). La
caratterizzazione intraspecifica dei S. cerevisiae è stata condotta usando i
primers δ1-δ2 disegnati sulle sequenze delta: δ1 (5’ - CAA AAT TCA CCT
ATA/T TCT CA - 3’) e δ2 (5’-GTG GAT TTT TAT TCC AAC A - 3’)
(Fernàndez-Espinar et al., 2001; Ness et al., 1993; Legras & Karst, 2003; Ciani
et al., 2004; Schuller et al., 2004; Xufre et al., 2011). Queste sono sequenze
lunghe circa 334 bp che fiancheggiano il retrotrasposone Ty1 (Cameron et al.,
1979). Il numero di queste sequenze in S. cerevisiae è generalmente compreso
tra un minimo di 35 ed un massimo di 55. Eventi di ricombinazione omologa
tra due sequenze delta determinano l’escissione dell’elemento Ty1 e di una
sequenza delta, mentre l’altra permane sul cromosoma nel sito di escissione,
58

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
generando profili di dispersione di sequenze delta nel genoma unici per ciascun
ceppo. Quindi, utilizzando primer specifici per le sequenze delta, è possibile
amplificare le regioni interdelta e ottenere profili di amplificazione ceppo-
specifici.
Poiché è stato valutato che tali profili di amplificazione rimangono immutati
per almeno 300 generazioni, le sequenze interdelta possono essere considerate
come marcatori molecolari stabili e utilizzabili per la discriminazione tra isolati
nel corso di processi fermentativi.
Un totale di 190 isolati di S. cerevisiae sono stati testati e tutti quelli che hanno
mostrato un profilo molecolare identico dopo amplificazione con tali paia di
primers sono stati raggruppati e considerati appartenenti allo stesso ceppo.
Non è stato necessario effettuare l’estrazione cellulare del materiale genetico
da sottoporre a PCR, ma è stato aggiunto alla miscela di reazione sotto forma
di cellule permeabilizzate mediante trattamento termico in termociclatore di 5
µl di sospensione cellulare: 95 °C per 5 minuti per poi passare a 4 °C.
La mix di reazione, per un volume totale di 25 µl, è stata così allestita:
- Buffer 1 X (Mg2 + free) 3 µl
- MgCl2 0.9 µl
- dNTPs 0.6 µl
- Primers (Forward; Reverse) 1.2 µl
- Taq DNA polymerase 0.15 µl
- DNA 5 µl
- H2O 14.15 µl
Sono stati effettuati 35 cicli termici comprendenti: denaturazione a 94° C per
1’; annealing a 55° C per 45”; allungamento a 72° C per 2’. I 35 cicli sono stati
preceduti da un passaggio iniziale di denaturazione a 94° C per 5’ e da un
59

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
passaggio finale di allungamento a 72° C per 2’, come mostrato nello schema
seguente.
Schema del ciclo di PCR con i primers delta
94°
5’
3.4 Analisi chimiche
94°
3.4.1 Determinazione della quantità di zuccheri
1’
3.4.1.1 Reattivo di Fehling
55°
(35x) 3
Si versa il campione (normalmente nel caso di mosti si effettua una diluizione
secondo un fattore d) in una buretta graduata, dopo di che in una beuta da 250 ml si
versano 40 ml di H2O deionizzata, 10 ml di reattivo A di Fehling: CuSO4 x 5·H2O
(69,278 g/l di soluzione) e 10 ml di reattivo B di Fehling: K e Na Tartrato + NaOH
(Tartrato sodico potassico) o Sale di Seignette (346 g + 100 g di NaOH/l di
soluzione) e si scalda; quando inizia l’ebollizione si eroga la soluzione del campione
dalla buretta gocciolando di continuo finché il liquido diventa di colore rosso
(Cu2O) pur mantenendo ancora i riflessi blu (presenza di Cu ++ ), poi si aggiungono
45’’
72°
due gocce di blu di metilene (all’1 %) continuando l’ebollizione.
2’
72°
2’
60

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
Figura 3: determinazione della quantità di zuccheri mediante reattivo di Fehling
Trascorsi 2 min di ebollizione totale, si completa la titolazione goccia a goccia fino a
scomparsa della colorazione azzurra (BluMetox); la percentuale di zuccheri (in peso
su volume) presente nel campione si ottiene applicando la formula:
zuccheri % = d x 100 x 0.0515/ ml campione, dove:
d è il fattore di diluizione iniziale del campione.
3.4.1.2 Aerometro Baumè
Gli areometri Baumé sono particolari densimetri che permettono di misurare la
concentrazione di soluzioni acquose, sfruttando il principio di Archimede. Essi sono
costituiti da due bulbi di vetro saldati insieme e sormontati da un tubo, anch' esso in
vetro. Il bulbo superiore è più grande ed è vuoto, l'altro contiene mercurio o pallini di
piombo che fungono da zavorra; il tubo di vetro porta all'interno la scala graduata in
carta su cui si legge la densità. Quando il densimetro viene posto in galleggiamento
libero in un liquido, il peso del fluido spostato è uguale al peso dell' apparecchio, che
è costante; l'estremità superiore del tubo graduato emerge di un tratto tanto più lungo
quanto più denso è il liquido. I densimetri vengono tarati in questo modo ed il valore
della densità si legge nel punto di affioramento del tubo graduato. I densimetri sono
strumenti impiegati per rapide misurazioni della densità dei liquidi. L'unità di misura
61

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
impiegata è il grado Baumé che corrisponde a una soluzione alla percentuale in peso
di cloruro di sodio.
3.4.1.2 HPLC
Il glucosio ed il fruttosio presenti nei campioni sono stati determinati mediante
HPLC.
Dopo filtrazione attraverso una membrana di nitrocellulosa con cut-off 0.45 µm, 20
µm di campione sono stati iniettati in un apparecchio HPLC della Varian,
equipaggiato con autocampionatore serie 410, una pompa serie 210 ed un detector
refrattometrico 356-LC. I campioni di vino rosso sono anche stati pre-purificati con
poliamide SC6 (Macherey-Nagel) prima della filtrazione.
La separazione isocratica è stata eseguita a 75 °C impiegando una colonna
Phenomenex (30 + 15) cm x 7.8 mm (Rezex-ROA-Organic Acids) con matrice di
stirene divinilbenzene solforata in forma H + .
Come fase mobile è stato impiegato H2SO4 10.5 mM ad un flusso di 0.6 ml/min.
In queste condizioni possono essere rilevati glucosio e fruttosio sia mosti che nei vini
fermentati.
La quantificazione degli analiti è stata eseguita facendo riferimento ad una curva di
calibrazione esterna, costruita con concentrazioni di glucosio e fruttosio comprese tra
0.5 e 20 g/l; Le aree relative ai picchi sono state registrate ed integrate attraverso il
Galaxie Cromatography Data System versione 1.9.302.530 della Varian.
3.4.2 Analisi acidità totale
L’acidità totale viene espressa in g/L di acido tartarico (M.E. = 75 uma).Viene
misurata mediante titolazione con soluzione standard di una base e rilevazione del
punto finale mediante pH-metro. Si preleva 25 ml da ogni campione, si mette in un
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CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
beker e si immerge l’elettrodo nel vino, la cui temperatura deve essere il più possibile
vicino a 20 °C e si titola con NaOH. Si fa cadere l’idrossido di sodio goccia a goccia
da una buretta, facendo ben attenzione che le gocce non si fermino nelle pareti del
beker o che la soluzione non schizzi sempre sulle pareti del beker fino a raggiungere
un pH stabile intorno a 7. A questo punto si osserva la buretta, controllando la
quantità di NaOH messa, facendo attenzione al menisco. Poi applicando la formula
seguente, si calcola il valore dell’acidità totale di ogni campione analizzato:
Ac. totale ( acido tartarico g/l) = ml NaOH x 0,75, dove :
ml NaOH = ml di titolante
0,75 = fattore di correzione
3.4.3 Analisi acidità volatile
Figura 4: pH-metro per l’analisi dell’acidità totale
La determinazione dell’acidità volatile (espressa in g/l di acido acetico) è stata
effettuata mediante distillazione in corrente di vapore con l’acidimetro Juffman. Tale
apparecchio, che funziona elettricamente e che opera su 5 ml di vino, è composto
dalle seguenti parti:
• recipiente per la raccolta del vino esausto e delle acque di lavaggio dopo l’analisi;
63

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
• beuta contenente acqua distillata per la generazione del vapore acqueo, scaldata da
una piastra elettrica, provvista di un tappo a due fori; attraverso un foro passa il tubo
di sicurezza, che serve anche per riempire la beuta, nell’altro foro è inserita una
valvola;
• valvola per indirizzare il flusso di vapore o all’esterno (prima che inizi l’analisi) o
dentro il palloncino da distillazione in corrente di vapore (durante l’analisi);
• palloncino da distillazione in corrente di vapore, provvisto di bolla di rettifica dei
vapori;
• mantello scaldante o piastra elettrica per scaldare il palloncino da distillazione in
corrente di vapore;
• refrigerante;
• beuta di raccolta del distillato.
Figura 5: acidimetro di Juffman
Si mette l’acqua distillata nella beuta generatrice di vapore acqueo per metà o poco
più del suo volume e si innesta la corrente elettrica alla piastra per portare ad
ebollizione l’acqua. Poi si attiva il refrigerante e sotto si mette il recipiente per la
raccolta del distillato (40 ml). Quando l’acqua nella caldaia bolle ed il flusso di
vapore esce all’esterno dal tubo di sicurezza, si mette nel palloncino da distillazione
in corrente di vapore 5 ml di vino prelevati in modo esatto con una pipetta
precedentemente avvinata. Successivamente si chiude con l’apposito tappo il
palloncino e si accende il mantello riscaldante per scaldare il vino. Quando si
formano le prime gocce di vapore condensato nella bolla di espansione di cui è
provvisto il palloncino, si ruota la valvola in modo che il vapore venga convogliato
all’interno del palloncino e investa il vino in ebollizione. Si distilla 40 ml di
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CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
distillato, facendo attenzione che il livello del vino all’interno del palloncino rimanga
più o meno costante; se il volume diminuisce, si abbassa il mantello scaldante o
addirittura si spegne momentaneamente. Terminata la distillazione, si spegne il
mantello scaldante il palloncino e si riporta la valvola nella posizione di partenza, in
modo che il vapore venga di nuovo convogliato all’esterno; poi si aspira il vino
esausto e le acque di lavaggio del palloncino nel recipiente di raccolta degli scarti.
Alla fine si fa la determinazione dell’acidità volatile attraverso una titolazione
acidimetrica utilizzando una soluzione di NaOH N/50 (0,02 N) in una buretta e 3
gocce di fenolftaleina come indicatore aggiunto nel beker del campione in modo tale
da effettuare il viraggio del campione in un colore rosa vivo.
3.4.4 Estrazione ed analisi della componente volatile
Il metodo si basa su una estrazione delle sostanze volatili dal vino con una miscela
etere/esano. La preparazione del campione prevede, per gli esteri e gli acidi volatili:
50 ml di vino in un matraccio da 70 ml a cui si aggiungono 2 ml di standard di
estrazione (3-ottanolo, 40 mg/l) e 0.3 ml di H3PO4 al 30 %. Si procede, poi,
all’estrazione dei composti volatili aggiungendo con una pipetta 4 ml di una miscela
etere:esano (1:1 in vol). Si pone il matraccio su un agitatore per 5 minuti a 400 rpm.
Figura 6: estrazione dei volatili: matracci in agitatore
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CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
Si aspetta il tempo necessario (circa 10-15 minuti) affinché le due fasi si separino e
poi si recupera la fase organica in una vial da 10 ml provvista di tappo di teflon.
Figura 7: estrazione dei volatili: separazione tra fase acquosa e fase organica
Si ripete l’estrazione per altre due volte con 2 ml di miscela etere:esano (1:1) con la
stessa procedura. Si aggiunge ogni volta la fase organica nella stessa vial, dove si
aggiunge con una spatola solfato di sodio. Dopo l’estrazione, per separare la fase
organica da quella acquosa, si mette la vial da 10 ml in congelatore per una notte; il
giorno dopo, quando solo la fase acquosa sarà congelata, si versa la fase organica in
una nuova vial da 2.5 ml. L’estratto è così pronto per essere analizzato mediante gas-
cromatografia (GC). Con questa tecnica, in cui la fase fissa è una colonna contenente
il materiale attivo e la fase mobile è un gas (normalmente elio), la separazione
avviene sulla base delle diverse caratteristiche di volatilità dei composti; ogni
composto, infatti, fornisce un segnale (picco) che permette la sua identificazione sulla
base del tempo impiegato per arrivare al rilevatore. La GC è utilizzata per la
separazione di sostanze volatili o volatilizzabili come idrocarburi a basso peso
molecolare, aromi, acidi organici.
L’estrazione è avvenuta tramite l’utilizzo di solventi (descritti precedentemente); per
calibrare il sistema analitico, però, è stata utilizzata una curva di taratura ottenuta
mediante l’iniezione di soluzioni standard a differente concentrazione per ogni
composto volatile da analizzare. Per la rilevazione è stato utilizzato un
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CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
gascromatografo serie GC-2014 (Shimadzu, Kyoto, Japan) con detector a
ionizzazione di fiamma.
Relativamente alla determinazione gascromatografica degli esteri e acidi volatili, le
condizioni operative sono state le seguenti:
- Temperatura dell’iniettore/rivelatore: 250 °C;
- Colonna capillare Supelcowax 10 (30 m, 0,25 mm id);
- Iniettore: splitless 60 sec.; iniettato: 1µl;
- Temperatura del forno: T iniziale 50 °C per 5 minuti, poi un
gradiente di 3 °C/min e isotermia di 220 °C per 20 minuti;
- Gas vettore: Azoto.
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3.4.5 Analisi degli alcoli superiori
CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
La preparazione del campione prevede la filtrazione di una piccola aliquota di
fermentato (10 ml) con filtro cut-off 0.2 µm, a cui si aggiunge uno standard interno,
l’1-pentanolo ad una concentrazione di 162 mg/L. A questo punto si procede
all’analisi mediante gas-cromatografia (GC) impiegando lo stesso apparecchio
utilizzato per l’analisi dei composti volatili (3.3.4). La calibrazione del sistema
analitico è stata effettuata mediante una curva di taratura ottenuta dall’iniezione di
soluzioni standard contenenti i composti volatili da analizzare a differente
concentrazione.
La determinazione gascromatografica degli alcoli superiori è stata quindi eseguita
iniettando direttamente i campioni di vino filtrati (filtro cut-off 0.2 µm) in una
colonna Zebron ZB-WAX Plus, secondo il protocollo che segue:
- temperatura dell’iniettore: 150 °C;
- colonna Zebron ZB-WAX plus in polietilenglicole (30 metri x 0.32 mm
x 0.25 µm);
- iniettore: split 10:2; iniettato 1 µl di campione;
- temperatura: 40 °C per 5 minuti fino a 150 °C, poi 5 °C per 5 minuti
fino a 220 °C, infine 20 °C per due minuti
- gas vettore: Azoto.
3.4.6 Determinazione degli aminoacidi prontamente assimilabili
Per la determinazione degli aminoacidi prontamente assimilabili (azoto α-aminico)
sono stati prelevati da ogni campione 50 µl di mosto e posti in una cuvetta di metil
acrilato (1 cm di lunghezza e 4,5 ml di capacità), a cui successivamente sono stati
aggiunti 3 ml di soluzione NOPA. Le cuvette sono state ricoperte con parafilm e
agitate. Il bianco è stato preparato aggiungendo 50 µl di acqua deionizzata con
l’aggiunta di 3 ml di soluzione NOPAW. Dopo 10 minuti si è effettuata la lettura
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CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
nell’UV-Vis a 335 nm a temperatura ambiente (22-25 °C). L’assorbanza netta è stata
calcolata sottraendo il bianco al campione.
La concentrazione degli aminoacidi è stata calcolata sulla base di una retta di taratura
secondo la metodica descritta da Dukes & Butzke (1998).
Soluzione NOPA
0,336 g di OPA (orto-ftaldialdeide), sono stati sciolti in etanolo e portati a volume a
50 ml. A questa soluzione alcolica, è stata addizionata una soluzione acquosa
contenente:
- 1,919 g di NaOH al 98 %
- 4,234 g di Acido Borico al 99 %
- 0,408 g di Nac (N-acetil-L-cisteina)
e portata a volume in pallone tarato da 500 ml con acqua deionizzata la soluzione
aveva un pH approssimativo di 9.5.
Le soluzione NOPA è stabile a 4 °C per almeno tre settimane.
Soluzione NOPAW
Stessa soluzione senza OPA.
3.4.7 Determinazione dell’ammonio
Per la determinazione dello ione ammonio ho utilizzato un kit enzimatico della ditta
Roche.
La confezione del kit conteneva:
- un flacone con all’interno 50 tavolette di NADH (circa 0,4 mg di NADH per ogni
tavoletta);
- un flacone con 60 ml di buffer e α-chetogluatarato (pH 8.0);
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CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
- un flacone contenente una soluzione di glutammato deidrogenasi (1,2 ml) ;
- un flacone con una soluzione di controllo.
La determinazione della concentrazione dello ione ammonio si basa
sull’amminazione riduttiva dell’ α-chetogluatarato, ad opera della glutammato
deidrogenasi (GLDH) e della forma ridotta della nicotinamide adenin dinucleotide
(NADH) secondo l’equazione:
α-chetoglutarato + NADH + NH4 + Glutammato + NAD + +H2O
Modalità di esecuzione
Per ogni campione da analizzare abbiamo sciolto una tavoletta di NADPH in 1 ml di
buffer (miscela di reazione).
Nel frattempo sono state preparate una serie di cuvette: bianco, campione 1,
campione 2, ecc… nelle quali sono state aggiunte le seguenti quantità:
BIANCO CAMPIONE CONTROLLO
Miscela di reazione 1,000 ml 1,000 ml 1,000 ml
Campione - 100 µl -
Acqua 2,000 ml 1,900 ml 1,900 ml
Soluzione di controllo - - 100 µl
Le cuvette sono state poi ricoperte con parafilm ed agitate, dopodiché sono state fatte
riposare per 5 minuti ad una temperatuta di circa 20-25 °C ed è stata letta
l’assorbanza a 340 nm.
Successivamente ad ogni cuvetta sono stati aggiunti 20 µl di soluzione contenente la
glutammato deidrogenasi; dopo averle agitate, capovolgendole dolcemente, sono stati
attesi circa 20 minuti affinchè la reazione fosse completata ed è stata letta ed annotata
l’assorbanza finale a 340 nm.
Calcoli
∆A = Ainiziale – Afinale
GLDH
Concentrazione ammonio (g/l) = (∆Acampione – ∆Abianco ) x 0,0816
Controllo (g/l) = (∆Acontrollo – ∆Abianco ) x 0,0816
70

3.4.8 Determinazione del glicerolo
CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
La determinazione del glicerolo è stata effettuata mediante un kit enzimatico della
ditta Roche.
La confezione del kit conteneva:
- un flacone con all’interno: glicinglicina buffer (pH 7.4);
- 7 mg di NADH; 22 mg di ATP; 11 mg di PEP-CHA;
- un flacone con 0,4 ml di sospensione di piruvato chinasi e L-lattato
deidrogenasi;
- un flacone contenente una soluzione di glicerolchinasi (0,4 ml);
- un flacone con una soluzione di controllo.
La determinazione della concentrazione del glicerolo si basa sulle seguenti reazioni:
il glicerolo viene fosforilato dall’ATP con la glicerolo chinasi (GK) per produrre
glicerolo-3-fosfato e ADP
Glicerolo + ATP L-glicerolo-3-fosfato + ADP
L’ADP formato dalla reazione precedente è riconvertita in ATP in presenza di
fosfoenolpiruvato (PEP) mediante la piruvato chinasi (PK), con la formazione di
piruvato:
ADP + PEP ATP + piruvato
In presenza dell’enzima L-lattato-deidrogenasi (L-LDH), il piruvato è ridotto a lattato
con relativa ossidazione del NADH a NAD +
Piruvato + NADH + H + L-lattato + NAD +
Il quantitativo di NAD + che si forma è stechiometrico con il quantitativo di glicerolo.
Misurando l’assorbanza a 340 nm possiamo risalire alla concentrazione di glicerolo.
Modalità di esecuzione:
GK
GK
L-LDH
Il contenuto del primo flacone, contenente buffer, NADH, ATP e PEP-CHA è stato
disciolto in 11 ml di acqua deionizzata (miscela di reazione). Nel frattempo sono
state preparate una serie di cuvette: bianco, campione 1, campione 2, ecc… nelle
quali sono state aggiunte le seguenti quantità:
71

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
Dopo averle ricoperte con parafilm e agitate, le cuvette sono state fatte riposare per 5-
7 minuti ed è stata letta l’assorbanza a 340 nm.
Successivamente ad ogni cuvetta sono stati aggiunti 10 µl di soluzione contenente la
glicerolchinasi; dopo averle agitate, capovolgendole dolcemente, sono stati attesti
circa 10 minuti affinchè la reazione fosse completata ed è stata letta ed annotata
l’assorbanza finale a 340 nm.
Calcoli:
∆A = A iniziale – A finale
Concentrazione glicerolo (g/l) = (∆A campione – ∆A bianco ) x 0,44
Controllo (g/l) = (∆A controllo – ∆A bianco ) x 0,44
3.4.9 Determinazione dell’etanolo
La preparazione del campione prevede la filtrazione di una piccola aliquota di
fermentato (10 ml) con filtro cut-off 0.2 µm, a cui si aggiunge uno standard interno, il
3-metil-2-butanolo ad una concentrazione di 10 ml/l. A questo punto si procede
all’analisi mediante gas-cromatografia (GC) impiegando lo stesso apparecchio
utilizzato per l’analisi dei composti volatili e degli alcoli superiori (3.3.4 e 3.4.5). La
calibrazione del sistema analitico è stata effettuata mediante una curva di taratura
ottenuta dall’iniezione di soluzioni standard contenenti etanolo a differente
concentrazione e lo standard interno.
BIANCO CAMPIONE CONTROLLO
Miscela di reazione 1,000 ml 1,000 ml 1,000 ml
Campione - 100 µl -
Acqua 2,000 ml 1,900 ml 1,900 ml
Soluzione con PK ed
L-LDH
10 µl 10 µl -
Soluzione di controllo - - 100 µl
72

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
Relativamente alla determinazione gascromatografica dell’etanolo, perciò, i campioni
di vino filtrati (filtro cut-off 0.2 µm) sono stati iniettati direttamente utilizzando la
colonna Zebron ZB-WAX Plus, secondo il protocollo che segue:
- temperatura dell’iniettore: 150 °C;
- colonna Zebron ZB-WAX plus in polietilenglicole (30 metri x 0.32 mm
x 0.25 µm);
- iniettore: split 10:2; iniettato 1 µl di campione;
- temperatura: 40 °C per 5 minuti fino a 150 °C, poi 5 °C per 5 minuti
fino a 220 °C, infine 20 °C per due minuti
- gas vettore: Azoto.
3.4.10 Determinazione dell’anidride solforosa
La quantità di SO2 presente in un campione è stata determinata con la metodica di
riferimento:
- si versano, in una beuta da 1000 ml, 50 ml di campione, si aggiungono 3 ml di
H2SO4 al 10 % e 5 ml di Salda d’amido all’1 %;
- si titola con Iodio N/20 (0,05 N) fino a colorazione azzurra (si indica con a il
volume in ml di Iodio aggiunto);
- si retrotitola con Na-tiosolfato N/200 (0,005 N) fino a completa decolorazione (si
indica con b il volume in ml di Na-tiosolfato aggiunto);
- si aggiungono 8 ml di NaOH 4 N, si attendono 5 minuti a beuta chiusa e si
aggiungono 10 ml di H2SO4 al 10 %;
- si titola con Iodio N/20 (0,05 N) fino a colorazione azzurra (si indica con a′ il
volume in ml di Iodio aggiunto);
- si retrotitola con Na-tiosolfato N/200 (0,005 N) fino a completa decolorazione (si
indica con b′ il volume in ml di Na-tiosolfato aggiunto);
73

