UNIVERSITA' DI ROMA “LA SAPIENZA” - Padis
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UNIVERSITA’ <strong>DI</strong> <strong>ROMA</strong> <strong>“LA</strong> <strong>SAPIENZA”</strong><br />
DOTTORATO <strong>DI</strong> RICERCA IN SCIENZE <strong>DI</strong> SANITÀ<br />
PUBBLICA E MICROBIOLOGIA<br />
CURRICULUM: MICROBIOLOGIA E PARASSITOLOGIA<br />
CICLO: XXIII<br />
RISPOSTA IMMUNITARIA UMANA AD ANTIGENI<br />
SALIVARI <strong>DI</strong> ANOPHELES: POSSIBILE UTILIZZO QUALI<br />
MARCATORI <strong>DI</strong> ESPOSIZIONE A VETTORI MALARICI<br />
CINZIA RIZZO<br />
DOCENTI GUIDA COOR<strong>DI</strong>NATORE<br />
DOTT. BRUNO ARCÀ PROF. GIANFRANCO TARSITANI<br />
PROF. DAVID MO<strong>DI</strong>ANO
Indice<br />
1 Introduzione ...................................................................................................................... 4<br />
1.1 La Malaria e i vettori ................................................................................................... 4<br />
1.2 I protagonisti della malattia ......................................................................................... 5<br />
1.2.1 L’uomo .................................................................................................................. 5<br />
1.2.2 Il vettore ................................................................................................................ 6<br />
1.2.3 Il plasmodio ........................................................................................................... 7<br />
1.3 Ciclo biologico ............................................................................................................. 9<br />
1.3.1 Il plasmodio nell’uomo: ciclo esoeritrociario ..................................................... 10<br />
1.3.2 Il plasmodio nell’uomo: fase eritrocitaria ........................................................... 10<br />
1.3.3 Il plasmodio nell’Anofele: fase sporogonica ...................................................... 11<br />
1.4 Clinica ........................................................................................................................ 13<br />
1.5 Strategie e bersagli nella lotta antimalarica ............................................................... 14<br />
1.6 Epidemiologia ............................................................................................................ 20<br />
1.6.1 Vettore idoneo ..................................................................................................... 20<br />
1.6.2 Indici entomologici di trasmissione .................................................................... 22<br />
1.6.2.1 Tasso di Inoculazione Entomologica ............................................................ 22<br />
1.6.2.2 Tasso di Riproduzione di Macdonald ........................................................... 23<br />
1.6.2.3 Capacità vettrice ........................................................................................... 25<br />
1.6.2.4 Indice di stabilità .......................................................................................... 25<br />
1.6.3 Indici parassitologici di trasmissione .................................................................. 26<br />
1.6.4 Indicatori sierologi di trasmissione ..................................................................... 28<br />
1.7 Interazione zanzara-ospite ......................................................................................... 30<br />
1.7.1 Le ghiandole salivari e la saliva .......................................................................... 30<br />
1.7.2 Risvolti applicativi dello studio sulle ghiandole salivari .................................... 32<br />
1.7.3 gSG6 (gambiae Salivary Gland protein 6) .......................................................... 36<br />
1.7.4 Anophelin/cE5 ..................................................................................................... 38<br />
2 Scopo della tesi ................................................................................................................ 40<br />
