Antigeni piastrinospecifici: tipizzazione genomica ... - Bloodtransfusion

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Antigeni piastrinospecifici: tipizzazione genomica
mediante PCR-SSP e studio della distribuzione
in un gruppo di donatori di sangue
Tiziana Valentini, Alessandra Moscetti, Cesare Del Monte,
Monica Mei, Renata Rosati, Mirella Mariani, Manuela Testi
Centro Nazionale Trasfusione Sangue, Croce Rossa Italiana, Roma
(Direttore Dott. E. Mannella)
Human platelet antigens (HPA) are associated with
alloimmunization and play a major role in neonatal
alloimmune thrombocytopenia (NAIT), post
transfusional purpura (PTP), passive alloimmune
thrombocytopenia and transplantation-associated
thrombocytopenia and may contribuite to platelet
transfusion refractoriness. The biallelic polymorphism
of HPA system is known to be due to a substitution of a
single base pair.
The aim of the study was to genotype by PCR-SSP,
a group of 149 blood donors in the district of Rome
who accepted to become periodic platelet donors and
to investigate the frequencies of the HPA-1, -2, -3, -5 in
the population of Central Italy.
The observed gene frequencies fit the Hardy-
Weinberg equilibrium, and the calculated phenotype
frequencies are similar to those obtained in other
caucasian populations.
Parole chiave: antigeni piastrinici , PCR-SSP, tipizzazione
genomica, frequenza genica
Key words: platelet antigens, PCR-SSP, genomic typing,
gene frequency
Introduzione
L'immunizzazione verso gli antigeni piastrinici è la causa
di una serie di patologie trombocitopeniche, nelle quali gli
anticorpi provocano la distruzione delle piastrine con
conseguenti sindromi emorragiche.
Gli alloantigeni piastrinici sono stati messi in evidenza
Ricevuto: 20 giugno 2001 - Accettato: 26 luglio 2001
Dott.ssa Tiziana Valentini
Centro Nazionale Trasfusione Sangue
Croce Rossa Italiana
Via B. Ramazzini, 15
00151 Roma
in soggetti alloimmunizzati per mezzo degli alloanticorpi
diretti verso le strutture, geneticamente determinate, che
costituiscono la membrana piastrinica.
La produzione di questi anticorpi viene indotta in
seguito alla esposizione ad alloantigeni estranei in corso di
gravidanza o mediante trasfusioni di sangue 1 .
Gli alloantigeni presenti sulla membrana piastrinica sono
di due tipi: il primo comprende le glicoproteine del sistema
ABO e le molecole HLA di I classe 2 , il secondo raggruppa
gli alloantigeni definiti "specifici" delle piastrine: strutture
glicoproteiche (GPs) il cui legame con i rispettivi ligandi
permette il fenomeno della aggregazione piastrinica e le
prime fasi dell'emostasi.
Queste molecole sono localizzate nelle sezioni altamente
polimorfe delle glicoproteine di membrana (GPs) del gruppo
della superfamiglia delle integrine e sono caratterizzate dal
loro spiccato polimorfismo basato su singole sostituzioni
amminoacidiche 3 .
Ogni sistema antigenico é codificato da una coppia di
alleli codominanti secondo la nomenclatura proposta da
von dem Borne 4 , definiti dalla sigla HPA seguita da un
numero progressivo e da una lettera "a" o "b" attribuita
rispettivamente agli alleli ad alta o bassa frequenza. Nella
tabella I sono illustrati gli antigeni, le glicoproteine,
l'amminoacido sostituito e la sua posizione.
L'immunizzazione contro gli antigeni piastrinici
"specifici" è la causa primaria nella patogenesi della
Piastrinopenia Feto-Neonatale Alloimmune (NAIT), della
Porpora Post Trasfusionale (PTP), della Piastrinopenia
alloimmune passiva, della Piastrinopenia associata a
trapianto e può contribuire, infine, alla insorgenza della
Refrattarietà Post Trasfusionale nella quale sono coinvolti
anche gli anticorpi verso antigeni HLA di I classe.