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
- si aggiungono 20 ml di NaOH 4 N (si attendono 5 minuti a beuta chiusa), circa 200
ml di acqua fredda e 30 ml di H2SO4 al 10 %;
- si titola con Iodio N/20 (0,05 N) fino a colorazione azzurra (si indica con a″ il
volume in ml di Iodio aggiunto);
- si retrotitola con Na-tiosolfato N/200 (0,005 N) fino a completa decolorazione (si
indica con b″ il volume in ml di Na-tiosolfato aggiunto).
Con le seguenti formule è possibile calcolare la solforosa presente nel campione (in
mg/l):
SO2 libera = (a – 0,1 × b) × 32
SO2 combinata = (a′ – 0,1 × b′) × 32 + (a″ – 0,1 × b″) × 32
SO2 totale = SO2 libera + SO2 combinata
3.4.11 Determinazione dei polisaccaridi
I polisaccaridi sono stati determinati mediante HPLC utilizzando il metodo proposto
da Peyron et al. (1993) con alcune modifiche.
Dopo filtrazione attraverso una membrana di nitrocellulosa con cut-off di 0.45 µm,
20 µl di campione è stato iniettato direttamente in un apparecchio HPLC della
Varian, equipaggiato con autocampionatore serie 410, una pompa serie 210 ed un
detector refrattometrico 356-LC. I campioni di vino rosso sono anche stati pre-
purificati con poliamide SC6 (Macherey-Nagel) prima della filtrazione.
La separazione isocratica è stata eseguita a 45 °C impiegando una colonna TSK G-
OLIGO-PW della Supelco (30 cm x 7.8 mm ID) equipaggiata di pre-colonna TSK-
GEL OLIGO della Supelco (4 cm x 6 mm ID). Come fase mobile è stato impiegato
NaCl 0.2 M ad un flusso di 0.8 ml/min.
La quantificazione degli analiti è stata eseguita facendo riferimento ad una curva di
calibrazione esterna, costruita con concentrazioni di mannano comprese tra 50 e 500
mg/l; L’area dei picchi è stata registrata ed integrata attraverso il Galaxie
Cromatography Data System versione 1.9.302.530 della Varian.
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3.4.12 Determinazione dell’acido L-lattico
CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
La determinazione dell’acido L-lattico nel vino è stata effettuata mediante
metodologia UV con un apposito kit della Roche.
Il principio della determinazione, si basa sul fatto che l’acido L-lattico viene ossidato
a piruvato dal NAD in presenza di L-lattato deidrogenasi.
Il kit conteneva:
- un flacone (numero 1) con circa 30 ml di soluzione contenente glicinglicina (buffer
pH 10.0), 440 mg di acido L-glutammico;
- un flacone (numero 2) con 210 mg di NAD;
- un flacone (numero 3) con 0,7 ml di sospensione di glutammato-piruvato
transaminasi;
- un flacone (numero 4) con 0,7 ml di soluzione di L-lattato deidrogenasi;
- un flacone (numero 5) con una soluzione di controllo di L-lattato.
Preparazione delle soluzioni
Si utilizza il contenuto dei flaconi 1, 3 e 4 senza diluizione. Inoltre, il contenuto del
flacone 2 viene sciolto con 6 ml di acqua deionizzata.
Quindi, si preparano le cuvette con il bianco, con i campioni, i reagenti (contenuti nei
flaconi) vengono poi ricoperte con parafilm e agitate. Infine si effettuano due letture
allo spettrofotometro ad una lunghezza d’onda di 340 nm. Si fa un prima lettura poi
si attendo trenta minuti e si ripete la lettura per osservare la differenza di assorbanza
data dalla produzione di acido L-lattico.
75

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
BIANCO CAMPIONE CONTROLLO
Soluzione 1 1 ml 1 ml 1 ml
Soluzione 2 * 200 µl 200 µl 200 µl
Sospensione 3 20 µl 20 µl 20 µl
Campione / 100 µl /
Acqua 1 ml 0,9 ml 0,9 ml
* risospensione in 6 ml di H2O
Dopo un’attesa di 5 minuti è stata letta l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 340
nm.
Dopodichè, è stata preparata la soluzione 4:
BIANCO CAMPIONE CONTROLLO
Soluzione 4 20 µl 20 µl 20 µl
A seguito di un’attesa di 30 minuti, è stata misurata l’assorbanza alla lunghezza
d’onda ( λ ) di 340 nm.
Calcoli
Innanzitutto si determina la differenza di assorbanza:
∆A = A finale – A iniziale
Dopo aver calcolato il ∆A si calcola la concentrazione in g/l di acido L-lattico:
Concentrazione acido L-lattico (g/l) = (∆A campione – ∆A bianco ) x 0,32
Controllo (g/l) = (∆A controllo – ∆A bianco ) x 0,32
76

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
3.4.13 Determinazione dell’acido lattico e dell’acido malico
L’acido lattico e l’acido malico sono stati determinati mediante HPLC.
Dopo filtrazione attraverso una membrana di nitrocellulosa con cut-off 0.45 µm, 20
µm di campione sono stati iniettati nello stesso apparecchio HPLC utilizzato per
l’analisi dei polisaccaridi. I campioni di vino rosso sono anche stati pre-purificati con
poliamide SC6 (Macherey-Nagel) prima della filtrazione.
La separazione isocratica è stata eseguita a 75 °C impiegando una colonna
Phenomenex (30 + 15) cm x 7.8 mm (Rezex-ROA-Organic Acids) con matrice di
stirene divinilbenzene solforata in forma H + .
Come fase mobile è stato impiegato H2SO4 10.5 mM ad un flusso di 0.6 ml/min.
In queste condizioni possono essere rilevati l’acido malico e l’acido D,L-lattico nei
fermentati.
La quantificazione degli analiti è stata eseguita facendo riferimento ad una curva di
calibrazione esterna, costruita con concentrazioni di ciascun composto comprese tra
0.5 e 20 g/l; Le aree relative ai picchi sono state registrate ed integrate attraverso il
Galaxie Cromatography Data System versione 1.9.302.530 della Varian.
3.5 Analisi sensoriale dei vini mediante descrittori (panel test)
Al termine della fermentazione malolattica, i vini sono stati trasferiti in bottiglie di
vetro da 0,75 l chiuse con tappi di sughero e lasciati riposare per alcuni mesi;
trascorso questo periodo di affinamento, erano pronti per essere sottoposti a
valutazione sensoriale.
La prova sensoriale è stata allestita sulla base di una lista di 14 descrittori che
riguardavano sia le note aromatiche (floreale, fruttato, speziato, tostato, vegetale e
intensità odorosa complessiva) sia i principali caratteri strutturali (dolce, acidità,
sapidità, calore, astringenza, viscosità, amaro e persistenza gusto-olfattiva). Un
77

CAPITOLO 3 - MATERIALI E METODI
gruppo di 8 assaggiatori, di cui 2 enologi e 6 tecnici del settore, sono stati chiamati a
valutare i vini ed esprimere un giudizio su ciascuna categoria sensoriale utilizzando
una scala da 1 a 9, dove 9 era il punteggio che quantitativamente rappresentava il
giudizio migliore (massimo gradimento), mentre 1 era il punteggio da attribuire in
caso di scarso gradimento. I vini sono stati versati in bicchieri di vetro da 250
ml,precedentemente avvinati, ai quali era stato assegnato un codice di
identificazione; successivamente sono stati presentati in gruppi di 8 ed in ordine
casuale a ciascun assaggiatore.
I risultati ottenuti sono stati tabulati, mediati e sottoposti ad analisi statistica. I dati
così elaborati sono stati usati per costruire dei grafici che fornissero indicazioni sia
sul contributo di ciascun descrittore alla qualità organolettica complessiva del vino
sia sulle differenze significative tra i vini in relazione a ciascun descrittore.
3.6 Analisi statistica
Tutti i dati sperimentali risultanti dalle analisi chimiche e dal test di analisi sensoriale
sono stati sottoposti ad analisi della varianza (ANOVA). Le medie ottenute sono
state elaborate utilizzando il software SuperANOVA, versione 1.1, per Macintosh
OS 9.1. Le differenze significative tra i dati mediati sono state determinate
utilizzando il test di Duncan e i risultati sono stati considerati significativi per un
valore di P associato inferiore a 0,05. .
78

CAPITOLO 4 - RISULTATI
CAPITOLO 4 - RISULTATI
4.1 Valutazione dell’attitudine enologica di 16 ceppi di lieviti non-
Saccharomyces inoculati in fermentazioni miste con S. cerevisiae
mediante microfermentazioni
4.1.1 Ceppo EC1118 di S. cerevisiae in coltura pura (controllo)
Dalla figura 8 si evince che il vigore fermentativo delle colture pure del ceppo
EC1118 alle tre diverse concentrazioni risulta essere in funzione del numero di
cellule inoculato; infatti, alla più alta concentrazione (10 7 cell/ml) si assiste ad un più
rapido avvio della fermentazione, mentre si ha un avvio ritardato alle concentrazioni
di 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml rispettivamente di circa uno e due giorni. A fine
fermentazione (23 giorni), in tutte le tesi la CO2 svolta è risultata comunque ad un
livello di circa 40-45 g su 450 ml di mosto inoculato. La concentrazione cellulare del
ceppo di Saccharomyces raggiunge, dopo due giorni di fermentazione, lo stesso
livello in tutte e tre le prove (Fig. 9).
Figura 8: andamento fermentativo di S. cerevisiae in coltura pura a tre livelli di inoculo (media
risultati)
79

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 9: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle prove con S. cerevisiae in coltura
pura a tre diverse concentrazioni 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml (media risultati)
In figura 10 viene riportata la velocità di fermentazione delle 16 specie di lievito
non-Saccharomyces in coltura pura. Come era atteso, tutti i ceppi non-
Saccharomyces utilizzati nella presente indagine hanno mostrato una attività
fermentativa inferiore a quella del ceppo di S. cerevisiae EC1118 usato come
controllo. I lieviti non-Saccharomyces, inoculati in coltura pura (Fig. 11),
mantengono più o meno costante la loro concentrazione iniziale (10 7 cell/ml) fino a
fine fermentazione, ad eccezione del ceppo di Candida zemplinina (22), che
comunque persiste, dopo 22 giorni di fermentazione, alla concentrazione di 10 5
cell/ml.
80

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 10: andamento fermentativo delle 16 specie di lievito non-Saccharomyces in coltura pura
Figura 11: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle prove con i diversi ceppi di non-
Saccharomyces inoculati in coltura pura a concentrazione di 10 7 cell/ml
81

CAPITOLO 4 - RISULTATI
I risultati dei principali caratteri enologici e di quelli dei composti volatili delle prove
di controllo condotte dal ceppo di S. cerevisiae sono riportati rispettivamente nelle
Tabelle 2, 3 e 4. Tali risultati saranno confrontati e commentati in riferimento alle
fermentazioni multistarter condotte utilizzando i vari ceppi dei lieviti non-
Saccharomyces.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo
(g/l)
ΔΔ+ Polisaccaridi
(mg/l)
S. cerevisiae 10 7 3,27 6.82±0,22 0,41±0,02 13,85±0,07 6,40±0,73 92±13
S. cerevisiae 10 5 3,26 6.90±0,22 0,44±0,03 13,80±0,07 6,69±0,21 91±12
S. cerevisiae 10 3 3,25 6.82±0,20 0,47±0,08 13,75±0,13 6,83±0,62 74±7
Tabella 2: principali parametri enologici dei fermentati delle prove con S. cerevisiae in coltura
pura (media risultati repliche)
Inoculo
(cell/ml)
S. cerevisiae 10 7
S. cerevisiae 10 5
S. cerevisiae 10 3
Acetaldeide
31,05
±0,56
30,24
±3,11
27,17
±0,19
Metanolo
21,79
±0,48
21,70
±0,67
20,63
±0,69
Propanolo
36,16
±0,47
40,18
±2,30
36,14
±0,71
Etil acetato
29,59
±1,15
31,83
±0,62
31,54
±2,80
Isobutanolo
75,95
±6,40
72,71
±4,46
78,56
±5,97
Amilico attivo
13,41
±1,07
11,40
±0,14
12,57
±0,82
Isoamilico
111,83
±1,38
96,20
±12,22
105,72
±0,41
Tabella 3: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati delle prove con S. cerevisiae (media
risultati repliche)
82

Inoculo
(cell/ml)
S. cerevisiae 10 7
S. cerevisiae 10 5
S. cerevisiae 10 3
Acetato di
isoamile
0,26
±0,00
0,20
±0,03
0,27
±0,05
Etil esanoato
0,18
±0,02
0,20
±0,03
0,19
±0,01
Esil acetato
0,03
±0,00
0,03
±0,00
0,03
±0,00
Esanolo
0,38
±0,05
0,32
±0,01
0,36
±0,06
Etil ottanoato
CAPITOLO 4 - RISULTATI
0,16
±0,03
0,18
±0,02
0,19
±0,01
Etil decanoato
0,38
±0,00
0,40
±0,01
0,36
±0,01
Feniletil acetato
0,25
±0,01
0,30
±0,14
0,19
±0,01
Tabella 4: altri composti i volatili (mg/l) dei fermentati delle prove con S. cerevisiae (media
risultati repliche)
4.1.2 Ceppo 94 e 92 di Torulaspora delbrueckii
2-feniletanolo
12,07
±0,40
10,92
±1,02
10,48
±0,79
Nella figura 12 si osservano notevoli differenze nella cinetica di fermentazione fra le
tre tesi con i diversi livelli di inoculo di S. cerevisiae in combinazione con il ceppo
94 di T. delbrueckii. Infatti, mentre in presenza della più alta concentrazione di S.
cerevisiae si raggiunge la massima quantità di CO2 svolta intorno al 14° giorno di
fermentazione, con un andamento del tutto comparabile al controllo (S. cerevisiae in
coltura pura inoculato a 10 7 cell/ml), nella fermentazione con inoculo di 10 5 cell/ml
lo stesso valore viene raggiunto non prima del 18° giorno e nella fermentazione con
inoculo di 10 3 cell/ml solo a fine fermentazione, indicando una certa influenza
sull’attività fermentativa della concentrazione di inoculo del ceppo di S. cerevisiae.
83

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 12: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con T. delbrueckii (94)
L’evoluzione della biomassa, valutata nel corso delle fermentazioni coinoculate, è
riportata nella figura 13, da cui si può osservare che l’andamento del ceppo S.
cerevisiae non risente della presenza del ceppo di T. delbrueckii nelle tre tesi;
tuttavia, il ceppo non-Saccharomyces risulta essere abbastanza competitivo con S.
cerevisiae. Nella tesi con più alto livello di inoculo di S. cerevisiae, T. delbrueckii
non supera la concentrazione cellulare iniziale e persiste a tale livello fino al 10°
giorno di fermentazione. Nelle due restanti tesi invece, la concentrazione iniziale di
T. delbrueckii incrementa rispettivamente di uno o due ordini di grandezza e rimane
pressoché costante fino al 15° giorno di fermentazione, per poi decrescere
rapidamente.
84

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 13: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di T. delbrueckii (94) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di
S. cerevisiae
Le medie dei principali parametri enologici valutati a fine fermentazione sono
riportate in tabella 5, da cui è possibile osservare come i valori di pH dei fermentati
subiscano una riduzione rispetto alla tesi con T. delbrueckii in purezza, che risulta
essere inversamente proporzionale alla concentrazione del S. cerevisiae inoculato. Al
contrario, l’acidità totale subisce un incremento nella tesi in cui T. delbrueckii è stata
fatta fermentare in purezza, sia rispetto ai fermentati con S. cerevisiae in coltura pura
85

CAPITOLO 4 - RISULTATI
sia rispetto alle fermentazioni miste. L’etanolo prodotto, invece, dimostra l’influenza
fermentativa favorevole del ceppo di S. cerevisiae sul non-Saccharomyces con il
completo consumo degli zuccheri e buon rendimento in alcol, che raggiunge e supera
la concentrazione rilevata nelle fermentazioni del S. cerevisiae in coltura pura, i cui
risultati sono riportati in Tabella 2.
La quantità di polisaccaridi sembra essere positivamente influenzata dalla presenza
di T. delbrueckii, con una maggiore produzione rispetto alle fermentazioni con S.
cerevisiae in coltura pura. La produzione finale di glicerolo, sembra essere più
influenzata dalla presenza del S. cerevisiae che della T. delbrueckii, in quanto le
fermentazioni miste mostrano valori simili a quelli del S. cerevisiae in coltura pura.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo (g/l)
ΔΔ+ Polisaccaridi
(mg/l)
T. delbrueckii 10 7 3,47 7,35±0,16 0,29±0,03 7,92±0,18 4,75±0,28 124±9
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
3,43 6,71±0,11 0,31±0,02 13,71±0,22 6,67±0,26 114±8
3,36 6,45±0,07 0,31±0,02 14,24±0,30 6,51±0,13 156±22
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 3,27 7,05±0,15 0,24±0,01 14,12±0,22 6,73±0,22 187±22
Tabella 5: principali parametri enologici dei fermentati delle prove con Torulaspora delbrueckii
ceppo 94 (mosto base: zucchero 23.1%; polisaccaridi 237 mg/l)
La quantità di acido acetico prodotto a fine fermentazione è inferiore a 0,5 g/l in tutte
le tesi. In particolare, la quantità di acido acetico prodotta dal ceppo 94 di T.
delbrueckii in coltura pura è inferiore rispetto alle fermentazioni con i diversi livelli
di inoculo di S. cerevisiae, che a sua volta è notevolmente inferiore rispetto alla
quantità prodotta dal solo S. cerevisiae, come ampiamente dimostrato in letteratura
(Castelli, 1969; Ciani et al., 2006; Bely et al., 2008).
Inoltre, la presenza di T. delbrueckii nelle fermentazioni miste riduce l’acidità
volatile in modo rilevante e inversamente proporzionale alla concentrazione del S.
cerevisiae coinoculato.
86

Inoculo
(cell/ml)
T. delbrueckii 10 7
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
Acetaldeide
14,85
±2,01
40,48
±7,59
27,82
±2,03
Metanolo
22,27
±3,52
21,85
±0,93
23,03
±2,33
Propanolo
25,92
±4,27
43,88
±0,44
69,34
±2,29
Etil acetato
71,74
±8,64
32,15
±0,64
43,00
±2,39
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Isobutanolo
12,34
±2,43
83,75
±3,61
65,78
±0,61
Amilico attivo
11,35
±1,02
18,11
±0,96
19,80
±0,45
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
34,45 22,05 79,40 37,08 70,10 29,33
±13,00 ±0,30 ±6,39 ±6,11 ±16,80 ±3,77
Tabella 6: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con T. delbrueckii (94)
Isoamilico
51,71
±1,21
120,8
±2,90
95,26
±4,66
110,6
±11,25
L’analisi dei principali composti volatili (Tab. 6) ha evidenziato una produzione di
acetaldeide, isobutanolo alcool amilico ed isoamilico da parte delle rispettive tesi co-
inoculate poco differente rispetto alla coltura pura di S. cerevisiae. La produzione di
propanolo, invece, ha subito un incremento nelle fermentazioni miste inoculate con
S. cerevisiae a concentrazione di 10 5 e 10 3 cell/ml rispetto a quelle in coltura pura.
Per i restanti composti i tre livelli di inoculo di S. cerevisiae non hanno influenzato la
loro produzione nelle tre tesi coinoculate.
La valutazione degli altri composti volatili (Tab. 7) ha evidenziato un incremento
generalizzato delle concentrazioni di acetato di isoamile, etanolo e 2-feniletanolo
nelle tesi in cui T. delbrueckii è stata coinoculata con S. cerevisiae, in particolare alle
concentrazioni di 10 7 e 10 5 cell/ml, in confronto ai rispettivi controlli. La coltura pura
di T. delbrueckii ceppo 94 ha mostrato limitate produzioni di tutti questi composti
volatili.
87

Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
T. delbrueckii 10 7 0,01
±0,01
0,02
±0,01
0,02
±0,01
0,32
±0,04
0,01
±0,01
0,02
±0,01
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,84 0,39 0,05 1,35 0,14 0,41
±0,08 ±0,06 ±0,01 ±0,12 ±0,01 ±0,07
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,72 0,17 0,05 0,59 0,08 0,12
±0,06 ±0,06 ±0,01 ±0,08 ±0,03 ±0,02
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,91 0,35 0,06 1,34 0,11 0,24
±0,10 ±0,04 ±0,02 ±0,08 ±0,05 ±0,06
Tabella 7: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con T. delbrueckii (94)
Esil acetato
Esanolo
Etil ottanoato
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Etil decanoato
Feniletil acetato
0,01
±0,01
0,21
±0,06
0,13
±0,03
0,21
±0,02
2-feniletanolo
4,94
±0,67
26,44
±0,81
19,10
±1,54
21,57
±1,09
In Figura 14 è riportato l’andamento fermentativo delle prove di fermentazione mista
relative al coinoculo del ceppo 92 di T. delbrueckii. Come per il ceppo 94, anche per
il ceppo 92 si osservano tra le tre tesi delle differenze rilevanti. Pur con leggere
differenze tra le repliche, infatti, mentre in presenza della più alta concentrazione di
S. cerevisiae si raggiunge, similmente al controllo S. cerevisiae inoculato a 10 7
cell/ml, la massima quantità di CO2 svolta intorno al 14-15° giorno, nella
fermentazione con inoculo di 10 5 cell/ml, lo stesso valore viene raggiunto
successivamente e nella fermentazione con inoculo di 10 3 cell/ml solo a fine
fermentazione, confermando a livello di specie una certa influenza sull’attività
fermentativa del ceppo di S. cerevisiae.
88

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 14: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con T. delbrueckii (92)
L’evoluzione della conta microbica vitale, valutata nel corso delle fermentazioni, è
riportata nelle figura 15. Relativamente alle fermentazioni coinoculate, l’andamento
del ceppo S. cerevisiae non risente della presenza del ceppo 92 di T. delbrueckii.
Tuttavia, come per le prove descritte precedentemente, il ceppo non-Saccharomyces
risulta essere abbastanza competitivo con S. cerevisiae: nella tesi con più alto livello
di inoculo di S. cerevisiae, infatti, T. delbrueckii non supera la concentrazione
cellulare iniziale e persiste al di sopra di 10 6 cell/ml fino al 7-10° giorno. Nelle due
restanti tesi invece, il ceppo 92 di T. delbrueckii rimane pressoché costante fino al
15° giorno per poi decrescere rapidamente.
89

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 15: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di T. delbrueckii (92) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di
S. cerevisiae
Relativamente ai principali parametri enologici valutati a fine fermentazione (Tab.
8), è possibile osservare che la presenza del ceppo 92 di T. delbrueckii determina
un’acidificazione del fermentato, abbassando i valori di pH ed incrementando quelli
dell’acidità totale, come confermato anche nella coltura pura. Non si registrano
differenze nei riguardi della produzione di etanolo e di glicerolo sia nelle
fermentazioni in purezza del S. cerevisiae e della T. delbrueckii sia in quelle miste.
90

CAPITOLO 4 - RISULTATI
La produzione di polisaccaridi, invece, sembra essere positivamente e
significativamente influenzata dalla presenza del ceppo 92 di T. delbrueckii.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo
(g/l)
ΔΔ+ Polisaccaridi
(mg/l)
T. delbrueckii 10 7 3,09 7,90±0,12 0,40±0,02 13,07±0,09 6,72±0,35 289±31
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7 3,19 7,12±0,02 0,38±0,01 13,90±0,04 5,88±0,04 157±16
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5 3,10 7,36±0,51 0,40±0,04 13,85±0,08 6,14±0,22 269±44
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 3,08 7,34±0,49 0,41±0,01 13,76±0,04 6,29±0,61 308±42
Tabella 8: principali parametri enologici dei fermentati delle prove con Torulaspora delbrueckii
ceppo 92 (mosto base: zucchero 23.1%; polisaccaridi 237 mg/l)
Il ceppo 92 in coltura pura, ha confermato la ridotta produzione di acido acetico di
questa specie. Nelle tesi con coinoculo, infatti, la quantità di acido acetico prodotto è
risultata sempre più bassa in confronto alle tesi con il S. cerevisiae in coltura pura.
Valutando tuttavia le produzioni relative ai diversi livelli di inoculo del S. cerevisiae
non si notano differenze sostanziali come per il ceppo 94 di T. delbrueckii.
L’analisi dei principali composti volatili (Tab. 9) nelle tesi coinoculate ha
evidenziato, rispetto alla coltura pura di S. cerevisiae, una produzione simile di
acetaldeide, propanolo e isobutanolo. La produzione di alcooli amilici, invece, ha
subito un incremento nelle fermentazioni coinoculate rispetto a quelle in coltura pura
sia del Saccharomyces che del non-Saccharomyces. Anche per i restanti metaboliti
non si osservano variazioni rilevanti nelle tre tesi coinoculate.
91

Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
Etil acetato
CAPITOLO 4 - RISULTATI
T. delbrueckii 10 7 26,42
±5,27
20,85
±1,86
41,81
±6,32
57,24
±4,55
41,59
±6,31
15,11
±1,13
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
29,68 21,39 39,02 34,19 75,48 17,83
±9,96 ±0,97 ±9,44 ±2,34 ±9,17 ±1,77
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
23,90 20,04 46,18 48,14 77,52 26,37
±4,81 ±1,57 ±12,61 ±0,97 ±12,31 ±0,36
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
26,06 22,07 47,65 50,52 66,45 28,48
±4,83 ±1,60 ±9,47 ±4,19 ±12,28 ±2,48
Tabella 9: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con T. delbrueckii (92)
Isobutanolo
Amilico attivo
Isoamilico
105,48
±15,28
136,50
±9,91
139,10
±1,85
141,51
±14,30
La valutazione degli altri composti volatili (Tab. 10) ha evidenziato un incremento
della concentrazione di 2-feniletanolo nei fermentati ottenuti dal coinoculo del ceppo
di T. delbrueckii e del ceppo starter di S. cerevisiae alla concentrazione più bassa,
confermando le caratteristiche di alto produttore del ceppo per tale composto. Si
evidenzia, inoltre, una riduzione generalizzata di etil decanoato e di feniletil acetato
negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste rispetto a quelli prodotti da S.
cerevisiae in coltura pura. Per gli altri composti volatili non si sono osservate
variazioni significative.
Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
T. delbrueckii 10 7 0,83
±0,12
0,13
±0,03
0,03
±0,01
0,33
±0,02
0,07
±0,01
0,18
±0,03
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,28 0,23 0,02 0,37 0,18 0,19
±0,01 ±0,02 ±0,01 ±0,01 ±0,01 ±0,02
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,43 0,17 0,02 0,34 0,14 0,31
±0,04 ±0,04 ±0,01 ±0,02 ±0,04 ±0,01
T. delbrueckii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,28 0,11 0,03 0,38 0,05 0,26
±0,04 ±0,01 ±0,01 ±0,03 ±0,01 ±0,01
Tabella 10: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con T. delbrueckii (92)
Esil acetato
Esanolo
Etil ottanoato
Etil decanoato
Feniletil acetato
0,12
±0,06
0,14
±0,05
0,09
±0,04
0,06
±0,02
2-feniletanolo
15,83
±0,87
13,71
±0,72
16,89
±0,40
19,91
±1.00
92