3 Materiali e Metodi .......................................................................................................... 42<br />
3.1 Area di studio e popolazione ..................................................................................... 42<br />
3.2 Osservazioni entomologiche ...................................................................................... 43<br />
3.3 Espressione e purificazione di proteine salivari ........................................................ 44<br />
3.4 ELISA ........................................................................................................................ 44<br />
2
3.5 Analisi statistica ......................................................................................................... 45<br />
4 Risultati e discussioni ..................................................................................................... 47<br />
4.1 Espressione e purificazione di gSG6 di An. gambiae ................................................ 47<br />
4.2 Densità anofeliche nei due villaggi campionati ......................................................... 49<br />
4.3 Analisi della risposta IgG anti- gSG6 di An. gambiae ............................................... 51<br />
4.3.1 Immunogenicità di gSG6 .................................................................................... 51<br />
4.3.2 Variazione del titolo anticorpale in accordo alla stagione di trasmissione ......... 53<br />
4.3.3 Risposta anticorpale alla proteina salivare gSG6 nei due gruppi etnici: Mossi e<br />
Fulani ............................................................................................................................ 56<br />
4.3.4 Variazione del titolo anticorpale con l’età .......................................................... 61<br />
4.4 Analisi delle sottoclassi IgG1 e IgG4 anti- gSG6 di An. gambiae ............................ 70<br />
4.4.1 Variazione stagionale dei livelli di IgG1 e IgG4................................................. 70<br />
4.4.2 Differenze inter-etnica dei livelli di IgG1 e IgG4 ............................................... 73<br />
4.4.3 Variazione dei titoli di IgG1 e IgG4 con l’età ..................................................... 74<br />
4.5 Analisi comparativa della risposta IgG alla proteina salivare gSG6 di Anopheles<br />
funestus e di Anopheles gambiae ..................................................................................... 78<br />
4.5.1 Espressione e purificazione di gSG6 di Anopheles funestus ............................... 78<br />
4.5.2 Immunogenicità di gSG6 di An.funestus ............................................................. 80<br />
4.5.3 Variabilità stagionale della risposta a gSG6 di An.funestus ................................ 82<br />
4.5.4 Confronto della risposta anticorpale ai tre marcatori .......................................... 82<br />
4.6 Analisi della risposta anticorpale alla proteina salivare: anofelina ............................ 84<br />
4.6.2 Immunogenicità dell’anofelina ........................................................................... 84<br />
4.6.3 Confronto della risposta anticorpale all’anofelina e a gSG6 di An. gambiae ..... 85<br />
4.6.4 Differenze di sensibilità tra anofelina e gSG6 .................................................... 87<br />
5 Conclusioni ...................................................................................................................... 90<br />
6 Bibliografia ...................................................................................................................... 93<br />
3
1.1 La Malaria e i vettori<br />
1 Introduzione<br />
Definita "mal’aria" in seguito alla credenza popolare che venisse trasmessa dai miasmi<br />
delle paludi, la malaria, insieme alla tubercolosi e all’AIDS, rappresenta oggi una delle<br />
principali emergenze sanitarie al mondo. Valutare la reale diffusione di questa parassitosi<br />
in maniera accurata è molto difficile a causa della sintomatologia, molto simile a quella di<br />