In particolare la NAIT è caratterizzata da
trombocitopenia del feto e del neonato quando la madre si
immunizza contro alloantigeni ereditati dal padre.
LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 46 - num. 4 luglio-agosto 2001 (252-257)

Tipizzazione Ag piastrinici con PCR-SSP
Tabella I: sistemi antigenici piastrinici HPA-1, -2, -3 e -5
Antigene Glicoproteina Amminoacido Posizione
sostituito amminoacido
HPA - 1a GPIIIa leucina 33
HPA - 1b prolina 33
HPA - 2a GPIbα treonina 145
HPA - 2b metionina 145
HPA - 3a GPIIb isoleucina 843
HPA - 3b serina 843
HPA - 5a GPIa glutamina 505
HPA - 5b lisina 505
Nella popolazione caucasica gli anticorpi che si
riscontrano più frequentemente sono rivolti verso HPA-
1a, HPA-5b, HPA-3a e HPA-2b 5 .
La PTP è caratterizzata da una drammatica
trombocitopenia che insorge dopo 5 - 10 giorni dalla
trasfusione in pazienti già sensibilizzati da precedenti
trasfusioni o gravidanze.
Gli anticorpi più coinvolti nella popolazione europea
sono anti HPA-1a,-1b, HPA-3a e -3b. Nella altre sindromi
sono presenti più frequentemente anticorpi anti HPA-1a,-
1b e HPA-5b 6 .
Lo studio dei fenotipi HPA veniva eseguito fino a
qualche tempo fa solo da centri particolarmente specializzati
con uso di alloantisieri piastrino-specifici; più recentemente
sono state introdotte tecniche di genotipizzazione
molecolare che hanno contribuito anche allo studio
dell'origine dei polimorfismi piastrinici.
In particolare l'applicazione della Polymerase Chain
Reaction (PCR) con l'uso di primers sequenza specifici,
permette di amplificare le regioni del genoma responsabili
delle informazioni per le zone polimorfe degli antigeni
piastrinici.
Scopo dello studio
Seguendo come strategia trasfusionale la specifica
selezione di unità piastriniche più adeguate ai pazienti
alloimmunizzati o refrattari, abbiamo avviato uno studio di
tipizzazione genomica dei maggiori sistemi piastrinici HPA-
1, -2, -3, -5 in un gruppo di donatori di piastrine da aferesi
afferenti al nostro Centro al fine di reperire fenotipi "rari"
destinati ai pazienti con patologie strettamente associate
alla alloimmunizzazione piastrinica per polimorfismi HPA.
Secondariamente, ci si è prefissi di analizzare i fenotipi
piastrinici nella popolazione di Roma e provincia in un
gruppo di soggetti non correlati, di studiarne le frequenze
genotipiche e geniche così da verificare se la loro
distribuzione è in equilibrio secondo la legge di Hardy-
Weinberg.
Materiali e metodi
Sono stati tipizzati, per i sistemi antigenici HPA -1, -2 ,
-3, -5, 149 donatori di piastrine. La tipizzazione dell'HPA-4 è
stata esclusa considerando il carattere ubiquitario dell'HPA-
4a nella popolazione caucasica e, di conseguenza, la sua
irrilevante importanza clinica.
Per lo studio genotipico é stata applicata la metodica di
Polymerase Chain Reaction-Primers Sequenza Specifici
(PCR-SSP). Il metodo si basa sul principio secondo il quale
un primer completamente matched viene impiegato nella
reazione di PCR in maniera più efficiente rispetto ad un
primer con uno o più mismatches nella sua estremità 3'.
Le coppie di primers utilizzate sono state disegnate in
modo tale da essere perfettamente complementari, nella
estremità 3', ad ogni singolo allele. I frammenti amplificati
sono stati separati mediante elettroforesi su gel di agarosio
in presenza di bromuro di etidio, esposti a luce ultravioletta
e fotografati. La positività o negatività della reazione
indicava la presenza o meno di quell'allele nell'individuo
tipizzato. Come controllo dell'efficienza dell'amplificazione,
sono stati impiegati, all'interno di ogni miscela, dei primers
specifici per il gene dell'ormone della crescita (HGH).