4.1.3 Ceppo 46 di Metschnikowia pulcherrima
CAPITOLO 4 - RISULTATI
L’andamento fermentativo delle prove multistarter allestite con il lievito S. cerevisiae
(nei tre diversi livelli di inoculo) in associazione con la specie non-Saccharomyces
M. pulcherrima ceppo 46 è riportato in figura 16. Dai risultati ottenuti si osserva un
andamento fermentativo analogo nelle fermentazioni con S. cerevisiae inoculato a
concentrazioni pari a 10 5 e 10 3 cell/ml; queste tesi si discostano nettamente dalla
fermentazione allestita con la più alta concentrazione di S. cerevisiae. Infatti, mentre
in quest’ultima si assiste ad un rapido avvio del processo fermentativo e si raggiunge
la massima quantità di CO2 svolta intorno al 10° giorno, nella altre due tesi lo stesso
valore viene raggiunto non prima del 15° giorno.
Figura 16: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con M. pulcherrima (46)
L’evoluzione della biomassa valutata nel corso delle fermentazioni è riportata nella
figura 17. Anche in questo caso (analogamente a quanto visto nella prova precedente
allestita con T. delbrueckii) lo sviluppo del ceppo S. cerevisiae non risente della
presenza di M. pulcherrima. Il ceppo non-Saccharomyces, invece, risulta essere poco
competitivo con S. cerevisiae in ogni fermentazione coinoculata. Infatti, la
93

CAPITOLO 4 - RISULTATI
concentrazione iniziale di M. pulcherrima si mantiene costante solo nei primi 3-4
giorni, dopo i quali si assiste ad un rapido decremento.
Figura 17: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di M. pulcherrima (46) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml
di S. cerevisiae
Per quanto riguarda i principali parametri enologici, valutati a fine fermentazione e
riportati in tabella 11, è possibile osservare come essi non subiscano evidenti
variazioni sia negli svinati delle tre fermentazioni di controllo con S. cerevisiae sia
nelle tesi coinoculate, ad eccezione dei polisaccaridi, che aumentano nelle
94

CAPITOLO 4 - RISULTATI
fermentazioni miste, e dell’acidità volatile, che invece si riduce considerevolmente.
La quantità di acido acetico prodotto a fine fermentazione, comunque, non supera il
valore di 0,5 g/l in nessuna tesi.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo
(g/l)
ΔΔ+ Polisaccaridi
(mg/l)
M. pulcherrima 10 7 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
M. pulcherrima 10 7
+ S. cerevisiae 10 7 3,40 6,33±0,27 0,30±0,04 13,87±0,01 6,53±0,27 120±10
M. pulcherrima 10 7
+ S. cerevisiae 10 5 3,39 6,50±0,16 0,34±0,07 13,79±0,13 6,98±0,00 126±10
M. pulcherrima 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 3,40 6,64±0,37 0,33±0,01 13,65±0,19 7,25±0,25 154±17
Tabella 11: principali parametri enologici dei fermentati delle prove con Metschnikowia
pulcherrima ceppo 46 (mosto base: zucchero 23.1%; polisaccaridi 237 mg/l)
L’analisi dei principali composti volatili (Tab. 12) non ha evidenziato variazioni
rilevanti nelle fermentazioni in coinoculo rispetto a quelle condotte in coltura pura
con il ceppo di S. cerevisiae.
Inoculo
(cell/ml)
M. pulcherrima 10 7
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
Etil acetato
Isobutanolo
Amilico attivo
Isoamilico
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
M. pulcherrima 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
41,84 21,57 35,89 30,42 95,97 17,94 139,14
±2,17 ±1,80 ±8,34 ±1,54 ±20,90 ±1,22 ±21,81
M. pulcherrima 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
28,34 23,25 44,65 38,45 43,71 13,42 73,88
±0,78 ±3,86 ±1,98 ±1,29 ±6,37 ±0,18 ±3,51
M. pulcherrima 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
28,93 21,75 48,01 51,64 50,50 15,95 85,37
±4,13 ±1,30 ±5,61 ±7,95 ±2,05 ±1,79 ±7,78
Tabella 12: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Metschnikowia pulcherrima
(46)
95

CAPITOLO 4 - RISULTATI
La valutazione degli altri composti volatili (Tab. 13) ha evidenziato minori
concentrazioni di quasi tutti gli analiti nelle fermentazioni in cui M. pulcherrima è
stata coinoculata con concentrazioni pari a 10 7 e 10 5 cell/ml di S. cerevisiae; mentre
il coinoculo con 10 3 cell/ml di S. cerevisiae ha mostrato un incremento, in certi casi
notevole, della concentrazione della maggior parte dei volatili rispetto ai rispettivi
controlli con S. cerevisiae in coltura pura, in particolare di acetato di isoamile e di 2-
feniletanolo .
Inoculo
(cell/ml)
M. pulcherrima 10 7
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
Esil acetato
Esanolo
Etil ottanoato
Etil decanoato
Feniletil acetato
2-feniletanolo
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
M. pulcherrima 10 7
0,22 0,14 0,02 0,40 0,05 0,15
7
+ S. cerevisiae 10 ±0,03 ±0,02 ±0,01 ±0,08 ±0,02 ±0,01
M. pulcherrima 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,42 0,11 0,05 0,43 0,07 0,14
±0,03 ±0,01 ±0,008 ±0,04 ±0,02 ±0,01
M. pulcherrima 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,99 0,15 0,04 0,73 0,15 0,16
±0,09 ±0,01 ±0,01 ±0,11 ±0,02 ±0,00
Tabella 13: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con M. pulcherrima (46)
4.1.4 Ceppo 69 di Candida tropicalis
0,08
±0,02
0,16
±0,00
0,23
±0,02
9,49
±1,00
11,39
±1,15
32,30
±0,99
In figura 18 è riportato l’andamento fermentativo delle prove multistarter allestite
con il lievito S. cerevisiae (nei tre diversi livelli di inoculo) unitamente alla specie
non-Saccharomyces Candida tropicalis, ceppo 69. Come si può rilevare l’andamento
fermentativo è analogo nelle fermentazioni in cui il S. cerevisiae è stato coinoculato
a concentrazioni pari a 10 5 e 10 3 cell/ml, le quali invece differiscono sostanzialmente
dalla fermentazione con S. cerevisiae coinoculato a concentrazione di 10 7 cell/ml. In
quest’ultima tesi, infatti, si raggiunge la massima quantità di CO2 intorno al 10-12°
giorno, mentre gli altri due coinoculi mostrano andamento fermentativo analogo fino
al raggiungimento del plateau intorno al 18° giorno, indicando in tali condizioni
96

CAPITOLO 4 - RISULTATI
un’influenza del ceppo non-Saccharomyces sulle performance fermentative di S.
cerevisiae.
Figura 18: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con C. tropicalis (69)
Dalla valutazione della carica microbica vitale durante il processo fermentativo è
possibile rilevare una consistente presenza della ceppo di C. tropicalis a
concentrazioni superiori a 10 6 cell/ml sino al 15° giorno in tutte e tre le fermentazioni
con i diversi livelli di inoculo della coltura di S. cerevisiae (Fig. 19).
97

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 19: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di C. tropicalis (69) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di S.
cerevisiae
I dati relativi ai principali parametri enologici valutati a fine fermentazione (Tab. 14)
non evidenziano differenze marcate tra le tesi in coinoculo e quelle in coltura pura,
anche a bassi livelli di inoculo del S. cerevisiae.
La produzione di acidità totale e volatile nel coinoculo S. cerevisiae-C. tropicalis è
risultata di poco inferiore alle rispettive prove condotte in coltura pura dal S.
98

CAPITOLO 4 - RISULTATI
cerevisiae ed in linea con le quantità prodotte in coltura pura, mentre una tendenza
opposta hanno mostrato pH e polisaccaridi prodotti.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo (% v/v)
Glicerolo (g/l)
ΔΔ+ Polisaccaridi
(mg/l)
C. tropicalis 10 7 3,44 7,73±0,85 0,34±0,03 6,94±0,25 4,47±0,33 221±14
C. tropicalis 10 7
7
+ S. cerevisiae 10
3,45 6,52±0,03 0,37±0,03 13,77±0,16 6,68±0,01 131±17
C. tropicalis 10 7
5
+ S. cerevisiae 10
3,41 6,47±0,21 0,38±0,02 13,64±0,23 6,82±0,13 142±9
C. tropicalis 10 7
3
+ S. cerevisiae 10
3,39 6,47±0,43 0,35±0,02 13,73±0,18 6,77±0,18 158±9
Tabella 14: principali parametri enologici dei fermentati delle prove con Candida tropicalis
ceppo 69 (mosto base: zucchero 23.1%; polisaccaridi 237 mg/l)
Anche per i principali prodotti di fermentazione volatili (Tab.15) non si rilevano
significative differenze dovute alla presenza della coltura appartenente alla specie C.
tropicalis. Da notare l’alta produzione di etil acetato da parte di C. tropicalis in
coltura pura, non rilevabile nelle fermentazioni in coltura mista, che non differiscono
dai controlli, e una leggera riduzione nella produzione di alcol isoamilico nelle
fermentazioni multistarter rispetto alle relative prove con S. cerevisiae in coltura
pura.
Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
C. tropicalis 10 7 15,08
±2,03
23,17
±0,96
25,66
±3,51
225,28
±28,32
77,9
±4,03
22,24
±4,25
69,63
±5,30
C. tropicalis 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
36,59 20,08 44,32 31,65 75,88 14,85 103,62
±3,53 ±0,84 ±10,85 ±4,53 ±1,45 ±0,82 ±8,37
C. tropicalis 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
33,74 21,54 49,64 33,42 55,07 17,14 77,75
±8,93 ±0,65 ±6,15 ±0,23 ±5,65 ±0,46 ±0,40
C. tropicalis 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
38,04 21,85 50,47 38,77 70,14 22,37 96,72
±15,47 ±1,16 ±6,03 ±6,10 ±14,14 ±6,06 ±21,25
Tabella 15: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Candida tropicalis (69)
Etil acetato
Isobutanolo
Amilico attivo
Isoamilico
99

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Per gli altri composti volatili in tabella 16, invece, si rilevano differenze significative
in relazione alla presenza del ceppo di C. tropicalis nel processo fermentativo per
quanto riguarda una produzione superiore di acetato di isoamile, di etil esanoato e di
esanolo nelle prove coinoculate, le quali hanno mostrato anche una riduzione di
feniletil acetato e di 2-feniletanolo.
Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
C. tropicalis 10 7 0,10
±0,01
0,03
±0,01
0,02
±0,01
0,15
±0,04
0,00
±0,00
0,90
±0,06
C. tropicalis 10 7
0,95 0,60 0,02 1,57 0,15 0,90
7
+ S. cerevisiae 10 ±0,11 ±0,09 ±0,00 ±0,13 ±0,06 ±0,06
C. tropicalis 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,68 0,57 0,02 0,64 0,20 0,35
±0,10 ±0,08 ±0,01 ±0,10 ±0,06 ±0,07
C. tropicalis 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,64 0,46 0,03 0,40 0,15 0,26
±0,10 ±0,07 ±0,01 ±0,07 ±0,04 ±0,06
Tabella 16: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con C. tropicalis (69)
Esil acetato
4.1.5 Ceppo 22 di Candida zemplinina
Esanolo
Etil ottanoato
Etil decanoato
Feniletil acetato
0,01
±0,01
0,11
±0,02
0,12
±0,01
0,11
±0,02
2-feniletanolo
0,66
±0,06
4,89
±0,37
2,22
±0,88
2,25
±0,45
Nella figura 20 è riportato l’andamento fermentativo delle prove multistarter
condotte con il ceppo 22 appartenente alla specie C. zemplinina. Come si può
rilevare, l’andamento fermentativo nelle prove con S. cerevisiae inoculato a
concentrazioni pari a 10 5 e 10 3 cell/ml, è risultato inferiore a quello ottenuto con S.
cerevisiae coinoculato a concentrazione di 10 7 cell/ml. L’evoluzione della CO2 nella
prova con coinoculo del S. cerevisiae a concentrazione di 10 3 cell/ml, pur con una
discreta variabilità, è risultata particolarmente lenta indicando, in tali condizioni,
un’influenza del ceppo di non-Saccharomyces sulle performance fermentative di S.
cerevisiae.
100

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 20: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con C. zemplinina (22)
La presenza del ceppo di C. zemplinina non sembra aver interferito sulla popolazione
vitale di S. cerevisiae (Fig. 21). I differenti livelli di inoculo del ceppo di S.
cerevisiae hanno influenzato la persistenza del ceppo di C. zemplinina. Il ceppo 22,
infatti, persiste alla concentrazione di 10 6 cell/ml per circa 7 giorni nella
fermentazione con inoculo di 10 7 cell/ml di S. cerevisiae, sino al 10° giorno nel caso
in cui il S. cerevisiae viene inoculato a concentrazione di 10 5 cell/ml e per tempi
ancora più lunghi nella fermentazione con inoculo di 10 3 cell/ml di S. cerevisiae.
101

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 21: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di C. zemplinina (22) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di
S. cerevisiae
I principali parametri enologici riportati in tabella 17 non evidenziano differenze tra
le tesi in coinoculo e quelle in coltura pura anche a bassi livelli di inoculo di S.
cerevisiae. Fa eccezione la produzione di glicerolo e di polisaccaridi che sembra
essere positivamente influenzata dalla C. zemplinina soprattutto nelle fermentazioni a
basso livello di inoculo iniziale di S. cerevisiae.
102

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Per quanto riguarda la produzione di acidità volatile, inoltre, si può notare un
incremento progressivo dei valori medi nelle fermentazioni miste, passando dai
livelli più alti a quelli più bassi di inoculo della coltura starter di S. cerevisiae.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo (% v/v)
Glicerolo (g/l)
Δ+ Polisaccaridi
(mg/l)
C. zemplinina 10 7 3,07 6,50±0,32 0,52±0,07 8,23±0,10 8,43±0,28 145±18
C. zemplinina 10 7
+ S. cerevisiae 10 7 3,21 6,88±0,27 0,43±0,04 13,83±0,04 6,25±0,30 123±42
C. zemplinina 10 7
+ S. cerevisiae 10 5 3,15 6,84±0,02 0,44±0,06 13,78±0,05 7,18±1,30 140±42
C. zemplinina 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 3,08 6,88±0,04 0,52±0,01 13,64±0,04 7,95±1,28 181±48
Tabella 17: principali parametri enologici dei fermentati delle prove con Candida zemplinina
ceppo 22 (mosto base: zucchero 23.1%; polisaccaridi 237 mg/l)
Anche per i principali composti volatili non si rilevano significative differenze
dovute alla presenza di C. zemplinina nel processo fermentativo (Tab. 18).
Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
C. zemplinina 10 7 16,50
±6,32
24,14
±0,33
18,82
±1,33
14,26
±0,82
67,43
±5,69
7,60
±0,25
22,88
±3,45
C. zemplinina 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
27,58 21,02 35,51 30,72 67,51 13,56 112,26
±10,42 ±0,27 ±3,85 ±3,08 ±4,39 ±0,85 ±8,96
C. zemplinina 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
22,78 21,82 44,98 38,30 79,29 13,01 86,58
±7,59 ±0,64 ±1,87 ±3,07 ±23,37 ±2,68 ±7,95
C. zemplinina 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
25,83 22,16 48,44 40,63 78,52 13,57 82,16
±8,35 ±0,33 ±5,07 ±0,34 ±11,33 ±0,90 ±7,27
Tabella 18: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Candida zemplinina (22)
Propanolo
Etil acetato
Isobutanolo
Amilico attivo
Isoamilico
103

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Lo stesso si può dire anche per gli altri composti volatili (Tab.19), ad eccezione di un
leggero aumento della produzione di 2-feniletanolo nelle fermentazioni miste rispetto
ai relativi controlli.
Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
C. zemplinina 10 7 0,01
±0,00
0,01
±0,00
0,05
±0,01
0,41
±0,06
0,01
±0,01
0,09
±0,02
C. zemplinina 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,16 0,24 0,02 0,46 0,21 0,28
±0,03 ±0,05 ±0,00 ±0,07 ±0,04 ±0,03
C. zemplinina 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,10 0,18 0,04 0,44 0,16 0,28
±0,01 ±0,03 ±0,01 ±0,01 ±0,03 ±0,07
C. zemplinina 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,07 0,15 0,02 0,36 0,12 0,23
±0,01 ±0,05 ±0,00 ±0,05 ±0,02 ±0,07
Tabella 19: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con C. zemplinina (22)
Esil acetato
Esanolo
Etil ottanoato
4.1.6 Ceppo 103 e 101 di Lachancea thermotolerans
Etil decanoato
Feniletil acetato
0,16
±0,03
0,27
±0,00
0,19
±0,01
0,14
±0,01
2-feniletanolo
15,81
±1,15
12,61
±1,12
15,80
±3,67
11,12
±0,45
La figura 22 riporta l’andamento fermentativo delle prove multistarter condotte da S.
cerevisiae e L. thermotolerans (103). Confrontando la cinetica di fermentazione del
ceppo di Saccharomyces in coltura pura (Fig. 8) e quella in coltura mista nella
fermentazione coinoculata con S. cerevisiae a concentrazione di 10 7 cell/ml, non si
rilevano interferenze sull’andamento fermentativo dovuto alla presenza del ceppo
non-saccaromicetico. Nelle altre due tesi (S. cerevisiae inoculato a concentrazioni
pari a 10 5 e 10 3 cell/ml) la presenza del ceppo 103 di L. thermotolerans determina
invece un lieve rallentamento del processo fermentativo.
104

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 22: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con L. thermotolerans (103)
Anche dallo sviluppo della popolazione microbica mostrato in figura 23, non si
evidenziano particolari interferenze sia del ceppo 103 di L. thermotolerans nei
confronti del ceppo di S. cerevisiae che, viceversa, del ceppo di S. cerevisiae nei
confronti del ceppo 103 di L. thermotolerans, mostrando entrambi un simile sviluppo
in tutte e tre le prove di fermentazione.
105

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 23: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di L. thermotolerans (103) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3
cell/ml di S. cerevisiae
Per quanto concerne i principali parametri enologici (Tab. 20), i fermentati ottenuti
dal coinoculo hanno evidenziato differenze di rilievo soltanto relativamente alla
produzione di polisaccaridi, che viene positivamente influenzata dal ceppo di L.
thermotolerans ed in linea con l’alta produzione nella rispettiva coltura pura, e per la
ridotta produzione di acidità volatile, nei confronti delle rispettive prove in coltura
pura condotte dal ceppo di S. cerevisiae. In particolare nelle tesi con inoculo di S.
106

CAPITOLO 4 - RISULTATI
cerevisiae a concentrazioni di 10 5 e 10 3 cell/ml rispettivamente, l’acidità volatile
finale dei coinoculi è risultata simile a quella prodotta in coltura pura dal non-
Saccharomyces.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo
(g/l)
Δ+ Polisaccaridi
(mg/l)
L. thermotolerans 10 7 3,48 7,43±0,43 0,27±0,03 11,02±0,52 6,01±0,35 235±18
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7 3,41 6,75±0,07 0,33±0,07 13,83±0,06 7,08±0,26 120±12
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 5 3,40 6,79±0,11 0,30±0,01 13,58±0,27 7,10±0,12 164±13
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 3,37 7,28±0,45 0,30±0,05 13,25±0,64 7,21±0,39 178±8
Tabella 20: principali parametri enologici dei fermentati delle prove con Lachancea
thermotolerans ceppo 103 (mosto base: zucchero 23.1%; polisaccaridi 237 mg/l)
Tra i composti volatili principali (Tab. 21) non si evidenziano sensibili differenze.
Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
L. thermotolerans 10 7 37,40
±6,53
24,23
±1,95
82,20
±7,53
37,75
±4,62
18,72
±1,22
21,92
±4,38
79,73
±12,35
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
44,26 20,90 37,16 29,04 97,14 18,09 132,42
±1,73 ±2,35 ±6,67 ±5,09 ±14,64 ±5,00 ±24,58
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
33,13 20,13 37,81 30,13 62,29 19,65 108,40
±9,91 ±0,56 ±4,56 ±3,63 ±1,92 ±6,73 ±19,77
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
37,02 20,99 50,39 34,45 43,19 24,84 100,84
±8,23 ±1,93 ±14,06 ±4,60 ±10,74 ±6,22 ±9,10
Tabella 21: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Lachancea thermotolerans (103)
Tra gli altri composti volatili (Tab. 22) si segnalano differenze significative, dovute
alla presenza del ceppo di L. thermotolerans, relative alla maggior parte degli analiti,
che risultano essere prodotti a concentrazioni superiori a quelle rilevate nei
Propanolo
Etil acetato
Isobutanolo
Amilico attivo
Isoamilico
107

CAPITOLO 4 - RISULTATI
corrispondenti fermentati di S. cerevisiae in coltura pura, ad eccezione di etil
ottanoato, feniletil acetato e 2-feniletanolo.
Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
L. thermotolerans 10 7 0,18
±0,01
0,15
±0,01
0,04
±0,01
0,34
±0,08
0,01
±0,01
0,19
±0,032
0,01
±0,00
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
1,66 0,62 0,07 1,26 0,19 0,90 0,16
±0,06 ±0,04 ±0,01 ±0,11 ±0,03 ±0,07 ±0,05
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,48 0,25 0,02 0,92 0,10 0,27 0,08
±0,04 ±0,03 ±0,01 ±0,07 ±0,03 ±0,01 ±0,02
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,47 0,67 0,02 1,22 0,05 0,37 0,07
±0,06 ±0,03 ±0,01 ±0,09 ±0,01 ±0,03 ±0,01
Tabella 22: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con L. thermotolerans (103)
Esil acetato
Esanolo
Etil ottanoato
Etil decanoato
Feniletil acetato
2-feniletanolo
1,79
±0,12
6,69
±0,83
2,26
±0,32
4,13
±1,00
In figura 24 è riportato l’andamento fermentativo delle prove multistarter condotte da
S. cerevisiae e L. thermotolerans ceppo 101. Come si può osservare, nella
fermentazione coinoculata con S. cerevisiae a concentrazione di 10 7 cell/ml, il ceppo
di S. cerevisiae raggiunge già la massima perdita di CO2 dopo soli 11-12 giorni circa.
Nelle altre due prove invece (S. cerevisiae inoculato a concentrazioni pari a 10 5 e 10 3
cell/ml), la presenza del ceppo 101 di L. thermotolerans determina un marcato
rallentamento del processo fermentativo raggiungendo la massima perdita di CO2
dopo oltre 18 giorni.
108

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 24: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con L. thermotolerans (101)
L‘evoluzione della popolazione microbica vitale (Fig. 25) non mostra evidenti
interferenze del ceppo 101 di L. thermotolerans nei confronti del ceppo di S.
cerevisiae in tutte le tesi saggiate. Al contrario, la persistenza del ceppo 101 di L.
thermotolerans é risultata proporzionale all’inoculo della coltura di S. cerevisiae: una
vitalità superiore a 10 6 cell/ml è stata mantenuta per soli 7 giorni con l’inoculo di S.
cerevisiae 10 7 cell/ml, per 10 giorni con quello pari a 10 5 cell/ml e 15 giorni per
l’inoculo pari a 10 3 cell/ml.
109

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 25: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di L. thermotolerans (101) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3
cell/ml di S. cerevisiae
Dall’analisi dei fermentati riportati in tabella 23, si possono notare elevati valori di
acidità totale. Tale concentrazione, da imputare verosimilmente alla produzione di
acido L-lattico da parte del ceppo 101 (come si può evincere anche dai dati della
coltura pura), è più marcata nei coinoculi con concentrazioni di S. cerevisiae più
basse (10 5 e 10 3 cell/ml); anche il pH scende in relazione a questo elevato tenore di
acidità. La produzione di etanolo così come quella di glicerolo e polisaccaridi non è
110

CAPITOLO 4 - RISULTATI
significativamente differente tra le diverse prove. Rispetto ai relativi controlli di
Saccharomyces si registra sempre, tuttavia, un incremento nella concentrazione sia
del glicerolo sia dei polisaccaridi nei fermentati coinoculati.
La produzione di acidità volatile nelle prove in coinoculo è risultata inferiore a quella
mostrata dalle rispettive prove in coltura pura.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo
(g/l)
Δ+ Polisaccaridi
(mg/l)
L. thermotolerans 10 7 2,84 12,90±0,86 0,43±0,06 13,16±0,03 7,89±0,51 280±26
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7 3,16 7,30±0,07 0,38±0,01 13,80±0,02 6,95±0,20 133±1
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 5 2,97 9,00±1,96 0,40±0,00 13,80±0,02 7,29±0,96 139±10
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 2,90 9,20±1,93 0,40±0,00 13,70±0.18 7,58±0,46 158±3
Tabella 23: principali parametri enologici dei fermentati delle prove con Lachancea
thermotolerans ceppo 101 (mosto base: zucchero 23.1%; polisaccaridi 237 mg/l)
Dalla tabella 24, nelle fermentazioni in coinoculo, si può rilevare un incremento della
produzione complessiva di alcoli superiori, dovuta principalmente agli alcoli amilici,
in linea con le produzioni mostrate in coltura pura. Per i restanti composti non si
possono evidenziare differenze tra le tesi in coltura pura e quelle in coinoculo.
Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
L. thermotolerans 10 7 24,35
±1,65
21,09
±0,17
36,96
±1,89
34,94
±2,58
88,05
±6,23
23,73
±0,95
153,31
±16,20
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
33,68 22,92 35,40 32,05 93,82 21,37 168,24
±7,96 ±0,09 ±1,54 ±0,35 ±2,11 ±1,83 ±15,91
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
25,11 22,83 42,46 36,33 78,00 24,94 137,34
±0,13 ±0,35 ±6,11 ±3,08 ±13,17 ±1,16 ±14,98
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
25,74 22,14 46,22 40,00 81,59 26,08 144,61
±0,86 ±0,39 ±9,25 ±5,54 ±10,21 ±2,70 ±7,66
Tabella 24: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Lachancea thermotolerans (101)
Etil acetato
Isobutanolo
Amilico attivo
Isoamilico
111