altre malattie infettive, e della mancanza di un controllo assoluto sui decessi che nella<br />
maggior parte dei casi avviene in casa, senza ricovero ospedaliero. Nonostante ciò,<br />
secondo i dati dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), nel 2008 sono stati<br />
stimati circa 250 milioni di casi di malaria in tutto il mondo. Di questi la maggior parte si<br />
verifica nelle regioni Africane (85%), a cui fanno seguito il Sud-Est Asiatico (10%) e le<br />
regioni orientali del Mediterraneo (4%). E’ a rischio di malaria oltre il 40% della<br />
popolazione che vive in più di 100 aree endemiche del mondo, situate nella fascia tropicale<br />
e sub-tropicale del pianeta (Africa Sub-Sahariana, Asia ed America del Sud) (Fig. 1.1).<br />
Inoltre, sono stati stimati circa 850.000 decessi per malaria, di cui l’89% si verifica<br />
nell'Africa sub-sahariana, e la maggior parte di questi avvengono tra i bambini al di sotto<br />
dei cinque anni di età (World Malaria Report, WHO 2009).<br />
Figura 1.1 Distribuzione mondiale del rischio di trasmissione di malaria<br />
(World Malaria Report, WHO 2009)<br />
4
1.2 I protagonisti della malattia<br />
Da sempre la diffusione della malaria è stata influenzata da un intreccio di fattori che ha<br />
come protagonisti i tre organismi coinvolti nel ciclo di trasmissione: l’uomo, la zanzara e il<br />
plasmodio. Le recenti conoscenze scientifiche hanno permesso di chiarire quali siano le<br />
basi di tale relazione, e identificare in che modo fattori quali la biologia e il<br />
comportamento di una specie di Anopheles, la biologia dei plasmodi, fattori ambientali,<br />
caratteristiche genetiche, socio economiche e culturali della popolazione abbiano<br />
condizionato la diffusione della malattia.<br />
1.2.1 L’uomo<br />
La malaria è una malattia antichissima, da sempre legata alla storia dell'Uomo.<br />
Reperti archeologici indicano che la malaria era già presente a partire dal III- IV millennio<br />
a.C. I cambiamenti introdotti dall’uomo nell’ambiente nel corso della sua storia<br />
influenzarono la diffusione delle zanzare vettrici e dei plasmodi da esse trasmessi,<br />
causando ripercussioni spesso considerevoli sullo sviluppo delle civiltà umane. Il<br />
passaggio da una società composta da cacciatori-raccoglitori ad una di coltivatori segnò<br />
una svolta nell’epidemiologia della malaria: le forme più gravi della malattia comparvero<br />
infatti solo con l’emergere delle prime organizzazioni sedentarie, tra 5.000 e 10.000 anni fa<br />
(Coluzzi, 1999). Abbattendo le foreste per coltivare i campi, l’uomo creò le condizioni per<br />
la diffusione di quelle anofeli che deponevano le uova in piccole raccolte di acqua<br />
soleggiate e alcune specie, come Anopheles gambiae in Africa, avrebbero sviluppato una<br />
stretta associazione con l’uomo diventando particolarmente efficaci nella trasmissione dei<br />
plasmodi umani. Il salto tecnologico-culturale legato allo sviluppo agricolo determinò una<br />
eccezionale disponibilità alimentare, determinando un picco di crescita demografica delle<br />
comunità umane. Ciò ha condizionato fortemente l’epidemiologia della malaria,<br />
permettendo una costante diffusione della malattia negli insediamenti umani. Le successive<br />
migrazioni e guerre tra diverse civiltà, così come le esplorazioni e gli scambi commerciali,<br />
favorirono infine la diffusione della malaria dai suoi primi focolai africani ed asiatici alle<br />
regioni europee e, in ultimo, nelle Americhe (Corbellini G, 1998). Da un punto di vista<br />
socio-economico, la malaria è al tempo stesso causa e conseguenza di povertà: numerose<br />
nazioni africane non hanno a disposizione infrastrutture e risorse necessarie per<br />
organizzare campagne antimalaria sostenibili (Sachs and Malaney, 2002). Inoltre, lo<br />
sviluppo economico in paesi con alta trasmissione di malaria è stato storicamente più basso<br />
5
ispetto ad altre nazioni. La malaria ha anche un grande impatto sulle risorse umane delle<br />
regioni colpite: non solo i suoi effetti si esprimono in morti premature ma, nei soggetti che<br />