Tali primers, amplificando un frammento presente in
ogni campione di DNA, fungevano da controllo positivo
della reazione: l'assenza di un prodotto di amplificazione
segnalava un'eventuale inibizione della Taq o comunque
un "non funzionamento" della reazione di amplificazione
stessa.
Nella figura 1 è illustrato lo schema delle possibili
amplificazioni nei soggetti omo- ed eterozigoti con la
grandezza del prodotto espressa in paia di basi.
Fasi della metodica:
- estrazione del DNA: il DNA genomico è stato isolato da
sangue intero in EDTA, mediante metodo del Salting Out 7 ;
- PCR-SSP: sono stati utilizzati i primers specifici descritti
da Skogen et al. 8 (Amersham Pharmacia Biotech, Italia);
le concentrazioni finali dei primers sono state 0,5μM
per HPA-1 e HPA-2 , per HPA-3 e HPA-5 1,25μM e 1,5μM
rispettivamente (anziché 1mM e 0,5mM come nel lavoro
originale). I primers impiegati per il controllo interno
(HGH) sono stati: 1S-2AS alle concentrazioni di 0,2μM
( anziché 0,1μM) per la tipizzazione HPA-1, -2, -3 e il 3S-
4AS alla concentrazione di 0,075μM (anziché 0,05μM)
per la tipizzazione HPA-5.
Nella tabella II sono riportate le sequenze, le
concentrazioni dei primers specifici, le concentrazioni dei
primers dei controlli interni nonché i parametri modificati
rispetto al lavoro originale 8 .
Per ogni soggetto da tipizzare sono state preparate otto
provette contenenti ciascuna i primers specifici per le regioni
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Figura 1- Tipizzazione molecolare degli antigeni piastrinici attraverso la metodica di PCR-SSP
Tabella II: sequenze dei primers per HPA-1,-2,-3 e -5
HPA Specificità Sequenza Concentrazione Controllo
finale (mM) HGH
HPA-1 a 5’ CTTACAGGCCCTGCCTCT 3’ 0,5
b 5’ CTTACAGGCCCTGCCTCC 3’ 0,5 1S -2AS
common 5’ TGCTTCAGGTCTCTCCCC 3’ 0,5 (0,2 mM) (*)
HPA-2 a 5’ CCCCCAGGGCTCCTGAC 3’ 0,5
b 5’ CCCCCAGGGCTCCTGAT 3’ 0,5 1S-2AS
common 5’ GCAGCCAGCCGACGAAAATA 3’ 0,5 (0,2 mM) (*)
HPA-3 a 5’ GGACTGGGCTGCCCAT 3’ 1,25 (*)
b 5’ GGACTGGGCTGCCCAG 3’ 1,25 (*) 1S-2AS
common 5’ AGTGCTCCCAGGGACCAAG 3’ 1,25 (*) (0,2 mM) (*)
HPA-5 a 5’ ACCTGTTTACTATCAAAG 3’ 1,5 (*)
b 5’ TACCTGTTTACTATCAAAA 3’ 1,5 (*) 3S-4AS
common 5’ GGCAGTACACTATACATTCA 3’ 1,5 (*) (0,075 mM) (*)
(*) condizioni modificate dal metodo di Skogen et al. 8
genomiche di ciascun allele in presenza dei primers di controllo,
in un volume di 5μL. A ciascuna microprovetta venivano poi
aggiunti 5μL della miscela di reazione così costituita:
Miscela di reazione:
- DNA 200-500ng;
- Taq DNA polimerasi Gold (Perkin Elmer, New Jersey,
USA) 1,5 unità;
- PCR buffer 10x (500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH 8,3
allo 0,01% w/v di gelatina);
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T. Valentini et al.