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Tra gli altri composti volatili (Tab. 25) non si evidenziano in genere differenze
significative in relazione alla presenza del ceppo 101 di L. thermotolerans. Tuttavia,
nelle tesi in coinoculo, è da sottolineare la produzione di 2-feniletanolo che risulta
sempre prodotto a concentrazioni superiori a quelle rilevate nelle rispettive tesi in
coltura pura di Saccharomyces.
Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
L. thermotolerans 10 7 2,55
±0,34
0,51
±0,08
0,08
±0,02
0,99
±0,10
0,11
±0,01
0,43
±0,02
0,27
±0,04
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,19 0,15 0,03 0,42 0,13 0,30 0,14
±0,04 ±0,01 ±0,01 ±0,02 ±0,00 ±0,02 ±0,05
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,19 0,13 0,02 0,44 0,09 0,30 0,21
±0,03 ±0,01 ±0,00 ±0,06 ±0,03 ±0,01 ±0,01
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,19 0,18 0,02 0,41 0,09 0,17 0,17
±0,05 ±0,01 ±0,00 ±0,01 ±0,05 ±0,04 ±0,01
Tabella 25: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con L. thermotolerans (101)
Esil acetato
Esanolo
Etil ottanoato
4.1.7 Ceppo 32 e 25 di Hanseniaspora osmophila
Etil decanoato
Feniletil acetato
2-feniletanolo
13,36
±0,73
16,23
±0,81
18,83
±0,52
20,93
±1,10
La figura 26 mostra l’andamento fermentativo delle prove multistarter condotte da S.
cerevisiae e H. osmophila ceppo 32. Come si può notare l’andamento fermentativo
nelle tre tesi é proporzionale all’inoculo della coltura di S. cerevisiae. Nelle
fermentazioni in cui il S. cerevisiae è inoculato a concentrazioni pari a 10 5 e 10 3
cell/ml la presenza del ceppo 32 di H. osmophila sembra aver determinato un deciso
rallentamento del processo fermentativo.
112

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 26: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con H. osmophila (32)
Dalla valutazione della carica microbica vitale (Fig. 27) è possibile rilevare una
consistente presenza del ceppo 32 di H. osmophila a concentrazioni superiori a 10 6
cell/ml sino al 15° giorno in tutte le tesi con i diversi livelli di inoculo della coltura di
S. cerevisiae ad indicare la rilevante persistenza del ceppo durante tutto il processo
fermentativo.
113

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 27: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di H. osmophila (32) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di
S. cerevisiae
I principali parametri enologici, riportati in tabella 26, non evidenziano in generale
differenze tra le tesi in coinoculo e i relativi controlli in coltura pura, anche a bassi
livelli di inoculo del S. cerevisiae. Fa eccezione la produzione di polisaccaridi, che è
risultata sempre superiore ed in linea con quanto prodotto in coltura pura dal ceppo
32 di H. osmophila, e l’acidità volatile, che invece è risultata inferiore a quella delle
rispettive prove in coltura pura condotte dal ceppo di S. cerevisiae.
114

Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo
(g/l)
ΔΔ+ Polisaccaridi
(mg/l)
H. osmophila 10 7 3,42 8,10±0,10 0,48±0,08 10,98±0,07 6,72±0,58 180±8
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 7 3,48 6,42±0,05 0,33±0,07 13,74±0,05 6,63±0,14 145±22
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 5 3,48 6,64±0,69 0,32±0,07 13,83±0,05 6,79±0,48 170±4
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 3,41 6,87±0,37 0,33±0,07 13,28±0,67 7,04±0,25 190±6
Tabella 26: principali parametri enologici dei fermentati delle prove con Hanseniaspora
hosmophila ceppo 32 (mosto base: zucchero 23.1%; polisaccaridi 237 mg/l)
Dalla tabella 27 si può evincere un incremento della produzione di etil acetato nelle
tesi coinoculate, anche se ben al di sotto della soglia percettiva. In particolare,
l’incremento della produzione di etil acetato è inversamente proporzionale alla
concentrazione di coinoculo del S. cerevisiae. Nelle fermentazioni con coinoculo del
S. cerevisiae a concentrazioni di 10 7 e 10 5 cell/ml si ha anche un leggero aumento del
valore complessivo degli alcoli superiori.
Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
H. osmophila 10 7 22,40
±0,62
23,53
±1,05
94,23
±11,20
89,97
±7,83
28,22
±3,21
15,15
±0,93
74,54
±5,38
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
38,29 21,94 34,86 36,15 83,15 17,95 127,95
±3,11 ±0,59 ±4,97 ±8,03 ±6.09 ±1.76 ±12,74
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
27,19 21,30 38,11 56,20 65,00 21,55 114,28
±4,66 ±0,48 ±3.08 ±10,63 ±13.00 ±3.00 ±19,89
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
24,38 21,59 49,50 60,94 42,50 21,50 102,76
±0,27 ±1,66 ±9.50 ±9,11 ±5.50 ±1,68 ±9,68
Tabella 27: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Hanseniaspora osmophila (32)
Per gli altri composti volatili (Tab. 28), si evidenzia una riduzione generalizzata,
soprattutto per gli esteri etilici ed il 2-feniletanolo, rispetto ai relativi controlli. E’ da
rilevare che, pur essendo nota un’ampia produzione di feniletil acetato da parte di
Etil acetato
Isobutanolo
Amilico attivo
Isoamilico
115

CAPITOLO 4 - RISULTATI
questa specie in coltura pura (come effettivamente rilevato), nelle prove in coinoculo
tuttavia non si registrano incrementi rispetto ai relativi controlli di S. cerevisiae.
Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
H. osmophila 10 7 0,17
±0,12
0,074
±0,08
0,85
±0,14
0,22
±0,05
0,00
±0,00
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,19 0,09 0,33 0,03 0,09
±0,02 ±0,01 ±0,04 ±0,00 ±0,01
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,28 0,11 0,33 0,04 0,07
±0,03 ±0,01 ±0,06 ±0,00 ±0,01
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,19 0,08 0,30 0,02 0,08
±0,04 ±0,01 ±0,04 ±0,00 ±0,03
Tabella 28: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con H. osmophila (32)
Esanolo
Etil ottanoato
Etil decanoato
Feniletil acetato
2,40
±0,05
0,17
±0,03
0,22
±0,02
0,24
±0,04
2-feniletanolo
3,79
±1,01
6,85
±0,91
6,12
±1,42
5,55
±1,01
L’andamento fermentativo delle prove multistarter condotte da S. cerevisiae e H.
osmophila ceppo 25 è riportato in figura 28. Come si può rilevare, l’attività
fermentativa non sembra essere stata influenzata significativamente. Pur con alcune
differenze tra le prove, l’andamento rispecchia e segue le concentrazioni di S.
cerevisiae inoculate in ordine decrescente 10 7 , 10 5 , 10 3 cell/ml (Fig. 29). Tuttavia,
nelle fermentazioni miste in cui S. cerevisiae viene inoculato a concentrazioni pari a
10 5 e 10 3 cell/ml, la presenza del ceppo 25 di H. osmophila sembra aver determinato
un rallentamento del processo fermentativo.
116

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 28: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con H. osmophila (25)
Il ceppo 25 di H. osmophila ha mostrato una scarsa persistenza durante il processo
fermentativo. Infatti, già al terzo giorno in tutte le fermentazioni coinoculate il ceppo
25 è presente solo alla concentrazione pari a 10 5 cell/ml e già al settimo giorno di
fermentazione scompare in tutte le tesi. E’ possibile rilevare una maggiore
persistenza passando dalla tesi con inoculo di S. cerevisiae 10 7 , quindi 10 5 e per finire
10 3 cell/ml. Tuttavia, questa maggiore persistenza è limitata e compresa tra il terzo
ed il settimo giorno di fermentazione.
117

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 29: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di H. osmophila (25) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di
S. cerevisiae
I dati relativi ai principali parametri enologici, riportati in tabella 29, non
evidenziano differenze tra le tesi in coinoculo e quelle del controllo in coltura pura.
La coltura pura di H. osmophila è risultata inquinata e quindi il risultato non è stato
riportato.
118

Inoculo
(cell/ml) pH
H. osmophila 10 7
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Glicerolo
(g/l)
Δ+ Polisaccaridi
(mg/l)
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
H. osmophila 10 7
7
+ S. cerevisiae 10
3,19 6,70±0,03 0,46±0,03 13,86±0,01 6,34±0,05 96±6
H. osmophila 10 7
5
+ S. cerevisiae 10
3,23 6,45±0,05 0,47±0,04 13,85±0.02 6,63±0,23 111±5
H. osmophila 10 7
3 3,25 6,57±0,02 0,45±0,03 13,88±0,01 6,06±0,23 101±6
+ S. cerevisiae 10
Tabella 29: principali parametri enologici dei fermentati delle prove con Hanseniaspora
hosmophila ceppo 25 (mosto base: zucchero 23.1%; polisaccaridi 237 mg/l)
Dall’esame dei risultati riportati in tabella 30 non si rilevano differenze tra le
fermentazioni in coinoculo e i relativi controlli, eccetto un incremento della
produzione di etil acetato nelle tesi coinoculate.
Inoculo
(cell/ml)
H. osmophila 10 7
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
Etil acetato
Isobutanolo
Amilico attivo
Isoamilico
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
36,59 21,24 37,68 64,68 59,89 13,14 111,71
±3,58 ±0,57 ±3,91 ±5,62 ±4,91 ±0,20 ±11,29
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
26,53 21,06 37,46 77,19 59,99 14,82 109,52
±1,84 ±0,01 ±2,35 ±4,35 ±1,89 ±2,00 ±9,41
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
27,77 20,52 40,70 89,23 69,08 14,81 109,25
±1,69 ±2,70 ±3,97 ±7,31 ±5,40 ±0,08 ±2,23
Tabella 30: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Hanseniaspora osmophila (25)
Tra gli altri composti volatili (Tab. 31) non si evidenziano, in generale, differenze
significative relative alla presenza del ceppo 25 di H. osmophila nelle tesi
coinoculate. Da sottolineare, tuttavia, l’incremento della produzione di etil decanoato
e la notevole riduzione del 2-feniletanolo nelle fermentazioni miste rispetto alla
quantità prodotta dai relativi controlli in coltura pura di S. cerevisiae.
119

Inoculo
(cell/ml)
H. osmophila 10 7
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
Esanolo
Etil ottanoato
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Etil decanoato
Feniletil acetato
2-feniletanolo
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,21 0,22 0,55 0,20 0,55
±0,04 ±0,04 ±0,08 ±0,08 ±0,08
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,33 0,31 0,50 0,29 0,57
±0,07 ±0,08 ±0,06 ±0,07 ±0,11
H. osmophila 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,38 0,28 0,42 0,28 0,52
±0,04 ±0,05 ±0,07 ±0,05 ±0,08
Tabella 31: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con H. osmophila (25)
4.1.8 Ceppo 4 di Pichia fermentans
0,22
±0,03
0,09
±0,02
0,11
±0,04
1,85
±0,88
1,72
±0,45
1,28
±0,31
Da un confronto della cinetica fermentativa di Saccharomyces cerevisiae in coltura
pura (Fig. 8) e quella in coltura mista con Pichia fermentans (Fig. 30) si può notare
come essa sia fortemente influenzata dal diverso rapporto di inoculo.
Figura 30: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con P. fermentans (4)
120

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Nella fermentazione inoculata con Saccharomyces 10 7 cell/ml e Pichia 10 7 cell/ml,
l’elevata concentrazione iniziale consente al lievito Saccharomyces di dominare la
fermentazione rallentando la crescita di Pichia fermentans (Fig. 31). Concentrazioni
più basse di S. cerevisiae al momento dell’inoculo e precisamente nel rapporto di
1:100 e 1:10000 rispetto a Pichia, determinano, in modo proporzionale, un
rallentamento della fermentazione (Fig. 8) e una maggiore persistenza nel tempo di
Pichia (Fig. 31). Rispetto alla prova con S. cerevisiae 10 7 cell/ml:Pichia 10 7 cell/ml,
infatti, la quantità di CO2, dopo 7 giorni di fermentazione, è circa a 2/3 nella prova
con S. cerevisiae 10 5 :Pichia 10 7 e circa 1/3 nella prova con S. cerevisiae 10 3 :Pichia
10 7 ; i lieviti del genere Pichia, ormai scomparsi dopo 10 giorni nella fermentazione
con il più alto livello di inoculo del S. cerevisiae, sono ancora presenti ad elevate
concentrazioni (∼10 6 cell/ml) nelle altre fermentazioni miste (Fig. 31). Solamente
nella fermentazione coinoculata con S. cerevisiae 10 3 cell/ml e Pichia 10 7 cell/ml si
registra comunque una minore crescita, nelle prime fasi della fermentazione, del
ceppo di Saccharomyces rispetto al controllo, ossia in coltura pura. A fronte di una
diversa cinetica fermentativa al termine della fermentazione (23 giorni) la CO2 svolta
si uniforma nelle tre tesi.
121

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 31: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di P. fermentans (4) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di
S. cerevisiae
Relativamente ai principali parametri enologici riassunti in tabella 32, non si
evidenziano differenze nel contenuto della maggior parte degli analiti nelle tesi in
coinoculo rispetto ai relativi controlli. Significativo, invece, è l’incremento nel
contenuto di polisaccaridi, che risulta inversamente proporzionale alla
concentrazione dell’inoculo di S. cerevisiae.
122

Inoculo
(cell/ml) pH
CAPITOLO 4 - RISULTATI
P .fermentans 10
Tabella 32: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Pichia fermentans (4)
7
+ S. cerevisiae 10 7 3,23 6,59±0,01 0,42±0,02 13,96±0,01 6,10±0,10 125±7
P. fermentans 10 7
+ S. cerevisiae 10 5 3,25 6,56±0,02 0,46±0,01 13,91±0,08 6,44±0,01 169±11
P. fermentans 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 3,33 6,15±0,05 0,47±0,01 13,96±0,08 6,28±0,33 216±8
Anche se in ogni prova la sommatoria complessiva dei principali composti volatili,
riportati in tabella 33, risultava del tutto analoga, si evidenzia una produzione di
acetaldeide leggermente inferiore a quella delle rispettive prove di controllo con
Saccharomyces. Il contenuto di etil acetato e propanolo, invece, è risultato
leggermente aumentato nei vini ottenuti dalle fermentazioni multistarter, inoculate
con 10 5 e 10 3 cell/ml di S. cerevisiae, rispetto a quelle con S. cerevisiae in coltura
pura. I tre livelli di inoculo di S. cerevisiae non hanno influenzato significativamente
le concentrazioni dei restanti composti.
Inoculi
(cell/ml)
P. fermentans 10 7
Acetaldeide
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Metanolo
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Propanolo
Etil acetato
Etanolo
(% v/v)
Iso Butanolo
Glicerolo
(g/l)
Amilico attivo
Isoamilico
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P. fermentans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
26,60 21,83 35,30 30,17 77,90 16,04
±1,16 ±0,44 ±0,35 ±1,32 ±6,76 ±2,01
P. fermentans 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
24,80 21,29 50,32 47,09 78,87 16,97
±2,28 ±1,28 ±4,49 ±3,13 ±8,05 ±2,62
P. fermentans 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
22,45 20,89 53,57 83,90 69,14 17,11
±1,08 ±0,65 ±3,86 ±7,39 ±1,03 ±0,36
Tabella 33: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Pichia fermentans (4)
ΔΔ+ Polisaccaridi
(mg/l)
P. fermentans 10 7 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
122,42
±11,88
101,13
±13,17
99,13
±2,12
La valutazione degli altri composti volatili (Tab. 34) evidenzia un incremento
generalizzato dell’estere acetato di isoamile nelle fermentazioni miste rispetto a
123

CAPITOLO 4 - RISULTATI
quelle di controllo con il S. cerevisiae in coltura pura. Per quanto riguarda la
produzione di 2-feniletanolo, invece, si registra una notevole riduzione rispetto alla
coltura di S. cerevisiae.
Inoculo
(cell/ml)
P. fermentans 10 7
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
Esanolo
Etil ottanoato
Etil decanoato
Feniletil acetato
2-feniletanolo
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P. fermentans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,23 0,28 0,46 0,25 0,56
±0,04 ±0,04 ±0,08 ±0,07 ±0,07
P. fermentans 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,35 0,25 0,29 0,21 0,31
±0,07 ±0,06 ±0,06 ±0,05 ±0,10
P. fermentans 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,35 0,27 0,29 0,19 0,25
±0,03 ±0,05 ±0,06 ±0,05 ±0,08
Tabella 34: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con P. fermentans (4)
4.1.9 Ceppo 9 di Pichia anomala
0,20
±0,03
0,10
±0,01
0,10
±0,02
1,28
±0,36
0,78
±0,40
0,87
±0,11
Anche quando in coltura mista con Pichia anomala, così come si è osservato nelle
prove in coltura mista con il ceppo 4 di Pichia fermentans, la cinetica fermentativa di
S. cerevisiae risulta fortemente influenzata dal diverso rapporto di inoculo. Nella
fermentazione inoculata con Saccharomyces 10 7 :Pichia 10 7 , l’elevata concentrazione
iniziale consente al lievito Saccharomyces di svolgere la fermentazione con una
cinetica simile a quella presentata in coltura pura (Fig. 8), quindi senza risultare
influenzato dal ceppo di P. anomala, presente in uguali concentrazioni iniziali di
inoculo. Concentrazioni più basse di Saccharomyces al momento dell’inoculo e
precisamente nel rapporto di 1:100 e 1:10000 rispetto a P. anomala, determinano, in
modo proporzionale, un rallentamento della fermentazione (Fig. 32). Rispetto alla
fermentazione inoculata con Saccharomyces 10 7 :Pichia 10 7 , infatti, la quantità di
CO2, dopo 7 giorni di fermentazione, è circa 1/2 nella fermentazione con
124

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Saccharomyces 10 5 :Pichia 10 7 e a circa 1/5 nella fermentazione con Saccharomyces
10 3 :Pichia 10 7 .
Figura 32: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con P. anomala (9)
Tuttavia il ceppo di P. anomala, a differenza del ceppo di P. fermentans, quando in
coltura mista con Saccharomyces, non risulta particolarmente influenzato nella
crescita mostrando, infatti, in tutte e tre le tesi un comportamento simile (Fig. 33). Il
ceppo di Saccharomyces, invece, mostra nelle prime fasi della fermentazione, una
minore crescita nel coinoculo a concentrazione di 10 3 cell/ml rispetto alla medesima
prova in coltura pura (Fig. 9). A fronte di una diversa cinetica fermentativa al
termine della fermentazione (23 giorni) la CO2 svolta si uniforma nelle tre tesi
intorno ad un livello medio di circa 40 - 45 g.
125

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 33: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di P. anomala (9) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di S.
cerevisiae
Per quanto riguarda i principali parametri enologici, riportati in tabella 35, non si
evidenziano differenze tra gli svinati delle tesi in coinoculo e di quelli provenienti da
coltura pura di S. cerevisiae. Fanno eccezione il contenuto di polisaccaridi, il cui
incremento nelle tesi coinoculate varia in maniera proporzionale al rapporto di
inoculo P. anomala/S. cerevisiae, e l’acidità volatile, che risulta più elevata nelle
fermentazioni con il S. cerevisiae coinoculato a concentrazione 10 5 10 3 cell/ml
126

CAPITOLO 4 - RISULTATI
rispetto ai relativi controlli; mentre al maggiore livello di inoculo i valori risultano
simili.
Inoculo
(cell/ml) pH
P.anomala 10 7
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo
(g/l)
Δ+ Polisaccaridi
(mg/l)
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P.anomala 10 7
+ S. cerevisiae 10 7 3,44 6,58±0,03 0,33±0,04 13,80±0,13 6,99±0,32 119±14
P.anomala 10 7
+ S. cerevisiae 10 5 3,39 6,55±0,08 0,61±0,09 13,76±0,16 6,50±0,01 140±18
P.anomala 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 3,36 7,11±0,66 0,63±0,11 13,43±0,54 6,35±0,32 203±20
Tabella 35: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Pichia anomala (9)
Dalla tabella 36 si può rilevare un notevole incremento della produzione di etil
acetato nelle tesi con coinoculo, soprattutto in quelle in cui il S. cerevisiae è stato
coinoculato a concentrazione di 10 5 e 10 3 cell/ml. Per i restanti composti non si
evidenziano differenze tra le tesi in coltura pura e quelle in coinoculo, se non un
leggero aumento del contenuto in propanolo.
Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
P.anomala 10 7 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P.anomala 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
37,18 19,98 40,53 38,26 74,51 16,59
±5,80 ±1,33 ±4,76 ±0,19 ±1,32 ±1,04
P.anomala 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
24,70 21,42 64,88 133,33 64,67 19,79
±2,07 ±0,04 ±3,74 ±15,58 ±3,63 ±1,41
P.anomala 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
28,74 34,88 76,85 552,09 83,59 23,31
±0,39 ±8,00 ±8,90 ±53,30 ±18,65 ±0,08
Tabella 36: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Pichia anomala (9)
Etil acetato
Iso Butanolo
Amilico attivo
Isoamilico
106,29
±3,14
80,26
±3,45
83,33
±6,69
Per quanto riguarda gli altri composti volatili (Tab. 37), si evidenzia un decremento
delle concentrazioni di alcuni esteri (etil ottanoato, etil decanoato e feniletil acetato)
127

CAPITOLO 4 - RISULTATI
e del 2-feniletanolo negli svinati delle fermentazioni miste rispetto ai relativi
controlli. Nella fermentazione mista condotta con coinoculo pari a 10 3 cell/ml di S.
cerevisiae, invece, aumenta solo il contenuto di esanolo. Anche l’acetato di etile
aumenta in modo generalizzato negli svinati ottenuti dalle colture miste rispetto a
quelli prodotti dal S. cerevisiae in coltura pura.
Inoculo
(cell/ml)
P.anomala 10 7
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
Esanolo
Etil ottanoato
Etil decanoato
Feniletil acetato
2-feniletanolo
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P.anomala 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,65 0,26 0,38 0,07 0,14
±0,11 ±0,03 ±0,08 ±0,01 ±0,04
P.anomala 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,44 0,23 0,39 0,09 0,10
±0,08 ±0,02 ±0,10 ±0,03 ±0,02
P.anomala 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,65 0,32 0,74 0,14 0,18
±0,14 ±0,03 ±0,18 ±0,04 ±0,07
Tabella 37: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con P. anomala (9)
4.1.10 Ceppo 89 di Zygosaccharomyces bailii
0,06
±0,01
0,07
±0,03
0,22
±0,06
8,20
±1,68
5,30
±1,04
6,98
±0,93
Le cinetiche di fermentazione delle tre diverse prove in coltura mista con Z. bailii,
pur mostrando differenze nelle due repliche, ancora una volta mettono in evidenza le
differenze tra le tre tesi con i diversi livelli di inoculo di S. cerevisiae.
In particolare, la cinetica fermentativa della fermentazione con S. cerevisiae 10 7
cell/ml:Z. bailii 10 7 cell/ml (Fig. 34) risulta simile a quella della medesima prova con
la coltura pura di Saccharomyces (Fig. 8), ma molto diversa da quella con la coltura
pura di Z. bailii (Fig. 10).
128

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 34: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con Z. bailii (89)
Ciò dimostra la dominanza dello starter Saccharomyces sul lievito Z. bailii,
testimoniato anche dal fatto che solo in questa tesi il ceppo 89 di Z. bailii mostra una
diminuzione della concentrazione cellulare dopo circa 10 giorni di fermentazione
(Fig. 35). Nelle fermentazioni con i due più bassi livelli di coinoculo di S. cerevisiae
(10 5 e 10 3 cell/ml), invece, la concentrazione iniziale di Z. bailii rimane costante fino
a fine fermentazione. Questa più bassa concentrazione di Saccharomyces al momento
dell’inoculo, rispettivamente nel rapporto di 1:100 e 1:10000 rispetto a Z. bailii,
determinano, in modo proporzionale, un rallentamento della fermentazione (Fig. 34).
La minore velocità di fermentazione nella fermentazione mista S. cerevisiae 10 5
cell/ml:Z. bailii 10 7 cell/ml non è comunque accompagnata da una minore crescita né
del ceppo di S. cerevisiae, che si mantiene tra l’altro simile alla medesima prova con
la coltura pura (Fig. 10 e 11), né del ceppo di Zygosaccharomyces, che mantiene la
sua concentrazione iniziale costante per tutto il processo fermentativo.
Al contrario, nella fermentazione coinoculata con S. cerevisiae a concentrazione di
10 3 cell/ml, il ceppo di S. cerevisiae, rispetto a quando si trova in coltura pura,
rallenta la sua crescita nelle fasi iniziali della fermentazione, raggiungendo solamente
dopo 9 giorni il massimo della sua concentrazione cellulare (Fig. 35), determinando
così anche la più bassa attività fermentativa (Fig. 34).
129

CAPITOLO 4 - RISULTATI
A fronte di una diversa cinetica fermentativa al termine della fermentazione (23
giorni) la CO2 svolta si uniforma nelle tre tesi intorno ad un livello medio di circa
40 g.
Figura 35: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di Z. bailii (89) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di S.
cerevisiae
I principali parametri enologici, riportati in tabella 38, evidenziano alcune differenze
principalmente ascrivibili al tenore di acidità totale e alla produzione di polisaccaridi
130

CAPITOLO 4 - RISULTATI
e glicerolo, che sono risultati sempre superiori rispetto ai relativi controlli in coltura
pura di Saccharomyces. Tali incrementi, inoltre, risultano sempre inversamente
proporzionali al rapporto di inoculo.
Per quanto riguarda la produzione di acidità volatile, invece, non si rilevano
differenze significative tra le tesi coinoculate ed i rispettivi controlli in coltura pura
di S. cerevisiae, nonostante Z. bailii in coltura pura mostri valori sensibilmente più
elevati. Un leggero incremento progressivo dell’acidità volatile si può notare
passando dai livelli più alti a quelli più bassi di inoculo della coltura starter di S.
cerevisiae.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo
(g/l)
ΔΔ+ Polisaccaridi
(mg/l)
Z. bailii 10 7 3,10 8,55±0,02 0,61±0,02 10,69±0,02 7,60±0,41 185±3
Z. bailii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7 3,16 7,03±0,00 0,43±0,04 13,78±0,00 6,28±0,09 113±6
Z. bailii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5 3,05 7,15±0,01 0,44±0,02 13,75±0,02 6,79±0,06 143±9
Z. bailii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 3,03 7,40±0,09 0,50±0,08 13,73±0,04 7,52±0,17 181±10
Tabella 38: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Zygosaccharomyces bailii (89)
Riguardo ai principali composti volatili (Tab. 39), si evidenzia un leggero e generale
aumento dei loro livelli, ad eccezione di acetaldeide ed alcol isoamilico, in particolar
modo nei fermentati ottenuti dalle colture miste in cui il S. cerevisiae è stato
coinoculato alle concentrazioni di 10 5 e 10 3 cell/ml.
131

Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
Etil acetato
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Z. bailii 10 7 25,41
±1,73
22,14
±0,64
36,38
±2,82
33,89
±1,75
79,22
±1,27
14,16
±0,85
110,46
±9,76
Z. bailii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
34,84 20,92 38,84 33,71 80,63 14,54 121,10
±3,52 ±0,18 ±1,80 ±0,62 ±1,80 ±0,28 ±11,36
Z. bailii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
25,10 21,38 50,77 43,22 98,80 16,33 92,01
±1,02 ±0,61 ±4,06 ±3,55 ±0,75 ±1,47 ±0,09
Z. bailii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
23,67 22,21 51,59 46,28 98,09 18,46 93,07
±1,28 ±1,03 ±3,54 ±3,87 ±2,35 ±0,58 ±1,72
Tabella 39: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Zygosaccharomyces bailii (89)
Riguardo alla produzione degli altri composti volatili (Tab. 40), i risultati indicano
una interazione positiva tra Z. bailii e S. cerevisiae quando vengono coinoculati
entrambi alla concentrazione di 10 7 cell/ml, confermato dalla maggiore produzione di
tutti gli analiti (aromatici e non) ad eccezione del 2-feniletanolo, rispetto ai livelli
riscontrati nelle colture pure con S. cerevisiae di riferimento. Nelle prove condotte
coinoculando concentrazioni più basse di S. cerevisiae (10 5 e 10 3 cell/ml), invece, si
ha una diminuzione del livello complessivo di questi composti.
Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Z. bailii 10 7 0,55
±0,10
0,29
±0,03
0,46
±0,06
0,17
±0,02
0,14
±0,02
Z. bailii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,31 0,26 0,55 0,24 0,64
±0,11 ±0,02 ±0,08 ±0,03 ±0,08
Z. bailii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,17 0,12 0,41 0,14 0,28
±0,08 ±0,02 ±0,10 ±0,03 ±0,02
Z. bailii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,14 0,09 0,68 0,10 0,21
±0,04 ±0,01 ±0,11 ±0,04 ±0,03
Tabella 40: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con Z. bailii (89)
Etil esanoato
Esanolo
Etil ottanoato
Iso Butanolo
Etil decanoato
Amilico attivo
Feniletil acetato
0,02
±0,01
0,43
±0,11
0,03
±0,01
0,05
±0,02
Isoamilico
2-feniletanolo
1,34
±0,61
1,64
±0,28
1,03
±0,24
1,86
±0,33
132

4.1.11 Ceppo 42 di Zygosaccharomyces florentinus
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Le cinetiche di fermentazione delle diverse prove di coltura mista con Z. florentinus,
ancora una volta mettono in evidenza le differenze tra le fermentazioni miste con i
diversi livelli di inoculo di S. cerevisiae. In particolare, la cinetica fermentativa del
coinoculo S. cerevisiae 10 7 cell/ml:Z. florentinus 10 7 cell/ml risulta simile a quella
della medesima prova con la coltura pura di Saccharomyces (Fig. 8), ma molto
diversa da quella con la coltura pura di Z. florentinus (Fig. 10). Ciò dimostra che,
nonostante Z. florentinus rimanga a concentrazioni elevate e simili a quelle del ceppo
starter di Saccharomyces durante tutto il processo fermentativo (Fig. 37), il ceppo di
Saccharomyces svolge un ruolo dominante nei riguardi dell’attività fermentativa.
Ancora una volta, invece, la più bassa concentrazione di Saccharomyces (10 5 e 10 3
cell/ml) al momento dell’inoculo, determina, in modo proporzionale, un
rallentamento della fermentazione (Fig. 36).
Figura 36: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con Z. florentinus (42)
Nella fermentazione inoculata con S. cerevisiae 10 5 cell/ml:Z. florentinus 10 7 cell/ml,
lo sviluppo cellulare del ceppo di S. cerevisiae (Fig. 37) risulta simile alla medesima
prova con la coltura pura (Fig. 9), così come il ceppo di Zygosaccharomyces
mantiene costante la sua concentrazione iniziale per tutto il processo fermentativo.
133

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Al contrario nella fermentazione S. cerevisiae 10 3 cell/ml:Z. florentinus 10 7 cell/ml,
il ceppo di Saccharomyces, rispetto a quando è in coltura pura, rallenta la sua crescita
nelle fasi iniziali della fermentazione, raggiungendo solamente dopo 9 giorni il
massimo della sua concentrazione cellulare (Fig. 37), determinando così anche una
più bassa attività fermentativa (Fig. 36).
Figura 37: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di Z. florentinus (42) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di
S. cerevisiae
134

CAPITOLO 4 - RISULTATI
A fronte di una diversa cinetica fermentativa al termine della fermentazione (23
giorni) la CO2 svolta si uniforma nelle tre tesi intorno ad un livello medio di circa 40-
45 g.
I principali parametri enologici riportati in tabella 41 non evidenziano in generale
differenze tra le tesi in coinoculo e quelle in coltura pura anche a bassi livelli di
inoculo del S. cerevisiae. Fanno eccezione la produzione di polisaccaridi, che sono
risultati sempre superiori in presenza del ceppo 42 di Z. florentinus, confermando
quanto prodotto in coltura pura, e la produzione di acido acetico, con una
diminuzione dell’acidità volatile nelle fermentazioni miste, a livelli analoghi a quelli
che tale ceppo di Z. florentinus ha prodotto in coltura pura (0,29 g/l).
INOCULO
(cell./ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acido acetico
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo
(g/l)
ΔΔ+ Polisaccaridi
(mg/l)
Z. florentinus 10 7 3,45 7,88±0,09 0,29±0,04 12,30±0,07 6,51±0,32 175±16
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 7 3,44 6,43±0,03 0,33±0,07 13,83±0,13 6,54±0,28 113±15
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 5 3,33 6,57±0,05 0,28±0,02 13,76±0,16 6,50±0,19 168±1
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 3,31 7,02±0,05 0,29±0,00 13,53±0,54 6,54±0,04 195±22
Tabella 41: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Zygosaccharomyces florentinus
(42)
Relativamente ai principali composti volatili (Tab. 42), nelle fermentazioni miste
coinoculate con 10 5 e 10 3 cell/ml di S. cerevisiae, si evidenzia un aumento del
propanolo e dell’alcol amilico attivo e una riduzione dell’isobutanolo, rispetto ai
livelli riscontrati nelle colture pure di S. cerevisiae di riferimento.
135

Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
Etil acetato
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Z. florentinus 10 7 41,53
±5,22
19,84
±1,12
106,33
±9,23
35,05
±2,88
26,86
±2,54
21,39
±2,78
91,07
±5,46
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
34,61 21,22 45,03 31,61 83,96 17,35 113,40
±4,30 ±1,05 ±6,38 ±1,57 ±1,02 ±0,23 ±4,62
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
28,26 22,02 66,48 36,22 59,84 24,78 98,88
±1,55 ±1,87 ±2,39 ±3,75 ±6,43 ±3,55 ±2,80
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
30,91 24,58 97,02 38,07 33,05 21,33 92,19
±0,92 ±3,27 ±10,92 ±2,20 ±1,21 ±1,25 ±6,71
Tabella 42: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Zygosaccharomyces florentinus
(42)
Per quanto riguarda la formazione degli altri composti volatili (Tab. 43), si nota nelle
fermentazioni miste un sensibile incremento della produzione di esteri acetati
(acetato di isoamile e feniletil acetato), esanolo e 2-feniletanolo, mentre diminuisce
la concentrazione dell’etil ottanoato e dell’etil decanoato, rispetto alle fermentazioni
condotte con il S. cerevisiae in coltura pura.
Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Z. florentinus 10 7 0,71
±0,11
0,27
±0,03
2,87
±0,48
0,27
±0,03
0,40
±0,06
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,16 0,37 1,41 0,11 0,10
±0,01 ±0,06 ±0,12 ±0,03 ±0,02
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,33 0,33 2,43 0,08 0,18
±0,07 ±0,08 ±0,22 ±0,01 ±0,01
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,38 0,29 2,15 0,05 0,19
±0,06 ±0,07 ±0,64 ±0,01 ±0,05
Tabella 43: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con Z. florentinus (42)
Etil esanoato
Esanolo
Etil ottanoato
Iso Butanolo
Etil decanoato
Amilico attivo
Feniletil acetato
1,67
±0,43
0,41
±0,07
0,60
±0,11
0,63
±0,04
Isoamilico
2-feniletanolo
8,65
±1,02
25,65
±2,65
34,28
±2,74
39,39
±3,19
136

4.1.12 Ceppo 62 e 64 di Saccharomycodes ludwigii
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Nelle prove coinoculate con le diverse concentrazioni di S. cerevisiae e il ceppo 62 di
Saccharomycodes ludwigii non si osservano grandi differenze nella cinetica di
fermentazione (Fig. 38), come invece si è potuto osservare per la gran parte degli
altri ceppi di non-Saccharomyces saggiati. L’andamento fermentativo del ceppo 62
di S. ludwigii in coltura pura (Fig. 10) è risultato d’altra parte simile a quello
mostrato in coltura mista ai tre livelli di inoculo (Fig. 38).
Figura 38: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con S. ludwigii (62)
Il ruolo dominante del ceppo 62 di S. ludwigii in queste fermentazioni è testimoniato
anche dal fatto che il ceppo di S. cerevisiae risulta in qualche modo rallentato nel suo
sviluppo quando inoculato in concentrazioni più basse (10 5 e 10 3 cell/ml). In
particolare nel coinoculo alla concentrazione di 10 3 cell/ml (Fig. 39), il ceppo di S.
cerevisiae non riesce a raggiungere, neanche a fine fermentazione, le stesse
concentrazioni cellulari della fermentazione al più alto livello di inoculo, come
invece è accaduto in tutte le altre fermentazioni coinoculate con gli altri ceppi di
lieviti non-Saccharomyces. Pur con leggere differenze tra le repliche, nelle
fermentazioni miste coinoculate con 10 5 e 10 3 cell/ml di S. cerevisiae il livello di
137

CAPITOLO 4 - RISULTATI
CO2 svolta è mediamente più basso di circa 5 g rispetto alla fermentazione
coinoculata con 10 7 cell/ml di S. cerevisiae (Fig. 38).
Figura 39: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di S. ludwigii (62) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di S.
cerevisiae
Per quanto concerne i principali parametri enologici mostrati in tabella 44, non si
rilevano particolari differenze tra i fermentati delle colture miste e quelli dei relativi
controlli in coltura pura. In tutte le fermentazioni miste, tuttavia, si osserva un
138

CAPITOLO 4 - RISULTATI
leggero aumento della produzione di glicerina e un notevole incremento della
produzione di polisaccaridi, che è risultato 2-3 volte superiore rispetto alle relative
prove di controllo con S. cerevisiae in coltura pura.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo
(g/l)
Δ+ Polisaccaridi
(mg/l)
S. ludwigii 10 7 3,26 7,05±0,01 0,50±0,07 12,99±0,05 8,02±0,30 245±5
S. ludwigii 10 7
7 3,21
+ S. cerevisiae 10
6,90±0,01 0,47±0,04 13,66±0,07 6,94±0,26 212±12
S. ludwigii 10 7
5 3,21
+ S. cerevisiae 10
7,15±0,02 0,46±0,03 13,60±0,01 7,23±0,20 242±15
S. ludwigii 10 7
3 3,27
+ S. cerevisiae 10
6,31±0,04 0,47±0,04 13,58±0,05 7,55±0,05 263±18
Tabella 44: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Saccharomycodes ludwigii (62)
Dalla tabella 45 relativa ai principali composti volatili, si può rilevare un incremento
della produzione di acetato di etile in linea con quello della coltura pura di S.
ludwigii. Per i restanti composti, invece, non si possono evidenziare differenze tra le
fermentazioni in coltura pura di Saccharomyces e quelle in coinoculo.
Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
S. ludwigii 10 7 43,61
±4,13
22,55
±0,23
23,66
±1,98
156,51
±14,86
53,87
±2,21
27,39
±1,53
83,89
±4,33
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
48,33 22,13 35,99 95,84 102,44 31,52 129,21
±4,46 ±0,15 ±2,10 ±6,53 ±4,13 ±2,26 ±7,43
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
43,88 22,54 25,62 137,03 81,41 33,55 107,59
±3,00 ±0,35 ±1,18 ±1,47 ±4,21 ±2,55 ±1,20
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
44,57 23,67 27,11 152,72 83,39 35,06 110,22
±0,72 ±0,17 ±2,98 ±3,00 ±9,27 ±1,74 ±6,43
Tabella 45: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Saccharomycodes ludwigii (62)
Per quanto attiene alla presenza degli altri composti volatili (Tab. 46), in tutte le
prove in coinoculo, rispetto ai relativi controlli, si evidenzia un generalizzato
Etil acetato
Iso Butanolo
Amilico attivo
Isoamilico
139

CAPITOLO 4 - RISULTATI
decremento delle concentrazioni degli analiti, in linea con le concentrazioni relative
alle fermentazioni in coltura pura di S. ludwigii e di S. cerevisiae. In particolare, tale
diminuzione si osserva essenzialmente in relazione al gruppo degli esteri etilici e del
feniletil acetato.
Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
S. ludwigii 10 7 0,51
±0,11
0,24
±0,03
0,40
±0,08
0,27
±0,03
0,15
±0,03
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,18 0,09 0,37 0,05 0,16
±0,01 ±0,02 ±0,05 ±0,02 ±0,02
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,23 0,06 0,33 0,03 0,14
±0,05 ±0,01 ±0,02 ±0,01 ±0,01
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,34 0,10 1,83 0,05 0,42
±0,06 ±0,03 ±0,26 ±0,01 ±0,08
Tabella 46: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con S. ludwigii (62)
Etil esanoato
Esanolo
Etil ottanoato
Etil decanoato
Feniletil acetato
0,08
±0,03
0,05
±0,02
0,04
±0,01
0,09
±0,04
2-feniletanolo
7,76
±0,82
12,65
±1,25
7,69
±1,14
13,71
±1,39
Contrariamente a quanto osservato con il ceppo 62 di S. ludwigii, tra le fermentazioni
coinoculate con il ceppo 64 sono state registrate grandi differenze nelle velocità di
fermentazione. La velocità fermentativa in coltura pura del ceppo S. ludwigii 64 è
risultata molto più bassa non solo rispetto a quella del ceppo 62 (Fig. 10), ma anche
rispetto a quella mostrata in coltura mista ai tre livelli di inoculo (Fig. 40).
140

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 40: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con S. ludwigii (64)
La cinetica di fermentazione della coltura pura di S. ludwigii è risultata molto simile
a quella della coltura mista S. cerevisiae 10 3 cell/ml:S. ludwigii 10 7 cell/ml, tale da
far supporre, anche in questo caso, che il ceppo di S. cerevisiae risulti in qualche
modo inibito da S. ludwigii, come confermato d’altra parte ancora una volta dalla più
bassa velocità di crescita registrata sempre nella stessa replica (Fig. 41). Anche in
questo caso, come nella corrispondente fermentazione mista con il ceppo 62 di S.
ludwigii, il ceppo di S. cerevisiae non riesce a raggiungere, neanche a fine
fermentazione, le stesse concentrazioni cellulari della fermentazione S. cerevisiae 10 7
cell/ml:S. ludwigii 10 7 cell/ml; diversamente da quanto è accaduto in tutte le altre
fermentazioni coinoculate con gli altri ceppi di lieviti non-Saccharomyces. Pur
tenendo conto delle differenze tra le repliche, il livello di CO2 svolta nella
fermentazione mista con il S. cerevisiae coinoculato a concentrazione di 10 3 cell/ml è
risultato mediamente più basso di circa 10 g rispetto a quella prodotta nella
fermentazione con il più alto livello di coinoculo.
141

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 41: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di S. ludwigii (64) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di S.
cerevisiae
Relativamente ai principali parametri enologici (Tab. 47), si rileva la tendenza ad una
leggera riduzione nel tenore alcolico nei vini delle prove con rapporto di inoculo S.
ludwigii / S. cerevisiae più elevato. In tutte le fermentazioni miste si osserva un
moderato aumento di glicerolo e un notevole incremento di polisaccaridi, che è
risultato 2-3 volte superiore rispetto alle relative prove di controllo con S. cerevisiae
in coltura pura.
142

CAPITOLO 4 - RISULTATI
La produzione di acidità volatile nelle prove in coinoculo, invece, è risultata inferiore
a quelle delle rispettive prove condotte in coltura pura dal ceppo di S. cerevisiae.
INOCULO
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo
(g/l)
Δ+ Polisaccaridi
(mg/l)
S. ludwigii 10 7 3,55 6,90±0,08 0,23±0,05 10,26±0,09 8,46±0,52 260±30
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7 3,35 6,64±0,16 0,31±0,00 13,70±0,04 7,68±0,31 201±22
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5 3,43 6,77±0,24 0,30±0,05 12,82±0,69 8,22±0,67 270±27
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 3,52 6,83±0,32 0,32±0,01 11,88±0,22 8,78±0,09 335±27
Tabella 47: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Saccharomycodes ludwigii (64)
L’analisi dei principali composti volatili (Tab. 48) ha evidenziato un notevole
incremento nella produzione di etil acetato nelle fermentazioni miste coinoculate con
S. cerevisiae alle concentrazioni di 10 5 e 10 3 cell/ml e un moderato incremento degli
alcoli amilici in tutte e tre le tesi rispetto ai relativi controlli in coltura pura.
Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
S. ludwigii 10 7 23,54
±4,58
21,09
±1,23
33,48
±6,91
503,98
±89,22
53,38
±3,21
28,74
±1,55
123,59
±7,13
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
29,05 20,69 37,94 99,05 89,24 23,31 126,27
±6,15 ±1,20 ±7,25 ±23,05 ±2,72 ±5,16 ±8,48
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
38,50 21,25 32,15 200,24 71,20 27,62 116,60
±8,63 ±0,07 ±7,03 ±48,24 ±3,57 ±4,10 ±7,24
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
36,45 21,81 20,79 322,94 63,54 34,92 133,81
±7,83 ±2,19 ±3,01 ±45,26 ±5,37 ±3,83 ±8,73
Tabella 48: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Saccharomycodes ludwigii (64)
Riguardo alla produzione degli altri composti volatili (Tab. 49), in tutte le prove di
fermentazione in coinoculo si ha una diminuzione di etil decanoato e feniletil acetato,
e un incremento nei livelli di acetato di isoamile (più marcato alle concentrazioni di
Etil acetato
Iso Butanolo
Amilico attivo
Isoamilico
143

CAPITOLO 4 - RISULTATI
10 7 e 10 5 cell/ml di S. cerevisiae), di esanolo e di 2-feniletanolo rispetto all’inoculo
in coltura pura di Saccharomyces.
Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
S. ludwigii 10 7 0,25
±0,05
0,04
±0,01
0,33
±0,05
0,01
±0,00
0,04
±0,01
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,59 0,29 1,31 0,12 0,18
±0,09 ±0,05 ±0,24 ±0,02 ±0,04
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
0,75 0,36 1,33 0,12 0,16
±0,05 ±0,06 ±0,16 ±0,03 ±0,06
S. ludwigii 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
0,29 0,19 1,16 0,06 0,10
±0,06 ±0,06 ±0,23 ±0,01 ±0,01
Tabella 49: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con S. ludwigii (64)
Esanolo
Etil ottanoato
4.1.13 Ceppo 95 di Schizosaccharomyces pombe
Etil decanoato
Feniletil acetato
0,02
±0,01
0,11
±0,02
0,11
±0,02
0,07
±0,01
2-feniletanolo
9,33
±1,39
33,08
±2,99
35,58
±6,74
35,23
±3,02
Da un confronto della cinetica fermentativa di Saccharomyces cerevisiae in coltura
pura (Fig. 8) e quella in coltura mista con Schizosaccharomyces pombe (Fig. 42), si
può notare ancora una volta come essa sia fortemente influenzata dal diverso
rapporto di inoculo. Nella fermentazione mista con S. cerevisiae 10 7 cell/ml:S.
pombe 10 7 cell/ml, l’elevata concentrazione iniziale consente al lievito
Saccharomyces di svolgere la fermentazione con una cinetica simile a quella
presentata in coltura pura, quindi senza risultare influenzato dal lievito S. pombe
presente in uguali concentrazioni iniziali di inoculo. Concentrazioni più basse di
Saccharomyces al momento dell’inoculo e precisamente nel rapporto di 1:100 e
1:10000 rispetto a S. pombe, determinano, in modo proporzionale, un rallentamento
della fermentazione maggiore di quello osservato nella coltura pura di S. cerevisiae
rispettivamente sempre nelle tre concentrazioni di inoculo. Rispetto alla
fermentazione al più alto livello di coinoculo di S. cerevisiae, infatti, la quantità di
CO2, dopo 10 giorni di fermentazione, è circa 3/4 nella fermentazione mista con S.
cerevisiae 10 5 cell/ml:S. pombe 10 7 cell/ml e circa 1/2 nella fermentazione mista con
S. cerevisiae 10 3 cell/ml:S. pombe 10 7 cell/ml.
144

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 42: andamento fermentativo delle fermentazioni coinoculate con S. pombe (95)
Il ceppo di S. cerevisiae comunque non risulta particolarmente influenzato dalla
presenza di S. pombe nella crescita, mostrando infatti in tutte e tre le tesi un
comportamento simile a quello osservato in coltura pura (Fig. 43). Fa eccezione la
fermentazione mista S. cerevisiae 10 3 cell/ml:S. pombe 10 7 cell/ml, in cui il ceppo di
S. cerevisiae mostra una crescita più lenta durante i primi 7 giorni di fermentazione
rispetto alla medesima prova in coltura pura, determinando al termine della
fermentazione (23 giorni) una produzione di CO2 mediamente più bassa di circa 10 g
rispetto alla fermentazione mista con S. cerevisiae 10 7 cell/ml:S. pombe 10 7 cell/ml.
145

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 43: evoluzione della popolazione microbica vitale nelle diverse fermentazioni coinoculate
con 10 7 cell/ml di S. pombe (95) e rispettivamente con 10 7 cell/ml, 10 5 cell/ml e 10 3 cell/ml di S.
cerevisiae
Dall’analisi dei principali parametri enologici (Tab. 50), si evidenzia che il ceppo 95
mostra una buona attività disacidificante, come si può evincere dai dati del pH e
dell’acidità totale della coltura pura, influenzando, di riflesso, anche il profilo acidico
delle prove coinoculate con S. cerevisiae. Le produzioni di etanolo non sono
significativamente differenti. L’elevato incremento nel livello di polisaccaridi nei
fermentati con S. pombe, si accompagna, in tutte le fermentazioni coinoculate, ad un
altrettanto significativo incremento del tenore di glicerolo, in modo inversamente
146

CAPITOLO 4 - RISULTATI
proporzionale all’inoculo di S. cerevisiae. Tali concentrazioni sono in linea con le
produzioni di S. pombe in coltura pura.
I valori di acidità volatile in tutte le prove multi starter sono risultati inferiori a quelli
dei rispettivi controlli in coltura pura dal ceppo di S. cerevisiae.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Etanolo
(% v/v)
Glicerolo
(g/l)
Δ+ Polisaccaridi
(mg/l)
S. pombe 10 7 3,47 5,03±0,12 0,43±0,02 12,24±0,11 11,36±1,75 1211±103
S. pombe 10 7
+ S. cerevisiae 10 7 3,49 4,74±0,16 0,38±0,06 13,80±0,17 8,66±1,55 482±38
S. pombe 10 7
+ S. cerevisiae 10 5 3,49 4,70±0,35 0,37±0,05 13,75±0,23 12,15±2,86 1146±96
S. pombe 10 7
+ S. cerevisiae 10 3 3,41 5,30±0,25 0,38±0,05 13,34±0,19 13,17±1,92 1424±153
Tabella 50: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Schizosaccharomyces pombe
(95)
L’analisi dei principali composti volatili (Tab. 51) evidenzia un notevole incremento
nelle fermentazioni miste dell’acetato di etile, dell’isobutanolo e degli alcoli amilici,
rispetto alle colture pure di S. cerevisiae di controllo.
Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
S. pombe 10
Tabella 51: principali composti volatili (mg/l) dei fermentati con Schizosaccharomyces pombe
(95)
7 28,75
±4,65
32,34
±1,65
31,01
±4,36
45,60
±9,33
80,86
±15,63
15,98
±5,83
124,64
±24,33
S. pombe 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
39,21 22,46 28,12 102,86 117,59 37,55 236,39
±10,72 ±0,63 ±1,93 ±25,77 ±21,70 ±13,05 ±66,43
S. pombe 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
32,20 22,45 23,94 132,58 139,11 39,17 267,35
±3,63 ±1,46 ±6,09 ±35,67 ±26,71 ±13,48 ±58,36
S. pombe 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
25,65 20,60 23,90 135,10 142,10 37,65 271,32
±2,85 ±0,50 ±6,32 ±37,64 ±27,12 ±12,48 ±62,45
Etil acetato
Iso Butanolo
Amilico attivo
Isoamilico
147