- MgCl 2 1,5mM (HPA-1,-2,-3);
3,5mM (HPA-5a);
2,5mM (HPA-5b);
- dNTP 0,2μM;
- glicerolo 10%;
- rosso cresolo 0,2 mg/mL.
Amplificazione: é stato utilizzato il Thermal Cycler
Geneamp PCR System 9600 (Perkin Elmer).
Le condizioni di amplificazione sono illustrate in

Tipizzazione Ag piastrinici con PCR-SSP
Tabella III: parametri di amplificazione
HPA-1
HPA-2
HPA-3 HPA-5
attivazione 95 °C - 15' 95 °C - 15' 95 °C - 15'
denaturazione 94 °C - 30'’ 94 °C - 30'’ 94 °C - 30'’
annealing 65 °C - 1' 67 °C - 1’ 30'’* 57 °C - 1'
estensione 72 °C - 30'’ 72 °C - 30'’ 72 °C - 30'’
(n° 32 cicli) (n° 34 cicli)* (n° 34 cicli)*
estensione
finale
72 °C - 10' 72 °C - 10' 72 °C - 10'
* condizioni modificate dal metodo di Skogen et al. 8
dettaglio nella tabella III; la figura 2 mostra il gel finale con
i prodotti di amplificazione di soggetti omozigoti ed
eterozigoti per ciascun sistema.
Analisi Statistiche
Per stabilire se i genotipi del nostro gruppo fossero in
equilibrio, abbiamo saggiato le differenze tra individui
osservati e quelli attesi; la distribuzione delle frequenze
geniche riscontrate nel nostro campione è stata comparata
con quelle attese calcolate secondo la legge di Hardy-
Weinberg, usando il test del chi quadro (χ 2 ), per ciascuno
dei quattro sistemi piastrinici tipizzati.
Risultati
Le frequenze genotipiche osservate nelle nostra
popolazione per i quattro sistemi piastrinici studiati sono
mostrate nella tabella IV.
Le percentuali più elevate risultano quelle dei genotipi
HPA-1a/1a (65,8%), HPA2a/2a (81,2%), HPA-3a/3b (51,0%);
HPA-5a/5a (80,6%), mentre quelle più basse sono dei
soggetti omozigoti per l'allele "b" di tutti i sistemi: 4,7% per
HPA-1b/1b, 2% per HPA-2b/2b, 8,1% per HPA-3b/3b ed
infine 1,3% per HPA-5b/5b.
Con le frequenze geniche riscontrate è stato calcolato il
valore del chi quadro (χ 2 ): la non significativà dimostra che
i sistemi genetici biallelici studiati sono in equilibrio,
secondo la legge di Hardy-Weinberg, e quindi assortiti in
maniera indipendente.
Discussione
L'applicazione delle nuove tecnologie di biologia
molecolare ha permesso la tipizzazione dei maggiori sistemi
piastrinici e l'approfondimento di quei polimorfismi in grado
di evocare risposte immunitarie nelle patologie piastriniche
da alloimmunizzazione. Il vantaggio nell'uso di tali metodiche
è dato dalla possibilità di tipizzare anche soggetti con scarso
numero di piastrine come lo sono i pazienti affetti da
trombocitopenia ed i neonati, nei quali la tipizzazione
piastrinica risulta particolarmente difficile con metodi
sierologici.
La metodica di PCR-SSP, dopo essere stata ottimizzata,
si è dimostrata nel nostro laboratorio affidabile e
relativamente rapida, permettendoci in breve tempo di
costituire un pool di donatori tipizzati, e rendendo, così,
disponibili in tempi rapidi unità piastriniche compatibili
estremamente rare da utilizzare nelle patologie quali la NAIT
e PTP.