CAPITOLO 4 - RISULTATI
In tutte le prove di coinoculo con S. pombe, il contenuto complessivo degli altri
composti volatili negli svinati (Tab. 52) aumenta significativamente rispetto ai
relativi controlli in coltura pura, ad eccezione del 2-feniletanolo. L’interazione
positiva è particolarmente evidente nella prova in cui S. pombe e S. cerevisiae sono
entrambi coinoculati alla concentrazione di 10 7 cell/ml. Nelle prove di fermentazione
mista in cui il S. cerevisiae è stato coinoculato a rapporti più bassi (10 5 e 10 3 cell/ml),
aumenta sensibilmente solo la concentrazione di acetato di isoamile e di etil
esanoato, complessivamente considerati.
Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
S. pombe 10 7 1,07
±0,35
0,34
±0,04
0,52
±0,14
0,01
±0,01
0,12
±0,01
S. pombe 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
1,74 0,60 0,55 0,13 0,55
±0,49 ±0,15 ±0,13 ±0,02 ±0,09
S. pombe 10 7
+ S. cerevisiae 10 5
1,08 0,33 0,35 0,06 0,25
±0,25 ±0,06 ±0,16 ±0,03 ±0,06
S. pombe 10 7
+ S. cerevisiae 10 3
1,86 0,46 0,53 0,02 0,12
±0,31 ±0,12 ±0,20 ±0,01 ±0,01
Tabella 52: altri composti volatili (mg/l) dei fermentati con S. pombe (95)
Appendice: pubblicazioni scientifiche correlate
Esanolo
Etil ottanoato
Etil decanoato
Feniletil acetato
0,20
±0,03
0,62
±0,12
0,15
±0,02
0,25
±0,03
2-feniletanolo
2,01
±0,30
3,29
±0,69
1,76
±0,54
2,15
±1,08
Domizio P, Romani C, Lencioni L, Comitini F, Gobbi M, Mannazzu I, Ciani M (2011) Outlining
a future for non-Saccharomyces yeast: selection of putative spoilage wine strains to be used in
association with Saccharomyces cerevisiae for grape juice fermentation. Int J Food Microbiol 147:
170–180.
Comitini F, Gobbi M, Domizio P, Romani C, Lencioni L, Mannazzu I, Ciani M (2011) Selected
non-Saccharomyces wine yeast in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces
cerevisiae. Food Microbiol 28: 873-882.
Domizio P, Romani C, Comitini F, Gobbi M, Lencioni L, Mannazzu I, Ciani M (2010) Potential
spoilage non-Saccharomyces yeasts in mixed cultures with Saccharomyces cerevisiae. Ann Microbiol,
Vol 61, Number 1,137-144.
Romani C, Domizio P, Lencioni L, Gobbi M, Comitini F, Ciani, Mannazzu I M (2010)
Polysaccharides and glycerol production by non-Saccharomyces in mixed fermentation. Quad Vitic
Enol Univ To, 31, 185- 189.
148

CAPITOLO 4 - RISULTATI
4.2 Valutazione in microfermentazioni miste su scala di laboratorio
delle modalità di inoculo (coinoculo e sequenziale) dei due ceppi
selezionati di lieviti non-Saccharomyces
4.2.1 Ceppo 42 di Zygosaccharomyces florentinus e S. cerevisiae
Nella figura 44 sono riportate le cinetiche di fermentazione dei ceppi Z. florentinus
(42) e S. cerevisiae (EC1118) in purezza, in coinoculo ed in condizioni di inoculo
sequenziale. L’attività fermentativa risulta rallentata sia nelle prove condotte con
inoculo sequenziale, a 24h e a 48h, sia in quelle condotte in purezza con il ceppo 42
di Z. florentinus rispetto a quelle condotte in coinoculo (Z. florentinus + S.
cerevisiae) e con S. cerevisiae (EC1118) in coltura pura; queste ultime tra loro non
hanno invece evidenziato differenze. Comunque si può rilevare una riduzione della
velocità di fermentazione in tutte le prove solo a partire dal 7°-8° giorno di
fermentazione. La minore produzione di CO2, nelle prove condotte da Z. florentinus,
indica il più basso potere fermentativo di questo lievito rispetto a S. cerevisiae.
Figura 44: cinetiche di fermentazione di Z. florentinus e S. cerevisiae in coltura pura e in coltura
mista
149

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 45: cinetiche di crescita di Z. florentinus e S. cerevisiae in coltura pura e in coltura mista
150

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Per quanto riguarda l’influenza del ceppo Z. florentinus (42) sull’evoluzione della
crescita cellulare dello starter S. cerevisiae (EC1118) (Fig. 45), si può osservare che
in tutte e tre le tesi con inoculo misto, il ceppo di S. cerevisiae ha un andamento
evolutivo del tutto simile a quello esibito in coltura pura. Il ceppo di S. cerevisiae, al
contrario, esercita un rilevante effetto negativo sulla coltura di Z. florentinus; questo
lievito, infatti, riduce notevolmente la sua persistenza durante la fermentazione mista,
passando dai 18 giorni della coltura pura ai 10 giorni in coinoculo ed ai 15 giorni in
coltura sequenziale (24 e 48h).
Relativamente al consumo di azoto prontamente assimilabile (APA) nelle figure 46 e
47 sono riportati rispettivamente i contenuti di azoto aminoacidico prontamente
assimilabile (α-aminico) e di ammonio durante le microfermentazioni condotte con i
ceppi Z. florentinus (42) e S. cerevisiae (EC1118) sia in purezza che in coltura mista.
Rispetto alla fermentazione condotta in purezza con il ceppo Z. florentinus (42), si
può osservare un maggiore utilizzo dell’azoto (α-aminico) rispetto a quella condotta
con S. cerevisiae in coltura pura, mentre nelle fermentazioni miste, coinoculo e
inoculo sequenziale a 24h e 48h, il consumo è risultato intermedio e via via
crescente in funzione della presenza e dell’attività del ceppo di S. cerevisiae. Il
consumo di ammonio segue lo stesso andamento dell’azoto aminoacidico
prontamente assimilabile. Tali risultati dimostrano che il ceppo di Z. florentinus è
meno esigente nei riguardi dell’azoto e che nelle colture miste con S. cerevisiae a
parità di zuccheri consumati ed etanolo prodotto determina un minor consumo di
azoto assimilabile. Ciò farebbe presupporre una maggiore facilità a portare a termine
il processo fermentativo di mosti poveri di azoto assimilabile dove il suo contenuto
risulta il fattore limitante dellla fermentazione.
151

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 46: consumo degli aminoacidi prontamente assimilabili nelle fermentazioni con S.
cerevisiae e Z. florentinus in coltura pura e in coltura mista
Figura 47: consumo dell’ammonio nelle fermentazioni con S. cerevisiae e Z. florentinus in
coltura pura e in coltura mista
Dalla tabella 53, dove sono riportati i principali parametri enologici registrati negli
svinati, a parte un maggiore residuo zuccherino nella colture miste con inoculo
sequenziale (soprattutto a 24h), il Saccharomyces in coltura pura e la fermentazione
mista in coinoculo non mostrano differenze significative. Il residuo zuccherino
152

CAPITOLO 4 - RISULTATI
significativamente minore è stato fatto registrare dalla prova in coinoculo, che mostra
quindi una migliore efficienza fermentativa. Gli svinati delle prove con inoculo misto
sequenziale sono caratterizzati da un pH più basso e, parallelamente, da un valore di
acidità più elevato. Nelle prove in coinoculo si osserva, invece, una situazione più
simile a quella dei fermentati con S. cerevisiae in coltura pura. Dai valori di acidità
volatile riscontrati si può rilevare che, rispetto alla fermentazione in purezza con S.
cerevisiae, questo parametro tende a diminuire significativamente nelle prove in
coinoculo Z. florentinus + S. cerevisiae, mentre in quelle con inoculo sequenziale
non si evidenzia variazioni significative. Non si osserva alcuna variazione
significativa nella produzione di acido lattico tra le diverse prove. Si osserva, invece,
una leggera riduzione nel contenuto di glicerolo, specialmente nelle prove in
coinoculo e con inoculo sequenziale a 24h. Riguardo alla presenza di mannoproteine
si osserva che, rispetto ai fermentati delle prove in purezza con S. cerevisiae, gli
svinati derivati dalle fermentazioni miste hanno un tenore di polisaccaridi
significamente più alto e questo è particolarmente evidente nelle prove con inoculi
sequenziali.
Inoculo
(cell/ml) pH
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 (24h)
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 (48h)
Z. florentinus 10 7
3,57±
0,02 b
3,40±
0,03 a
3,42±
0,04 a
3,43±
0,03 a
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
6,73±
0,16 a
7,65±
0,15 b
7,88±
0,63 b
6,64±
0,14 a
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
0,32±
0,04 a
0,43±
0,04 b
0,42±
0,08 b
0,29±
0,03 a
con inoculi misti non si osservano variazioni significative nella produzione di
153
Acido lattico (g/l)
0,21±
0,05 a
0,18±
0,06 a
0,24±
0,10 a
0,27±
0,11 a
Etanolo (% v/v)
12,68±
0,08 b
12,47±
0,15 b
12,53±
0,20 b
8,40±
0,16 a
Zuccheri
residui (g/l)
3,30±
0,05 a
19,50±
0,11 b
12,30±
0,12 ab
87,50±
1,02 c
Glicerolo (g/l)
5,95±
0,12 ab
6,32±
0,25 ab
6,88±
0,23 b
5,39±
0,09 a
ΔΔ+ Polisaccaridi
(mg/l)
135,2±
3,5 ab
157,3±
2,9 b
156,1±
2,6 b
118,6±
S. cerevisiae 10 6 3,53±
0,07 ab
7,26±
0,35 ab
0,44±
0,05 b
0,16±
0,05 a
13,04±
0,29 b
5,93±
0,18 a
7,04±
0,48 b
100,3±
4,3 a
Tabella 53: principali caratteri enologici negli svinati ottenuti dalle fermentazioni con S.
cerevisiae e Z. florentinus in coltura pura e in coltura mista
Passando a considerare i composti volatili riportati in tabella 54, in tutti i fermentati
1,5 ab

CAPITOLO 4 - RISULTATI
acetaldeide ed alcol amilico attivo, rispetto alla fermentazione con S. cerevisiae in
coltura pura. Si ha, invece, una significativa riduzione nel contenuto di etil acetato e
isobutanolo in tutte le prove, e di alcol isoamilico nelle fermentazioni con inoculo
sequenziale. Una situazione controversa e statisticamente eterogenea tra le diverse
prove si presenta per quanto riguarda il metanolo ed il propanolo.
Inoculo
(cell/ml)
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 (24h)
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 (48h)
Z. florentinus 10 7
Acetaldeide
14,68±
5,06 a
15,88±
5,31 a
15,69±
4,71 a
16,18±
5,01 a
Metanolo
26,27±
2,22 b
20,60±
3,01 a
23,80±
2,01 ab
23,54±
2,67 ab
Propanolo
20,40±
2,11 a
34,09±
4,15 ab
52,79±
13,26 b
28,66±
1,96 ab
Etil acetato
8,85±
4,32 a
7,15±
5,12 a
10,67±
4,81 a
12,09±
2,61 a
Isobutanolo
44,68±
9,81 a
22,95±
1,85 a
31,40±
5,85 a
17,50±
1,26 a
Amilico attivo
33,18±
2,75 a
36,97±
1,69 a
35,32±
7,23 a
36,85±
3,36 a
Isoamilico
126,74±
6,77 b
105,95±
6,47 ab
98,96±
9,84 ab
57,82±
2,34 a
S. cerevisiae 10 6 18,42±
3,37 a
19,15±
2,18 a
27,44±
10,09 ab
19,58±
3,13 b
108,66±
8,33 b
24,02±
3,01 a
171,11±
4,32 b
Tabella 54: composti volatili (mg/l) negli svinati ottenuti dalle fermentazioni con S. cerevisiae e
Z. florentinus in coltura pura e in coltura mista
Riguardo agli altri composti volatili (Tab. 55), si osserva, rispetto ai vini relativi alla
fermentazione con inoculo del solo S. cerevisiae, un sensibile incremento del 2-
feniletanolo, soprattutto negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste in coinoculo.
Anche il contenuto di feniletil acetato e di esanolo è risultato significamene maggiore
negli svinati derivati dalle prove con inoculo misto, e da quelle con la sola coltura di
Z. florentinus. In tutti i fermentati ottenuti dalle prove con inoculo misto, al contrario,
si osserva una significativa riduzione di acetato di isoamile, etil esanoato ed etil
ottanoato, soprattutto nelle prove con inoculo sequenziale.
154

Inoculo
(cell/ml)
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 (24h)
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 (48h)
Z. florentinus 10 7
Acetato di
isoamile
0,46±
0,01 b
0,19±
0,03 ab
0,27±
0,10 ab
0,01±
0,01 a
Etil esanoato
0,36±
0,04 b
0,18±
0,02 ab
0,22±
0,03 ab
0,03±
0,00 a
Esanolo
1,15±
0,10 ab
1,19±
0,11 ab
1,07±
0,08 ab
1,55±
0,04 b
Etil ottanoato
0,16±
0,05 ab
0,03±
0,01 a
0,03±
0,01 a
0,00±
0,00 a
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Etil decanoato
0,15±
0,02 a
0,11±
0,02 a
0,14±
0,07 a
0,72±
0,07 b
Feniletil acetato
0,54±
0,10 b
0,77±
0,23 b
0,98±
0,43 b
0,78±
0,10 b
2-feniletanolo
39,97±
0,92 b
32,07±
1,83 ab
32,30±
1,84 ab
23,53±
2,80 a
S. cerevisiae 10 6 0,77±
0,19 c
0,44±
0,09 c
0,90±
0,05 a
0,44±
0,05 b
0,10±
0,05 a
0,11±
0,02 a
22,23±
1,70 a
Tabella 55: altri composti volatili (mg/l) negli svinati ottenuti dalle fermentazioni con S.
cerevisiae e Z. florentinus in coltura pura e in coltura mista
4.2.2 Ceppo 101 di Lachancea thermotolerans e S. cerevisiae
Dalla figura 48, in cui sono riportati gli andamenti fermentativi delle
microfermentazioni condotte con il ceppo L. thermotolerans (101) e il ceppo S.
cerevisiae (EC1118) in purezza, in coinoculo ed in inoculo sequenziale, si può
rilevare in tutte le prove una riduzione della velocità di fermentazione solo a partire
dal 7° giorno. Nelle prove con le colture miste L. thermotolerans + S. cerevisiae
(coinoculo, inoculo sequenziale a 24h e a 48h) la CO2 svolta a fine processo è
risultata comparabile a quella della coltura pura di S. cerevisiae mentre, come atteso,
la fermentazione condotta in purezza da L. thermotolerans ha mostrato una più bassa
quantità finale di CO2.
155

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 48: cinetiche di fermentazione di L. thermotolerans e S. cerevisiae in coltura pura e in
coltura mista
Nella figura 49 è riportata l’evoluzione della crescita microbica del ceppo L.
thermotolerans (101) e del S. cerevisiae EC1118 in coltura pura e nelle diverse
combinazioni di inoculo. Il ceppo 101 di L. thermotolerans in coltura pura ha avuto
un comportamento del tutto simile a quello di S. cerevisiae mentre, in coltura mista,
ha evidenziato una certa competitività nei confronti dello starter saccaromicetico.
Infatti, nelle prove in coinoculo il ceppo 101 di L. thermotolerans ha determinato una
riduzione della crescita di S. cerevisiae di un ordine logaritmico mentre, nelle prove
sequenziali sia a 24h che a 48h, la presenza del ceppo di L. thermotolerans (101) non
ha addirittura consentito alcun incremento di biomassa del ceppo di S. cerevisiae, la
cui concentrazione si è mantenuta nell’ordine di 10 6 cell/ml per tutta la
fermentazione.
156

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 49: cinetiche di crescita di L. thermotolerans e S. cerevisiae in coltura pura e in coltura
mista
157

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Nella tabella 56 sono riportati i principali parametri enologici negli svinati, dopo 22
giorni di fermentazione, delle prove condotte con L. thermotolerans (101) e S.
cerevisiae (EC1118) in purezza, in coinoculo e con inoculo sequenziale. I dati
evidenziano una significativa ed eterogenea difficoltà nel completamento della
fermentazione sia nella prova con L. thermolerans in coltura pura sia nelle prove
miste rispetto al controllo, evidenziata dal più basso tenore alcolico nei relativi
fermentati. Dal quadro acidico si evince che, nei fermentati con inoculi misti,
l’acidità totale è risultata comparabile a quella dei fermentati con la coltura pura di L.
thermotolerans e significativamente superiore rispetto al controllo. Nelle prove con
inoculo sequenziale l’acidità volatile tende a diminuire significativamente rispetto
alle prove in coinoculo, ma soprattutto rispetto al controllo. L’acido lattico, inoltre,
aumenta significativamente in tutti i vini ottenuti dalle fermentazioni miste, in
particolare in quello a 48 ore, in linea con le alte produzioni di questo composto da
parte del ceppo di Lachancea in coltura pura. Nei fermentati prodotti con inoculo
sequenziale si può osservare anche un aumento significativo nella produzione di
glicerolo. Riguardo al contenuto di mannoproteine, si osserva che gli svinati delle
fermentazioni miste presentano concentrazioni sensibilmente più alte rispetto agli
svinati delle fermentazioni in purezza con S. cerevisiae; ciò è particolarmente
evidente nella fermentazione con inoculo sequenziale a 24h.
Inoculo
(cell/ml) pH
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 (24h)
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 (48h)
L. thermotolerans 10 7
3,56±
0,05 b
3,57±
0,02 b
3,53±
0,03 b
3,40±
0,03 a
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
9,20±
0,36 b
9,26±
0,21 b
9,33±
0,40 b
9,53±
0,23 b
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
0,34±
0,05 b
0,19±
0,04 a
0,25±
0,02 ab
0,26±
0,04 ab
Acido lattico (g/l)
0,81±
0,13 ab
0,76±
0,22 ab
1,55±
0,23 b
3,42±
0,93 c
Etanolo (% v/v)
12,09±
0,44 ab
11,28±
0,16 ab
11,56±
0,11 ab
10,46±
0,35 a
Zuccheri
residui (g/l)
4,51±
0,92 a
27,87±
8,61 b
18,70±
1,47 ab
54,73±
6,38 c
Glicerolo (g/l)
7,19±
0,05 a
7,73±
0,41 b
7,40±
0,34 ab
7,16±
0,25 a
ΔΔ+ Polisaccaridi
(mg/l)
139,2±
6,1 ab
163,3±
6,8 b
131,1±
10,1 ab
136,6±
S. cerevisiae 10 6 3,53±
0,07 b
7,26±
0,35 a
0,44±
0,05 c
0,16±
0,05 a
13,04±
0,29 b
5,93±
0,18 a
7,04±
0,48 a
100,3±
4,3 a
Tabella 56: principali caratteri enologici negli svinati ottenuti dalle fermentazioni con S.
cerevisiae e L. thermotolerans in coltura pura e in coltura mista
3,5 ab
158

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Tra gli alcoli superiori e gli altri volatili presentati in tabella 57, si osserva un
sensibile aumento di propanolo ed etil acetato, evidente soprattutto nelle prove con
inoculi sequenziali, e di alcol amilico attivo, particolarmente negli svinati ottenuti dal
coinoculo. In tutti i fermentati delle prove multistarter rispetto al controllo si osserva
una significativa diminuzione nel contenuto di alcol isoamilico e di isobutanolo,
principalmente nelle prove con inoculo sequenziale.
Inoculo
(cell/ml)
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 (24h)
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 (48h)
L. thermotolerans 10 7
Acetaldeide
20,71±
2,18 a
22,22±
3,09 ab
26,59±
1,78 b
17,12±
1,86 a
Metanolo
13,28±
0,83 a
13,27±
0,77 a
14,97±
0,15 a
19,20±
0,31 b
Propanolo
39,52±
4,27 ab
68,99±
5,22 c
62,21±
5,46 b
54,84±
7,74 b
Etil acetato
43,88±
3,27 ab
47,82±
4,10 ab
54,56±
3,12 b
58,09±
1,57 b
Isobutanolo
24,33±
1,18 ab
13,38±
0,65 a
15,72±
2,41 a
13,47±
1,19 a
Amilico attivo
44,07±
2,19 b
36,84±
4,78 ab
35,07±
1,23 ab
25,47±
3,50 a
Isoamilico
154,35±
1,95 b
125,62±
1,39 ab
137,19±
8,65 ab
96,57±
10,19 a
Etil lattato
2,27±
0,24 a
1,92±
0,84 a
4,94±
1,00 a
16,69±
2,28 b
S. cerevisiae 10 6 18,42±
3,37 a
19,15±
2,18 b
27,44±
10,09 a
19,58±
3,13 a
108,66±
8,33 b
24,02±
3,01 a
171,11±
4,32 c
2,35±
0,41 a
Tabella 57: composti volatili (mg/l) negli svinati ottenuti dalle fermentazioni con S. cerevisiae e
L. thermotolerans in coltura pura e in coltura mista
Tra gli altri composti volatili (Tab. 58), rispetto al controllo con Saccharomyces, si
osserva un significativo incremento soprattutto nel contenuto di 2-feniletanolo. Si ha
invece una diminuzione significativa degli esteri acetati (acetato di isoamile e di
feniletile) e degli esteri etilici (esanoato ed ottanoato di etile).
159

Inoculo
(cell/ml)
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 (24h)
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 (48h)
L. thermotolerans 10 7
S. cerevisiae 10 6
Acetato di
isoamile
0,39±
0,02 ab
0,24±
0,03 a
0,33±
0,01 ab
0,18±
0,03 a
0,77±
0,19 b
Etil esanoato
0,26±
0,07 ab
0,14±
0,07 a
0,07±
0,02 a
0,17±
0,03 a
0,44±
0,09 b
Esanolo
0,86±
0,03 a
0,77±
0,05 a
0,81±
0,02 a
1,22±
0,15 b
0,90±
0,05 a
Etil ottanoato
0,24±
0,03 ab
0,06±
0,01 a
0,06±
0,00 a
0,07±
0,02 a
0,44±
0,05 b
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Etil decanoato
0,11±
0,02 a
0,11±
0,02 a
0,20±
0,10 a
0,12±
0,04 a
0,10±
0,05 a
Feniletil acetato
0,02±
0,01 a
0,01±
0,01 a
0,02±
0,01 a
0,02±
0,01 a
0,11±
0,02 b
Tabella 58: altri composti volatili (mg/l) negli svinati ottenuti dalle fermentazioni con S.
cerevisiae e L. thermotolerans in coltura pura e in coltura mista
2-feniletanolo
31,62±
1,28 b
25,33±
2,46 ab
30,15±
3,27 b
18,93±
2,72 a
22,23±
1,70 ab
160

CAPITOLO 4 - RISULTATI
4.3 Valutazione dell’influenza della temperatura sulle fermentazioni
miste condotte in coinoculo con i due ceppi di lievito selezionati
4.3.1 Influenza della temperatura sull’andamento fermentativo
Dalla velocità di consumo degli zuccheri (Fig. 50), si evince che le fermentazioni
miste L. thermotolerans/S. cerevisiae hanno avuto un decorso fermentativo
rallentato, sia alla temperatura di 30 °C sia a quella di 20 °C, rispetto alle
fermentazioni con S. cerevisiae in coltura pura condotte alle stesse temperature.
Figura 50: consumo degli zuccheri durante le fermentazioni miste con L. thermotolerans alla
temperatura di 20 °C e di 30 °C, confrontate con i rispettivi controlli
Nonostante l’elevato tenore zuccherino del mosto di partenza (25,4 % di zuccheri,
equivalenti a 15,24 % di alcol potenziale), sia a 20 °C che a 30 °C, le fermentazioni
miste L. thermotolerans/S. cerevisiae hanno avuto un prolungamento della
fermentazione rispettivamente di circa 3 e 8 giorni, rispetto alle prove con
Saccharomyces in coltura pura. Nel caso delle prove con Z. florentinus (Fig. 51),
invece, il rallentamento dell’attività fermentativa è evidente soltanto nelle
161

CAPITOLO 4 - RISULTATI
fermentazioni condotte a 20 °C. Lo Z. florentinus è un lievito fruttosofilo, per cui
interagisce positivamente con il S. cerevisiae, glucosofilo, determinando un
complementare e quindi più rapido consumo degli zuccheri del mosto.
Figura 51: consumo degli zuccheri durante le fermentazioni miste con Z. florentinus alla
temperatura di 20 °C e di 30 °C, confrontate con i rispettivi controlli
L’unica differenza, dunque, la si riscontra nel tempo impiegato dalle diverse colture
per consumare completamente i residui zuccherini presenti nel mosto: il ceppo di S.
cerevisiae in coltura pura consuma gli zuccheri in minor tempo ad entrambe le
temperature di fermentazione rispetto ai coinoculi misti.
4.3.2 Fermentazioni coinoculate condotte a 20 °C
Nella figura 52 è riportato l’andamento evolutivo della biomassa, da cui è evidente
come le prove di fermentazione in coinoculo sono risultate più lente rispetto a quelle
condotte in coltura pura con lo starter di S. cerevisiae (18-21 giorni contro 16).
162

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 52: cinetiche di crescita dei lieviti inoculati nelle fermentazioni miste condotte a 20 °C
Una maggiore permanenza nella fermentazione si è avuta da parte del L.
thermotolerans, che è risultato vitale a concentrazioni rilevanti sino al termine del
processo fermentativo (21 gg), mentre lo Z. florentinus lo è stato fino al 15° giorno.
Per quanto riguarda i principali parametri enologici riportati in tabella 59, i risultati
delle analisi evidenziano un incremento significativo dell’acidità totale e volatile
nelle fermentazioni in coltura mista rispetto al S. cerevisiae in coltura pura; in
particolare lo Z. florentinus mostra un maggior effetto acidificante rispetto al L.
thermotolerans con un innalzamento medio che supera i 3 g/l.
163

Inoculo
(cell/ml) pH
S. cerevisiae 10 6
3,11±
0,01 a
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
5,80±
0,10 a
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
0,45±
0,01 a
Etanolo
(% v/v)
14,96±
0,01 b
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Zuccheri residui
(g/l)
0,10±
0,01 a
Glicerolo
(g/l)
6,80±
0,01 a
Δ+ Polisaccaridi
(mg/l)
141,07±
0,01 a
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
2,98±
0,03 a
8,00±
0,20 ab
0,52±
0,01 b
14,05±
0,06 a
2,30±
0,15 b
9,49±
0,13 b
282,01±
8,16 b
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
3,01±
0,03 a
9,30±
0,10 b
0,47±
0,01 ab
14,30±
0,11 a
0,15±
0,07 a
7,63±
0,11 ab
199,48±
2,88 ab
Tabella 59: principali caratteri enologici negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste
condotte a 20 °C
Nella tabella 59, inoltre, si può osservare una significativa riduzione del tenore
alcolico nelle fermentazioni condotte in coltura mista, rispetto a quelle di controllo
con S. cerevisiae; tale riduzione risulta più marcata nelle fermentazioni con inoculo
misto L. thermotolerans/S. cerevisiae. In tutte le fermentazioni miste si è avuto un
aumento significativo della concentrazione di glicerolo rispetto al S. cerevisiae in
coltura pura, soprattutto nella fermentazione mista L. thermotolerans/S. cerevisiae.
Nei fermentati ottenuti dalle fermentazioni miste si osserva anche un significativo
aumento del tenore di mannoproteine rispetto al controllo S. cerevisiae, in modo
particolare in quelle inoculate con Lachancea/Saccharomyces,.
Nella figura 54, dove vengono riportati i risultati dell’analisi dell’acido lattico
determinato mediante confronto tra analisi HPLC (D,L-lattico) ed enzimatica (solo
L-lattico), si osserva un aumento significativo della produzione di acido lattico nelle
fermentazioni miste L. thermotolerans/S. cerevisiae rispetto al controllo S. cerevisiae
in coltura pura; nella fermentazione mista Z. florentinus/S. cerevisiae aumenta
significativamente, invece, solo l’acido D,L-lattico.
164

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 53: acido lattico prodotto nelle fermentazioni miste condotte a 20 °C
Dalla tabella 60, relativa al contenuto di alcol superiori e altri composti volatili, si
osserva che negli svinati ottenuti dalle fermentazioni con inoculi misti, si è avuta una
significativa diminuzione del tenore di acetaldeide rispetto al S. cerevisiae di
controllo ed in particolare nella fermentazione mista con Z. florentinus. Nei
fermentati con inoculo misto L. thermotolerans/S. cerevisiae si osserva anche un
significativo incremento del tenore di propanolo e, ancor più, di acetato di etile.
Questi composti, invece, nelle fermentazioni miste Z. florentinus/S. cerevisiae
risultano leggermente inferiori o ad un livello simile a quello delle relative
fermentazioni di controllo con S. cerevisiae. Un più elevato tenore in lattato di etile,
rispetto al controllo, si osserva nei fermentati ottenuti dalle fermentazioni miste ed in
modo particolare in quelle con L. thermotolerans/S. cerevisiae; mentre un livello
significativamente maggiore di alcol amilico attivo e isobutanolo si è avuto in tutte le
fermentazioni con inoculo misto. L’alcol isoamilico, invece, si forma in quantità
significativamente superiore rispetto al controllo S. cerevisiae solo nella
fermentazione mista con L. thermotolerans.
165

Inoculo
(cell/ml)
S. cerevisiae 10 6
Acetaldeide
43,94±
1,18 b
Metanolo
41,08±
0,83 a
Propanolo
33,77±
1,27 ab
Etil acetato
38,14±
1,27 a
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Isobutanolo
25,55±
1,18 a
Amilico attivo
65,50±
1,19 a
Isoamilico
216,72±
1,95 a
Etil lattato
3,80±
0,24 a
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
32,01±
3,06 ab
41,72±
1,23 a
50,28±
1,12 b
80,87±
1,20 b
57,68±
2,09 b
94,80±
5,00 b
321,04±
5,88 b
17,50±
1,23 b
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
23,07±
0,45 a
39,79±
1,00 a
28,46±
0,01 a
32,95±
1,17 a
40,06±
1,37 ab
100,08±
3,73 b
222,80±
11,34 a
8,83±
0,32 ab
Tabella 60: composti volatili (mg/l) negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste condotte a 20
°C
Dalla tabella 61, relativa agli altri composti volatili, è possibile vedere un incremento
significativo della produzione di acetato di isoamile e di 2-feniletanolo nella
fermentazione mista L. thermotolerans/S. cerevisiae rispetto al controllo S.
cerevisiae in coltura pura. Le altre variazioni significative sono relative ad una
diminuzione generalizzata della produzione degli altri volatili nelle fermentazioni
miste rispetto al controllo.
Inoculo
(cell/ml)
S. cerevisiae 10 6
Acetato di
isoamile
0,45±
0,01 ab
Etil esanoato
0,60±
0,07 b
Esanolo
1,01±
0,03 b
Etil ottanoato
0,59±
0,03 b
Etil decanoato
0,11±
0,02 ab
Feniletil acetato
0,13±
0,01 b
2-feniletanolo
7,87±
1,91 a
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,80±
0,01 b
0,08±
0,01 a
0,77±
0,01 a
0,06±
0,00 a
0,15±
0,01 b
0,08±
0,01 ab
10,30±
0,78 b
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
0,23±
0,01 a
0,06±
0,00 a
0,76±
0,00 a
0,10±
0,00 a
0,09±
0,00 a
0,04±
0,00 a
7,88±
0,32 a
Tabella 61: altri composti volatili (mg/l) negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste condotte
a 20 °C
166

4.3.3 Fermentazioni coinoculate condotte a 30 °C
CAPITOLO 4 - RISULTATI
L’evoluzione della biomassa, valutata nel corso di queste fermentazioni coinoculate è
riportata nelle figura 54. La cinetica della crescita del ceppo di S. cerevisiae sembra
che risenta della presenza del Lachancea thermotolerans (101), il quale risulta più
competitivo del ceppo Zygosaccharomyces florentinus (42), osservato nel primo
grafico. Lo Zygosaccharomyces florentinus, invece, non influenza troppo
l’andamento del Saccharomyces cerevisiae.
Figura 54: cinetiche di crescita dei lieviti inoculati nelle fermentazioni miste condotte a 30 °C
167

CAPITOLO 4 - RISULTATI
L’evoluzione della popolazione microbica della coltura pura di S. cerevisiae durante
le fermentazioni condotte a 20 °C e a 30 °C è riportata nelle figure 52 e 54. Come
atteso, a 30 °C lo sviluppo microbico della coltura è risultato più rapido,
determinando un più breve processo fermentativo, mentre a 20 °C il processo si è
rolungato, registrando sino al 16° giorno una vitalità cellulare di 10 8 cell/ml.
In sintesi, dunque, entrambi i lieviti non-Saccharomyces sono risultati vitali sino al
quarto giorno di fermentazione. In questo lasso di tempo, L. thermotolerans (ceppo
101) si differenzia, tuttavia, dalla coltura di Z. florentinus (ceppo 42) per la maggiore
capacità di svilupparsi e competere con la coltura starter di S. cerevisiae.
Dai valori presentati nella tabella relativa ai principali parametri enologici (Tab. 62),
si osserva una leggera acidificazione nelle fermentazioni miste rispetto a quelle con il
S. cerevisiae di controllo, che è risultata significativamente evidente sia dal punto di
vista del pH che da quello dell’acidità totale. Non si riscontra, invece, alcuna
differenza significativa nel tenore finale di etanolo e di glicerolo tra le fermentazioni
coinoculate e quelle condotte da Saccharomyces in purezza.
Inoculo
(cell/ml) pH
S. cerevisiae 10 6
2,98±
0,01 b
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
6,20±
0,10 a
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
0,61±
0,01 b
Etanolo
(% v/v)
14,43±
0,01 a
Zuccheri residui
(g/l)
0,10±
0,01 a
Glicerolo
(g/l)
8,40±
0,01 a
ΔΔ+ Polisaccaridi
(mg/l)
137,00±
0,09 a
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
2,80±
0,03 a
8,10±
0,20 b
0,46±
0,00 a
14,43±
0,05 a
0,18±
0,04 a
8,93±
0,14 a
297,97±
19,21 b
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
2,94±
0,01 ab
7,80±
0,04 b
0,46±
0,03 a
14,44±
0,18 a
0,10±
0,00 a
8,84±
0,12 a
240,92±
5,76 b
Tabella 62: principali caratteri enologici negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste
condotte a 30 °C
Le fermentazioni miste, inoltre, hanno mostrato una significativa riduzione
dell’acidità volatile rispetto al controllo S. cerevisiae. Nei fermentati ottenuti dalle
colture miste L. thermotolerans/S. cerevisiae, inoltre, si può notare un significativo
168

CAPITOLO 4 - RISULTATI
incremento della produzione di polisaccaridi rispetto al S. cerevisiae in coltura pura,
che sono risultati a concentrazioni più del doppio superiori (Tab. 62).
La concentrazione di acido D,L-lattico (Fig. 55) è significativamente più bassa nella
tesi fermentata dal S. cerevisiae in coltura pura rispetto alle fermentazioni miste, in
modo più evidente rispetto a quelle condotte con Z. florentinus. La produzione di
acido L-lattico, invece, è risultata significativamente maggiore rispetto al controllo S.
cerevisiae solo nella fermentazione mista L. thermotolerans/S. cerevisiae.
Figura 55: acido lattico prodotto nelle fermentazioni miste condotte a 30 °C
L’analisi dei principali composti volatili (Tab. 63) ha mostrato una produzione
significativamente maggiore di etil acetato da parte del S. cerevisiae in coltura pura
e da parte del coinoculo L. thermotolerans/ S. cerevisiae rispetto alla coltura mista Z.
florentinus/S. cerevisiae. Le fermentazioni miste, inoltre, hanno determinato un
incremento significativo della concentrazione di alcol amilico attivo rispetto al
controllo S. cerevisiae, soprattutto in presenza dello Z. florentinus. Riguardo alla
produzione degli altri composti secondari, mostrati in tabella 63, non si sono
registrate variazioni statisticamente degne di nota.
169

Inoculo
(cell/ml)
S. cerevisiae 10 6
Acetaldeide
34,28±
1,18 a
Metanolo
43,29±
0,83 a
Propanolo
31,78±
2,27 a
Etil acetato
35,82±
3,47 b
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Isobutanolo
72,60±
1,28 a
Amilico attivo
64,60±
2,21 a
Isoamilico
279,46±
1,45 a
Etil lattato
3,60±
0,24 a
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
34,78±
12,05 a
42,06±
2,85 a
34,55±
0,44 a
34,28±
0,03 b
71,49±
3,46 a
79,13±
3,58 ab
306,76±
6,59 a
5,01±
0,03 a
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
29,95±
4,04 a
42,02±
1,65 a
27,49±
2,57 a
28,41±
0,99 a
56,38±
3,40 a
90,83±
2,85 b
326,18±
16,75 a
3,89±
0,73 a
Tabella 63: composti volatili (mg/l) negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste condotte a 30
°C
Prendendo in esame gli altri composti volatili (Fig. 64), le prove multistarter
condotte con lo Z. florentinus hanno mostrato un aumento significativo della
produzione di feniletil acetato e di 2-feniletanolo rispetto alla coltura pura di S.
cerevisiae. Per quanto riguarda etil esanoato, esanolo ed etil ottanoato, invece, le
fermentazioni miste hanno mostrato una produzione significativamente inferiore
rispetto a quella fatta registrare dal controllo S. cerevisiae.
Inoculo
(cell/ml)
S. cerevisiae 10 6
Acetato di
isoamile
0,58±
0,02 a
Etil esanoato
0,23±
0,07 b
Esanolo
1,03±
0,03 b
Etil ottanoato
0,34±
0,03 b
Etil decanoato
0,10±
0,02 b
Feniletil acetato
0,14±
0,01 a
2-feniletanolo
10,05±
2,53 a
L. thermotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 7
0,64±
0,03 a
0,09±
0,01 a
0,82±
0,02 a
0,04±
0,02 a
0,10±
0,01 b
0,10±
0,00 a
10,10±
0,20 a
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
0,64±
0,04 a
0,04±
0,01 a
0,89±
0,03 a
0,18±
0,01 ab
0,08±
0,00 a
0,33±
0,01 b
11,62±
0,28 b
Tabella 64: altri composti volatili (mg/l) negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste condotte
a 30 °C
170

CAPITOLO 4 - RISULTATI
4.4 Valutazione delle fermentazioni miste con i due ceppi selezionati
di lieviti non-Saccharomyces in vinificazioni su scala semi-industriale
4.4.1 Fermentazioni in coinoculo e sequenziali (48h) con il ceppo 42
di Z. florentinus e S. cerevisiae
L’evoluzione della crescita della popolazione microbica nelle vinificazioni condotte
in cantina, valutata mediante le conte vitali, è riportata nella figura 56. Nelle diverse
vasche è stata rilevata un’elevata carica iniziale di lieviti non–Saccharomyces
“selvaggi”, presenti in tutte le prove intorno a concentrazioni di 10 7 cell/ml sino al 4°
giorno; nel periodo successivo tale carica si è ridotta drasticamente in modo
particolare nelle fermentazioni in coinoculo dove ha raggiunto concentrazioni
inferiori a 10 2 cell/ml.
Il S. cerevisiae, inoculato come unico starter, ha mostrato la tipica evoluzione delle
fermentazioni vinarie, con un rapido sviluppo e successivo assestamento a
concentrazioni vitali superiori a 10 7 cell/ml per tutto l’arco del processo
fermentativo. Nelle prove in coinoculo l’evoluzione del ceppo di S. cerevisiae è
risultata simile a quella delle fermentazioni da esso condotte come unico starter,
anche se con concentrazioni cellulari leggermente inferiori, non superando mai il
valore di 10 7 cell/ml. Questo andamento è risultato più marcato nelle prove condotte
con inoculo sequenziale, in cui la presenza dello Z. florentinus ha limitato la crescita
di S. cerevisiae.
Nelle fermentazioni condotte in coinoculo con S. cerevisiae, il ceppo 42 di Z.
florentinus si è sviluppato durante i primi 4 giorni di fermentazione, risultando in
questa fase la specie dominante. Dopo tale fase si è avuta una riduzione progressiva
sino al termine della fermentazione. Tale dominanza è stata più evidente nelle prove
con inoculo sequenziale, in cui il lievito non-Saccharomyces si è mantenuto a
concentrazioni superiori a 10 6 cell/ml sino al settimo giorno di fermentazione.
171

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Figura 56: cinetica di crescita dei lieviti durante la fermentazione
Dai risultati riepilogati nella tabella 65 si evince che, rispetto alla fermentazione di
controllo, inoculata con il solo S. cerevisiae, nelle fermentazioni miste con inoculo
sequenziale si è avuta una significativa riduzione del tenore di etanolo, un
incremento del tenore di acidità volatile e di glicerolo. Negli svinati delle prove con
172

CAPITOLO 4 - RISULTATI
inoculi misti, inoltre, si può notare un incremento significativo dei valori di acidità
totale, mentre non si osservano variazioni sensibili di pH.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
Acido lattico (g/l)
Acido malico
(g/l)
Etanolo (% v/v)
Glicerolo (g/l)
Δ+ Polisaccaridi
(mg/l)
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
3,37±
0,02 a
7,45±
0,11 b
0,30±
0,02 a
0,17±
0,02 a
2,05±
0,15 a
12,43±
0,18 b
9,36±
0,27 a
379,7±
28,4 a
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 3,39±
(48h) 0,02 a
7,69±
0,18 b
0,37±
0,02 b
0,18±
0,02 a
1,99±
0,07 a
12,18±
0,20 a
11,53±
0,36 b
372,9±
16,6 a
S. cerevisiae 10 6 3,37±
0,01 a
7,03±
0,23 a
0,30±
0,02 a
0,20±
0,01 a
2,10±
0,10 a
12,45±
0,14 b
9,02±
0,14 a
378,8±
9,0 a
Tabella 65: principali caratteri enologici negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste
condotte su scala semi-industriale
Gli altri analiti riportati nella tabella 65 non hanno fatto registrare differenze
statisticamente significative.
Relativamente alla produzione di alcoli superiori e di altri composti volatili, in
tabella 66, rispetto alle vinificazioni in cui è stato inoculato solo S. cerevisiae, negli
svinati delle fermentazioni con inoculo sequenziale si può osservare una significativa
diminuzione del tenore di acetaldeide, metanolo e propanolo e un incremento di etil
acetato. Nelle fermentazioni miste con inoculo sequenziale, rispetto al relativo
controllo con Saccharomyces si è avuto un significativo incremento di isobutanolo,
che è risultato meno marcato, ma sempre significativo, nelle fermentazioni condotte
in coinoculo. In tutte le fermentazioni con inoculo misto non si rilevano significative
variazioni per gli alcoli amilici e l’etil lattato.
173

Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
Etil acetato
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
45,05±
8,83 b
71,73±
1,73 b
61,14±
6,35 ab
89,80±
8,06 a
60,26±
1,01 ab
32,95±
2,11 a
136,19±
4,82 a
1,03±
0,05 a
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 36,67±
(48h) 4,55 a
67,62±
1,44 a
52,51±
3,53 a
122,20±
2,94 b
73,76±
1,57 b
33,65±
2,90 a
136,93±
3,86 a
1,10±
0,22 a
S. cerevisiae 10 6 46,18±
6,14 b
74,31±
3,20 b
71,78±
6,06 b
105,10±
14,84 a
55,01±
3,36 a
32,78±
1,20 a
135,40±
4,04 a
1,06±
0,15 a
Tabella 66: composti volatili (mg/l) negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste condotte su
scala semi-industriale
Dalla tabella 67 si nota che, rispetto alle fermentazioni di controllo con inoculo del
solo S. cerevisiae, la maggior parte degli esteri risulta a concentrazione
significativamente superiore negli svinati delle fermentazioni miste. Acetato di
isoamile ed etil butirrato, infatti, tendono ad aumentare in modo più marcato nelle
fermentazioni miste con inoculo sequenziale, mostrando variazioni significative
anche rispetto ai valori registrati negli svinati ottenuti dalle fermentazioni in
coinoculo. L’etil esanoato, invece, ha mostrato una tendenza opposta, con valori
significativamente più elevati nelle fermentazioni in coinoculo rispetto a quelle con
inoculo sequenziale, e sempre significativamente più alti del S. cerevisiae in coltura
pura di controllo. In modo discordante, l’etil ottanoato risulta diminuire
significativamente nelle fermentazioni miste rispetto alla quantità prodotta dal S.
cerevisiae in coltura pura. Gli altri composti volatili non si sono registrate variazioni
significative.
Isobutanolo
Amilico attivo
Isoamilico
Etil lattato
174

Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
Esanolo
Etil ottanoato
CAPITOLO 4 - RISULTATI
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
0,28±
0,02 ab
0,38±
0,02 b
0,35±
0,02 a
0,18±
0,02 a
0,33±
0,02 ab
0,03±
0,01 a
23,69±
1,50 a
Z. florentinus 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 0,55±
(48h) 0,17 b
0,26±
0,03 ab
0,37±
0,01 a
0,18±
0,08 a
0,44±
0,02 b
0,03±
0,00 a
22,74±
2,55 a
S. cerevisiae 10 6 0,10±
0,01 a
0,06±
0,01 a
0,47±
0,01 a
0,26±
0,06 b
0,08±
0,02 a
0,04±
0,01 a
21,62±
0,07 a
Tabella 67: altri composti volatili (mg/l) negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste condotte
su scala semi-industriale
Dopo un periodo di alcuni mesi di stabilizzazione trascorsi dalla FML, l’analisi
sensoriale mediante panel test non ha evidenziato sostanziali differenze tra i vini per
quel che riguarda i differenti metodi di FML.
Figura 57: analisi sensoriale dei vini ottenuti dalle fermentazioni miste con Z. florentinus e S.
cerevisiae (* differenze significative al Duncan test per P

CAPITOLO 4 - RISULTATI
relazione al diverso tipo di inoculo effettuato per la fermentazione alcolica. I vini
prodotti con inoculo misto, infatti, hanno mostrato un significativo incremento delle
note floreali rispetto a quelli prodotti con il solo S. cerevisiae, confermando che gli
esteri (acetato di isoamile, etil esanoato ed etil butirrato), presenti in maggiore
quantità, costituiscono aromi desiderabili e positivamente associati al carattere
floreale. Solo il vino ottenuto dalla fermentazione sequenziale, invece, è stato
giudicato possere carattere di astringenza significativamente inferiore agli altri vini,
sia quelli prodotti dalla fermentazione del solo S. cerevisiae sia da quelli ottenuti dal
coinoculo misto Saccharomyces/non-Saccharomyces.
4.4.2 Fermentazioni in coinoculo e sequenziali (48h) con il ceppo 101
di L. thermotolerans e S. cerevisiae
La figura 58 mostra l’evoluzione della crescita della popolazione microbica, valutata
mediante le conte vitali. Come nelle vinificazioni condotte con lo Z. florentinus, nelle
diverse vasche è stata rilevata un’elevata carica iniziale di lieviti non–Saccharomyces
“selvaggi”, presenti a concentrazioni di circa 10 7 cell/ml sino al 4° giorno, per poi
subire una drastica riduzione fino a concentrazioni inferiori a 10 2 cell/ml. Lo starter
S. cerevisiae in coltura pura (controllo) ha mostrato la tipica evoluzione delle
fermentazioni vinarie con un rapido avvio e successiva permanenza a concentrazioni
vitali superiori a 10 7 cell/ml per buona parte del processo fermentativo. Nelle prove
di fermentazione mista l’evoluzione del ceppo di S. cerevisiae (Fig. 58) è risultata
simile a quella delle fermentazioni da esso condotte come unico starter, anche se con
concentrazioni cellulari leggermente inferiori non superando mai il valore di 10 7
cell/ml. Questo andamento sembra più marcato nelle prove con inoculo sequenziale,
dove la crescita di S. cerevisiae è risultata praticamente assente rispetto alla
concentrazione iniziale di inoculo.
Nelle fermentazioni condotte in coinoculo con S. cerevisiae, il lievito non-
Saccharomyces si è sviluppato durante i primi 4 giorni di fermentazione, risultando
in questa fase le specie dominante. Dopo tale fase si è avuta una riduzione
176

CAPITOLO 4 - RISULTATI
progressiva sino al termine della fermentazione. Tale dominanza è stata più evidente
nelle prove con inoculo sequenziale, in cui il ceppo di L. thermotolerans si è
mantenuto a concentrazioni più elevate.
Figura 58: cinetica di crescita dei lieviti durante la fermentazione
177

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Dai dati sintetizzati nella tabella 68 si evince che, rispetto alla fermentazione
inoculata con il solo S. cerevisiae, nelle fermentazioni miste con inoculo sequenziale
si è avuta una significativa riduzione del tenore di etanolo degli svinati, nei quali si è
registrata una diminuzione media di circa il 9 %. Nei fermentati delle prove con
inoculo misto si osservano variazioni significative del pH, che tende a diminuire in
particolare nelle prove con inoculo sequenziale di Saccharomyces. Parallelamente,
negli svinati delle prove con inoculi misti si osserva un significativo incremento dei
valori di acidità totale e della concentrazione di acido lattico, particolarmente
evidente nelle prove con inoculo sequenziale; sebbene valori significamente superiori
al controllo risultano anche quelli del coinoculo. Nel caso delle prove con inoculo
sequenziale, inoltre, negli svinati si osserva anche un incremento sensibile del tenore
di acidità volatile rispetto alle vinificazioni condotte con il solo inoculo di
Saccharomyces, con valori che si avvicinano a circa 0,5 g/l di acido acetico.
Inoculo
(cell/ml) pH
Acidità totale
(g/l ac. tartarico)
Acidità volatile
(g/l ac. acetico)
diminuzione del tenore di metanolo e propanolo e un incremento di isobutanolo. In
178
Acido lattico (g/l)
Acido malico
(g/l)
Etanolo (% v/v)
Glicerolo (g/l)
Δ+ Polisaccaridi
(mg/l)
L. themotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
3,29±
0,05 ab
9,33±
0,11 ab
0,32±
0,02 a
2,35±
0,77 ab
2,02±
0,16 a
12,29±
0,18 b
9,68±
0,10 a
358,6±
14,4 a
L. themotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 3,21±
(48h) 0,03 a
12,45±
0,18 b
0,48±
0,02 b
6,38±
0,22 b
1,96±
0,12 a
11,77±
0,20 a
11,22±
0,28 b
377,0±
24,6 a
S. cerevisiae 10 6 3,37±
0,01 b
7,03±
0,23 a
0,30±
0,02 a
0,20±
0,01 a
2,10±
0,10 a
12,45±
0,14 b
9,02±
0,14 a
378,8±
9,0 a
Tabella 68: principali caratteri enologici negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste
condotte su scala semi-industriale
Riguardo al contenuto in glicerolo (Tab. 68), rispetto alle fermentazioni condotte con
inoculo di Saccharomyces, si osserva un suo significativo incremento soltanto nelle
fermentazioni miste con inoculo sequenziale.
Relativamente alla produzione dei principali composti volatili, in tabella 69 si
osserva che, rispetto alle vinificazioni in cui è stato inoculato solo Saccharomyces,
negli svinati delle fermentazioni con inoculo sequenziale si ha una significativa