Il confronto tra i nostri dati e quelli delle frequenze degli
alloantigeni piastrinici nelle diverse popolazioni caucasiche
descritte in letteratura 9-14 (Tabella V) mostra per tutti i
sistemi piastrinici una differenza non statisticamente
significativa tra le nostre frequenze e quelle di gruppi
europei (p > 0,05); mentre il confronto tra la media delle
frequenze nella popolazione caucasica con la popolazione
bianca americana e giapponese presenta una differenza
altamente significativa per HPA-1b (p < 0,001).
Le tecniche di biologia molecolare già ampiamente
sperimentate risultano, per le loro caratteristiche di
affidabilità e per il basso costo, adatte alla tipizzazione
piastrinica di un vasto numero di campioni.
È, quindi, auspicabile un'estensione di tale approccio a
pazienti politrasfusi in generale e alle donne in gravidanza
a rischio alloimmunizzazione.
Riassunto
Gli alloantigeni piastrinici (HPA) hanno una
rilevanza clinica in patologie da alloimmunizzazione
piastrinica quali la Piastrinopenia feto-neonatale
alloimmune, la Porpora post trasfusionale e possono
contribuire all'insorgenza di altri disordini di
refrattarietà piastrinica.
Lo studio genotipico attraverso la metodica della
PCR -SSP, rappresenta una metodica affidabile che è stata
utilizzata in questo lavoroper la tipizzazione di donatori
di aferesi del nostro Centro Trasfusionale.
I gruppi piastrinici HPA-1, -2, -3, -5 studiati presentano
frequenze che non si discostano in maniera statisticamente
significativa da quelle riportate in letteratura nelle
popolazioni di origine caucasica.
L'applicazione della tipizzazione genomica
piastrinica può rappresentare un valido supporto per
un'adeguata terapia e profilassi trasfusionale nei pazienti
alloimmunizzati.
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Figura 2- Risultato della PCR-SSP di soggetti omo- ed eterozigoti per HPA-1,-2,-3,-5
256
T. Valentini et al.

Tipizzazione Ag piastrinici con PCR-SSP
Tabella IV: distribuzione delle frequenze di HPA-1, -2, -3 e -5 in 149 donatori di Roma e provincia
Sistema Numero di Frequenze Antigene Frequenze Frequenze Equilibrio
Antigenico individui genotipiche HPA antigene geniche Hardy-Weinberg
osservati (%) (%) χ2 p*
HPA - 1 a/a 98 65,8 HPA-1a 95,3 0,805
a/b 44 29,5 0,538 0,46
b/b 7 4,7 HPA-1b 34,2 0,195
HPA - 2 a/a 121 81,2 HPA-2a 98,0 0,896
a/b 25 16,8 1,491 0,22
b/b 3 2,0 HPA-2b 18,8 0,104
HPA - 3 a/a 62 40,9 HPA-3a 91,3 0,664
a/b 74 51,0 1,914 0,17
b/b 13 8,1 HPA-3b 58,4 0,336
HPA - 5 a/a 120 80,6 HPA-5a 98,7 0,896
a/b 27 18,1 0,124 0,72
b/b 2 1,3 HPA-5b 19,5 0,104
* χ2 è il valore ottenuto dalla comparazione individui osservati vs. attesi. Gradi di libertà = 1; p ≥ 0,05 non significativo
Tabella V: frequenze (%) degli alloantigeni piastrinici nelle diverse popolazioni
Sistema Gruppo Popolazione Popolazione Popolazione Popolazioni Extraeuropee
HPA studiato tedesca 9 danese 10 finnica 11 USA (bianchi) 12 Giappone 13,14
1a 95,3 97,9 96,6 99,0 98,0 100,0
1b 34,2 28,8 30,3 26,5 20,0 0,3
2a 98,0 100,0 99,4 99,0 97,0 99,2
2b 18,8 13,2 15,9 16,5 15,0 19,7
3a 91,3 81,0 88,3 83,5 88,0 85,1
3b 58,4 69,8 63,2 66,5 54,0 66,2
5a 98,7 100,0 100,0 99,5 98,0 99,0
5b 19,5 19,7 15,7 10,0 21,0 7,0
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