CAPITOLO 4 - RISULTATI
tutte le fermentazioni con inoculo misto non si rilevano significative variazioni per
acetaldeide, etil acetato e alcoli amilici; si è registrato, invece, un forte e significativo
incremento nella produzione di lattato di etile nelle fermentazioni miste,
specialmente in quelle con inoculo sequenziale, che a sua volta presenta una
concentrazione significativamente superiore a quella degli svinati ottenuti dal
coinoculo.
Inoculo
(cell/ml)
Acetaldeide
Metanolo
Propanolo
L. themotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
45,15±
12,92 a
67,08±
1,78 ab
68,74±
4,09 b
94,33±
5,79 a
54,32±
2,50 a
34,10±
2,51 a
146,41±
8,91 a
13,01±
1,43 ab
L. themotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 47,04±
(48h) 19,01 a
62,80±
2,26 a
57,02±
7,94 a
105,99±
5,97 a
63,52±
2,78 b
30,73±
3,07 a
140,26±
6,52 a
40,49±
5,52 b
S. cerevisiae 10 6 46,18±
6,14 a
74,31±
3,20 b
71,78±
6,06 b
105,10±
14,84 a
55,01±
3,36 a
32,78±
1,20 a
135,40±
4,04 a
1,06±
0,15 a
Tabella 69: composti volatili (mg/l) negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste condotte su
scala semi-industriale
Dalla tabella 70 si nota che, rispetto alle fermentazioni di controllo con inoculo di
Saccharomyces, la concentrazione degli esteri, acetato di isoamile, etil esanoato ed
etil butirrato, risulta significativamente più alta negli svinati derivati dalle
fermentazioni miste e specialmente in quelle con inoculo sequenziale. L’etil
ottanoato, invece, tende a diminuire in modo statisticamente significativo nelle
fermentazioni miste, soprattutto in quelle con inoculo sequenziale. Riguardo al
contenuto di esanolo e di feniletil acetato non sono state osservate variazioni
significative rispetto al controllo. La produzione di 2-feniletanolo risulta aumentare
significativamente nelle fermentazioni miste, particolarmente in quelle con inoculo
sequenziale, che mostrano una concentrazione significativamente più elevata rispetto
a quella della fermentazione in coinoculo, che a sua volta è significativamente
Etil acetato
maggiore a quella della coltura pura del S. cerevisiae.
Isobutanolo
Amilico attivo
Isoamilico
Etil lattato
179

Inoculo
(cell/ml)
Acetato di
isoamile
Etil esanoato
Esanolo
Etil ottanoato
CAPITOLO 4 - RISULTATI
L. themotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6
0,30±
0,02 ab n.d.
0,48±
0,02 a
0,22±
0,03 ab
0,24±
0,02 ab
0,02±
0,01 a
28,07±
1,77 ab
L. themotolerans 10 7
+ S. cerevisiae 10 6 0,62±
(48h) 0,04 b
0,30±
0,02 b
0,39±
0,01 a
0,11±
0,00 a
0,64±
0,14 b
0,03±
0,00 a
35,39±
0,64 b
S. cerevisiae 10 6 0,10±
0,01 a
0,06±
0,01 a
0,47±
0,01 a
0,26±
0,06 b
0,08±
0,02 a
0,04±
0,01 a
21,62±
0,07 a
Tabella 70: altri composti volatili (mg/l) negli svinati ottenuti dalle fermentazioni miste condotte
su scala semi-industriale
Anche per le prove di fermentazione con il L. thermotolerans, la FML condotta
secondo due differenti metodi non ha prodotto percepibili variazioni nei vini ottenuti.
Figura 59: analisi sensoriale dei vini ottenuti dalle fermentazioni miste con L. thermotolerans e
S. cerevisiae (* differenze significative al Duncan test per P

CAPITOLO 4 - RISULTATI
Saccharomyces hanno mostrato un incremento significativo dell’aroma speziato, che
contribuisce positivamente alla qualità organolettica del vino caratterizzandolo, in
confronto a quello prodotto dalla fermentazione inoculata con il solo S. cerevisiae.
Anche la percezione del tenore di acidità da parte dei degustatori è risultata
significativamente più elevata per i vini ottenuti da inoculo misto: il carattere di
intensa acidità prodotto dall’inoculo sequenziale è risultato essere significativamente
più marcato rispetto a quello del coinoculo, che a sua è stato significativamente
superiore all’acidità del vino ottenuto dall’inoculo del solo S. cerevisiae. Il vino
prodotto con inoculo misto sequenziale, inoltre, è stato giudicato significativamente
più dolce rispetto a quelli ottenuti con le altre modalità di inoculo.
4.5 Valutazione della dominanza del ceppo di S. cerevisiae inoculato
rispetto ai ceppi indigeni nelle vinificazioni su scala semi-industriale
Lo studio della dominanza con metodi molecolari è stato effettuato al fine di saggiare
la composizione della microflora saccaromicetica fermentante e di valutare il reale
contributo dello starter EC1118 al processo fermentativo. In tale modo è stato
possibile confermare che i caratteristici profili analitici e sensoriali ottenuti dalle
fermentazioni miste dipendessero dalla presenza del ceppo di S. cerevisiae inoculato
e non da altri Saccharomyces indigeni.
Per quanto riguarda la dominanza dei ceppi non-Saccharomyces, invece, non
abbiamo ritenuto necessario effettuare tale analisi, in quanto le specie impiegate per
l’inoculo si riscontrano raramente nei mosti e quando sono presenti hanno una
concentrazione molto bassa. Le specie non-Saccharomyces indigene, inoltre, non
sono dei microrganismi forte-fermentanti, per cui il loro contributo al processo
fermentativo viene considerato molto modesto.
L’analisi PCR delle sequenze interdelta ha permesso la differenziazione dei ceppi di
S. cerevisiae isolati a fine fermentazione, in base al polimirfismo di lunghezza del
bersaglio da amplificare. Questa tecnica molecolare ha consentito di individuare
181

CAPITOLO 4 - RISULTATI
quanti ceppi di S. cerevisiae, oltre allo starter EC1118 inoculato, fossero intervenuti
nel corso della fermentazione.
La figura 60 mostra i 10 differenti profili di amplificazione, a cui sono risultati
appartenere i 190 S. cerevisiae isolati, e corrispondenti a 10 diversi biotipi. Il biotipo
I (corsia elettroforetica I) è relativo al S. cerevisiae EC1118 impiegato come starter
nell’inoculo ed usato come controllo nella PCR (corsia elettroforetica C).
Figura 60: profilo elettroforetico dei biotipi di S. cerevisiae (I-X) ottenuti mediante analisi PCR
di sequenze interdelta (MK: marcatore, C: controllo, S. cerevisiae EC1118 inoculato)
La tabella 71 riporta la frequenza dei differenti biotipi, ai quali appartengono i S.
cerevisiae isolati dalle fermentazioni. Da essa si evince come la dominanza dello
starter S. cerevisiae EC1118, rappresentato dal biotipo I è risultata complessivamente
pari al 78,4 %, a conferma che la fermentazione era frutto del ceppo inoculato e non
di altri ceppi di S. cerevisiae provenienti dall’ambiente di cantina e/o dalle uve. Nella
fermentazione di controllo si è rilevata la dominanza maggiore (89,1 %), mentre in
entrambe le fermentazioni miste coinoculate l’EC1118 ha mostrato una dominanza
intermedia e simile di circa l’84 %. Nelle fermentazioni miste sequenziali, invece,
l’EC1118 ha mostrato la dominanza minore e più eterogenea rispetto alle altre
fermentazioni: la dominanza è risultata pari al 63,8 % nella prova con L.
thermotolerans, dove si è avuta anche la maggiore eterogeneità di biotipi, e pari al
74,3 % nella fermentazione con Z. florentinus. Da notare, inoltre, che il biotipo più
182

CAPITOLO 4 - RISULTATI
frequente dopo quello inoculato è risultato essere l’VIII, che è anche l’unico ad
essere presente in tutte le fermentazioni.
Biotipi
Lt + Sc Zf + Sc Lt + Sc Zf + Sc Sc Totale biotipi
(48h) (48h) (coin) (coin) (controllo) trovati
I (ceppo 30 26 33 27 33 149
inoculato) (63,4%) (74,3%) (84,6%) (84,4%) (89,2%) (78,4%)
II 4 3 0 0 0 7
III 0 0 1 0 0 1
IV 1 0 0 0 0 1
V 4 2 0 0 1 7
VI 1 0 0 0 0 1
VII 1 0 0 0 0 1
VIII 3 3 5 3 3 17
IX 2 1 0 1 0 4
X 1 0 0 1 0 2
Totale ceppi
testati
47 35 39 32 37 190
Tabella 71: frequenza dei differenti biotipi di S. cerevisiae
183

CAPITOLO 5 - DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
CAPITOLO 5 - DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Oltre a spianare la strada verso l’attuazione di nuove strategie per la gestione dei
processi di fermentazione, gli studi condotti sulle fermentazioni con inoculi misti
pongono il loro interesse verso le interazioni fisiologiche e metaboliche tra i ceppi di
lieviti vinari S. cerevisiae e non-Saccharomyces. Diverse prove (Fleet, 2003 e 2008;
Howell et al., 2006; Ciani et al., 2009; Anfgang et al., 2009) hanno mostrato che
quando alcuni lieviti coesistono e sviluppano insieme in determinate condizioni
fermentative, interagiscono e producono composti “imprevedibili” e/o a differenti
livelli, che possono influenzare la composizione analitica e sensoriale del vino.
Possibili interazioni sinergiche tra lieviti diversi, potrebbero rappresentare uno
strumento per nuove tecnologie fermentative.
Nella presente ricerca è stata valutata la possibilità di utilizzare i lieviti non-
Saccharomyces di ambito vinario in combinazione con colture starter di S. cerevisiae
per l’allestimento di fermentazioni miste. L’aggiunta di lieviti non-Saccharomyces
nella preparazione degli starter di vinificazione può consentire da un lato il controllo
microbiologico del processo multistarter e dall’altro l’ottenimento di particolari
profili analitici e sensoriali dei vini, generati dalle possibili interazioni tra i diversi
lieviti nelle colture miste.
In tale contesto, abbiamo valutato il comportamento fermentativo di 16 colture di
lieviti non-Saccharomyces di ambito enologico, precedentemente selezionate, in
microfermentazioni condotte in coltura mista. Mentre la coltura non-saccaromicetica
è stata inoculata alla concentrazione fissa di 10 7 cell/ml, il ceppo starter di S.
cerevisiae è stato saggiato a tre livelli di inoculo (10 3 ; 10 5 ; 10 7 cell/ml) per ottenere
rapporti tali da mimare le fermentazioni in coinoculo e sequenziali, riproducendo le
eventuali dinamiche che si possono instaurare nelle fermentazioni spontanee. Da
questa serie di prove sono state ottenute utili informazioni sulla cinetica di crescita e
l’attività fermentativa, corroborate dai dati analitici dei fermentati. Questi risultati
hanno messo in evidenza un’ampia variabilità intra ed interspecifica per i caratteri
enologici e le condizioni di fermentazione presi in esame, che ci hanno permesso di
selezionare i due ceppi, appartenenti a generi differenti, con le più interessanti
caratteristiche utili a migliorare e caratterizzare i vini.
184

CAPITOLO 5 - DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
L’influenza dei lieviti non-Saccharomyces sulle cinetiche di crescita complessive
sembra essere correlata alle relative concentrazioni cellulari e alla loro persistenza
durante le fermentazioni miste. Infatti, sebbene nel rapporto di inoculo di 1:1 la
crescita del S. cerevisiae non veniva influenzata in nessuna delle fermentazioni
miste, nei rapporti di inoculo più alti (100:1 e 10000:1, non-Saccharomyces:S.
cerevisiae) i lieviti non-Saccharomyces hanno esercitato un evidente effetto inibitore
sulla crescita del S. cerevisiae, proporzionalmente al livello di inoculo (Ciani et al.,
2006; Mendoza et al., 2007). Il rallentamento della crescita cellulare e la riduzione
della produzione della biomassa da parte di S. cerevisiae e, al tempo stesso, la
prolungata persistenza dei lieviti non-Saccharomyces, ai rapporti più alti di inoculo,
sono probabilmente dovuti alla maggiore competitività di questi lieviti non-
Saccharomyces per i fattori di crescita (Bisson, 1999; Fleet, 2003; Mendoza et al.,
2007).
Le fermentazioni su scala di laboratorio si sono svolte regolarmente senza arresti di
fermentazione e le analisi dei relativi fermentati non hanno evidenziato la presenza di
composti con possibile impatto negativo ad un livello tale da superare la soglia di
percezione sensoriale (es: etil acetato per Hanseniaspora). Al contrario, abbiamo
individuato per ogni associazione non-Saccharomyces/S. cerevisiae alcuni caratteri
enologici interessanti. In particolare, in coltura mista e in funzione anche dei diversi
rapporti di inoculo sono state osservate spacifiche peculiarità per i differenti ceppi di
lievito. La riduzione della concentrazione di etanolo finale da parte del ceppo 64 di
Saccharomycodes ludwigii e la capacità di ridurre l’acidità volatile da parte dei ceppi
di Torulaspora delbrueckii (94) (Castelli, 1969; Ciani et al., 2006; Bely et al., 2008),
Lachancea thermotolerans (101 e 103), Metschnikowia pulcherrima (46),
Hanseniaspora osmophila (32), Zygosaccharomyces florentinus (42),
Saccharomycodes ludwigii (64) e Schizosaccharomyces pombe (95). La
combinazione e l’interazione tra la coltura starter di S. cerevisiae e le specie non-
saccaromicetiche portano spesso ad una riduzione di acido acetico, persino a
concentrazioni inferiori rispetto a quelle prodotte in coltura pura. Ciò farebbe ritenere
che si stabilisca una interazione sinergica positiva che determina la riduzione di tale
composto.
185

CAPITOLO 5 - DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
L’incremento di acidità totale ad opera del ceppo 101 di Lachancea thermotolerans
ha confermato i risultati di precedenti indagini che hanno messo in evidenza questo
interessante carattere (Mora et al., 1990; Kapsopoulou et al., 2005 e 2007), il quale
può essere sfruttato in presenza di mosti a bassa acidità iniziale, sempre più diffusi
nell’area centro-meridionale del nostro paese.
Dei fermentati caratterizzati da una maggiore concentrazione di glicerolo sono stati
prodotti da Candida zemplinina (22), Lachancea thermotolerans (101),
Saccharomycodes ludwigii (64) e Schizosaccharomyces pombe (95). Un incremento
dei polisaccaridi, interessanti per migliorare la corposità e la complessità dei vini, è
stato rilevato nei fermentati prodotti da Candida zemplinina (22), Lachancea
thermotolerans (101), Pichia fermentans (4), Saccharomycodes ludwigii (62 e 64),
Schizosaccharomyces pombe (95), Torulaspora delbrueckii (94) e
Zygosaccharomyces florentinus (42). Infine, per quanto riguarda la componente
volatile analizzata, è possibile notare un incremento di esteri e composti volatili nelle
colture miste rispetto al controllo. Si sono registrati incrementi della concentrazione
di isoamil acetato nei fermentati di Torulaspora delbrueckii (94), Metschnikowia
pulcherrima (46), Candida tropicalis (69), Lachancea thermotolerans (103), Pichia
anomala (9), Saccharomycodes ludwigii (64) e Schizosaccharomyces pombe (95), 2-
feniletanolo nei fermentati di Lachancea thermotolerans (101), Zygosaccharomyces
florentinus (42), Torulaspora delbrueckii (92 e 94) e Saccharomycodes ludwigii (64)
e feniletil acetato nei fermentati di Zygosaccharomyces florentinus (42) e
Schizosaccharomyces pombe (95). In studi precedenti sull’impiego associato di
lieviti S. cerevisiae e non-Saccharomyces sono già stati evidenziati molti degli effetti
positivi prodotti in queste fermentazioni miste. Studiando la fermentazione mista con
S. cerevisiae e M. pulcherrima, Jolly et al. (2003) hanno segnalato una interazione
positiva tra questi due lieviti per quanto riguarda la rilevante produzione di 2-
feniletanolo e isoamil acetato, rispetto al S. cerevisiae in coltura pura. Anche le
fermentazioni miste inoculate con S. cerevisae/C. stellata hanno prodotto dei vini
contenenti concentrazioni di glicerolo decisamente maggiori di quelle riscontrate nei
vini ottenuti dall’inoculo del solo S. cerevisiae (Ciani & Ferraro, 1998; Soden et al.,
2002).
186

CAPITOLO 5 - DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Come abbiamo già riportato, anche la competitività (intesa come presenza e
persistenza durante il processo fermentativo) dei lieviti non-Saccharomyces è
risultata differente tra i diversi ceppi di lievito ed è stato un altro parametro tenuto in
considerazione per la scelta dei ceppi da utilizzare nelle successive prove.
Sebbene ulteriori studi sulle altre combinazioni di specie non-Saccharomyces
valutate in coltura mista potrebbero avere interessanti sviluppi, relativi ad alcuni
peculiari aspetti analitici, sono stati scelti per le indagini successive due ceppi
appartenenti alle specie L. thermotolerans (101) e Z. florentinus (42).
La prima specie è stata scelta per l’ottima competitività in coltura mista, la riduzione
dell’acidità volatile, la capacità acidificante (già nota in letteratura: Mora et al., 1990;
Kapsopoulou et al., 2005 e 2007), l’incremento di glicerolo, polisaccaridi anche in
coltura mista e di composti volatili come il 2-feniletanolo.
La coltura di Z. florentinus oltre alla buona competitività con lo starter di S.
cerevisiae ha mostrato bassa produzione di acidità volatile (anche rispetto a
Saccharomyces in coltura pura) e incrementi nei relativi fermentati di polisaccaridi e
composti volatili (2-feniletanolo e feniletil acetato).
Anche le colture appartenenti ai generi Torulaspora, Metschnikowia, Pichia e
Hanseniaspora (in particolare la specie H. osmophila) hanno mostrato in
fermentazioni miste la capacità di interagire positivamente con la coltura di S.
cerevisiae, migliorando il profilo dei prodotti di fermentazione analizzati e che
meritano quindi ulteriori approfondimenti in futuro.
Nel prosieguo delle indagini abbiamo quindi focalizzato l’attenzione sui due ceppi
precedentemente indicati, L. thermotolerans (101) e Z. florentinus (42).
Parallelamente sono stati valutati i diversi tempi di inoculo (coinoculo e sequenziale
a 24 e 48h). In coltura mista il ceppo di Z. florentinus ha confermato la sua buona
competitività, senza comunque interferire sullo sviluppo della coltura starter
saccaromicetica. Come atteso, lo Z. florentinus ha dimostrato di competere più
efficacemente con S. cerevisiae negli inoculi sequenziali rispetto al coinoculo. In tali
prove di fermentazione mista, inoltre, ha confermato la riduzione dell’acidità volatile
nelle fermentazioni in coinoculo e dell’alcol isoamilico in quelle sequenziali, rispetto
187

CAPITOLO 5 - DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
alla fermentazione condotta con il solo ceppo di S. cerevisiae, e incrementi del
feniletil acetato e del 2-feniletanolo (quest’ultimo soprattutto nelle prove in
coinoculo). Inoltre è stato rilevato un minor consumo di azoto assimilabile, carattere
che potrebbe rilevarsi interessante in condizioni di carenza di tale fonte nutritiva nel
mosto.
Se confrontato con Z. florentinus , il ceppo 101 di L. thermotolerans ha confermato
una maggiore competitività con il ceppo starter di S. cerevisiae, inibendone lo
sviluppo soprattutto nelle fermentazioni sequenziali, in cui ha mostrato una
permanenza simile a quella della sua coltura pura per l’intero decorso fermentativo.
Questo è stato confermato dal fatto che alcuni dei caratteri enologici peculiari relativi
al lievito L. thermotolerans, come la maggior produzione di glicerolo e la riduzione
dell’acidità volatile, siano stati maggiormente rilevabili nelle fermentazioni
sequenziali. Nelle fermentazioni miste, inoltre, il ceppo di Lachancea ha prodotto
rilevanti quantitativi di acido L-lattico e ha confermato la sua capacità di
incrementare il livello di polisaccaridi.
Le prove in fermentatore da laboratorio sono state condotte per valutare l’effetto
della temperatura (20 °C e 30 °C) e del substrato (mosto di Sangiovese e Cabernet ad
una concentrazione zuccherina del 25,4 %). In tali condizioni, sono stati confermati
sia la cinetica di crescita dei diversi ceppi sia i profili analitici dei fermentati condotti
in coltura mista rispetto alle prove di controllo. Per quanto riguarda L.
thermotolerans, in particolare, è stata confermata la maggiore competitività ad
entrambe le temperature e la maggiore persistenza rispetto allo Z. florentinus alla
temperatura più bassa. In tali prove, inoltre, è stato rilevato un effetto temperatura-
dipendente anche nei riguardi della produzione di acido L-lattico da parte di L.
thermotolerans. Infatti, sebbene risultasse sempre significativamente più alta rispetto
al S. cerevisiae in coltura pura, tale produzione a 20 °C è risultata superiore di ben
dieci volte rispetto alla stessa prova condotta a 30 °C. In tali condizioni si è inoltre
osservata una differente utilizzazione degli zuccheri nelle prove in coinoculo con Z.
florentinus. Tale lievito fruttosofilo interagisce positivamente con il ceppo di S.
cerevisiae glucosofilo con il risultato di una utilizzazione più rapida degli zuccheri. È
possibile osservare come la temperatura influenzi anche la produzione di glicerolo da
parte delle colture miste S. cerevisiae-Z. florentinus e S. cerevisiae-L.
188

CAPITOLO 5 - DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
thermotolerans. Infatti alla temperatura di 20 °C la produzione di glicerolo in
entrambe le fermentazioni miste è maggiore rispetto alla produzione che si rileva alla
stessa temperatura per la fermentazione in coltura pura del solo S. cerevisiae. Tale
incremento, invece, non si registra alla temperatura di 30 °C, dove si ha una
produzione tendenzialmente più omogenea e più elevata di quella registrata a 20 °C.
In sintesi, dunque, la temperatura più bassa ha influenzato positivamente soprattutto
la fermentazione mista con L. thermotolerans, in modo particolare per l’aumento di
produzione di glicerolo, acido lattico, etil lattato, isoamil acetato e 2-feniletanolo; la
temperatura di 30 °C, invece, ha determinato un maggiore incremento di feniletil
acetato e 2-feniletanolo prodotti dalla coltura mista con Z. florentinus.
Lo scale-up delle fermentazioni miste controllate, condotte dalle combinazioni di
lieviti S. cerevisiae-Z. florentinus e S. cerevisiae-L. thermotolerans, è stato un passo
fondamentale per confermare i risultati ottenuti a livello di laboratorio. In tali prove
di vinificazione in rosso (con macerazione delle bucce) a livello semi-industriale
sono state in gran parte confermate sia l’evoluzione delle colture inoculate che le
caratteristiche analitiche impartite dai due ceppi di non-Saccharomyces in
fermentazioni miste, anche in presenza di una rilevante microflora spontanea (mosti
non pastorizzati). I risultati ottenuti dalle prove precedenti hanno avuto conferma da
questi ultimi dati, i quali sono stati corroborati dal fatto che il ceppo di S. cerevisiae
inoculato è risultato essere dominante sulla microflora saccaromicetica indigena e, in
questo modo, abbia contribuito significativamente al processo fermentativo.
L’analisi sensoriale effettuata sui vini (dopo fermentazione malolattica e
stabilizzazione) ottenuti nelle prove sperimentali su scala semi-industriale, ci ha
fornito ulteriori indicazioni sull’influenza e sul possibile impiego di tali lieviti
selezionati.
Le fermentazioni miste condotte inoculando lo Z. florentinus hanno prodotto vini con
un maggiore carattere floreale di quelli ottenuti dalla fermentazione in purezza con S.
cerevisiae, riflettendo il maggior contenuto di esteri etilici ed isoamilici rilevato dalle
analisi. Dalla valutazione complessiva di questi risultati è emerso che l’uso
controllato delle fermentazioni miste con Z. florentinus può dare un contributo
rilevante alla complessità e alle caratteristiche sensoriali dei vini.
189

CAPITOLO 5 - DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Le più intense note di speziato e la maggiore acidità, che hanno caratterizzato i vini
prodotti dalle fermentazioni miste con L. thermotolerans rispetto a quelle col solo S.
cerevisiae, confermano anche in questo caso la maggiore produzione di esteri amilici
ed isoamilici, di 2-feniletanolo e di acido lattico. Questa peculiare capacità
acidificante è di notevole interesse in campo enologico e può essere impiegata nella
correzione biologica di mosti e di vini con scarsa acidità, in quanto l’acido lattico è
un composto organico stabile e con un aroma piacevole, se presente nelle giuste
quantità. Quindi, oltre ad apportare miglioramenti dal punto di vista analitico e
sensoriale, le fermentazioni miste con L. thermotolerans possono essere impiegate
come pratiche preventive in mosti con bassa acidità e come tecniche correttive, che
prevedono il taglio dei vini con pH molto bassi con quelli caratterizzati da una
elevata concentrazione di acido lattico.
Le evidenze sperimentali fin qui ottenute sono di grande importanza in vista
dell’utilizzazione di colture selezionate di non-Saccharomyces in vinificazioni
multistarter controllate per un miglioramento della complessità e della qualità dei
vini.
In conclusione, si può affermare che l’uso controllato di colture starter di S.
cerevisiae e non-Saccharomyces è una strada utile per incrementare la complessità e
per migliorare le caratteristiche analitiche e sensoriali del vino.
Comunque, le interazioni tra le diverse colture starter durante la fermentazione, e le
modalità di inoculo, devono essere ulteriormente studiate e approfondite. Infatti, le
conoscenze riguardo le interazioni metaboliche tra ceppi S. cerevisiae e non-
Saccharomyces in vinificazione sono ancora limitate.
190

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