sopravvivono ad un attacco grave, si hanno inoltre danni neurologici, in genere sub clinici<br />
e permanenti che spesso sono causa di ridotte capacità cognitive. Di conseguenza, la<br />
mancata produttività a causa della malattia e della morte prematura, così come gli ostacoli<br />
all'educazione dei bambini e allo sviluppo sociale, determinano un quadro sfavorevole per<br />
lo sviluppo di queste nazioni. Ciò significa che gran parte del potenziale intellettuale di<br />
queste popolazioni viene perso, contribuendo fortemente al mancato sviluppo culturale ed<br />
economico che, a loro volta, alimentano la malattia instaurando un drammatico circolo<br />
vizioso.<br />
1.2.2 Il vettore<br />
Le zanzare vettrici della malaria umana, dal punto di vista sistematico sono insetti<br />
olometaboli appartenenti all’Ordine Diptera, Famiglia Culicidae, Sottofamiglia<br />
Anophelinae, Genere Anopheles (Fig. 1.2).<br />
Figura 1.2 Anopheles gambiae<br />
(http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/09262002/00008/A.gambiae.1354.p_lores.jpg)<br />
La famiglia Culicidae comprende più di 3000 specie raggruppate in Sottofamiglie di cui le<br />
principali sono le Anophelinae e Culicinae. Queste, oltre a svolgere la loro attività di<br />
ectoparassiti ematofagi, comprendono specie di enorme rilevanza per la medicina umana e<br />
veterinaria in quanto vettori di Virus, Protozoi e Nematodi parassiti. La femmina, dopo<br />
essere stata fecondata, inizia l’attività di ectoparassita ematofago, alla ricerca di ospiti<br />
vertebrati da pungere per poter portare a termine lo sviluppo delle uova e la conseguente<br />
ovodeposizione. I maschi invece, non sono ematofagi e si nutrono esclusivamente di succhi<br />
6
zuccherini di origine vegetale. Le femmine di Anopheles depongono le uova generalmente<br />
in raccolte d'acqua stagnante. Dopo un paio di giorni le uova schiudono liberando piccole<br />
larve acquatiche che respirano aria atmosferica mediante un paio di spiracoli posti<br />
sull’addome. Dopo 4 stadi larvali, si sviluppa una pupa da cui si forma l'insetto adulto. In<br />
media i maschi vivono pochi giorni, mentre le femmine due o più settimane. Dal punto di<br />
vista morfologico, i culicidi presentano un capo con due grandi occhi composti e dotato di<br />
due antenne allungate costituite da 15 segmenti. Nei maschi tali antenne sono assai visibili<br />
e presentano un aspetto piumoso, sono infatti coperte da setole piuttosto lunghe. Nelle<br />
femmine le antenne risultano assai meno appariscenti, essendo ricoperte da setole<br />
nettamente più corte. I pezzi boccali dell’apparato pungente-succhiante di questi insetti<br />
consistono di un’epifaringe, un’ipofaringe, due mandibole e due mascelle modificate in 4<br />
stiletti adattati alla perforazione della cute dell’ospite. Il dotto salivare è costituito da un<br />
sottile canale addossato all’ipofaringe, mentre il canale alimentare in cui scorre il sangue<br />
prelevato dall’ospite è formato da epifaringe ed ipofaringe unite tra loro. Tutti questi pezzi<br />
formano un fascicolo che durante la puntura va ad infilarsi nel vaso sanguigno. Il fascicolo<br />
è contenuto all’interno della guaina morbida con funzione protettiva formata dal labbro<br />
inferiore (labium). Questa, durante il pasto di sangue, si piega a formare un’ansa,<br />
permettendo così al fascicolo di penetrare nell’ospite. Al capo segue il torace, suddiviso in<br />
protorace, mesotorace e metatorace. Le ali si inseriscono nel mesotorace, mentre i bilanceri<br />
nel metatorace. Ogni segmento toracico, inoltre, porta un paio di zampe pentarticolate.<br />
L’addome è lungo e sottile e termina con un apparato copulatore nell’ultimo segmento<br />
addominale.<br />
1.2.3 Il plasmodio<br />
La malaria è causata da Protozoi appartenenti al Phylum Apicomplexa. Questo Phylum<br />
comprende circa 5000 specie di parassiti endocellulari caratterizzati dalla presenza di un<br />
complesso apicale coinvolto nell’invasione cellulare e di un apicoplasto, un organello con<br />
quattro membrane simile al plastidio derivante da un evento endosimbiontico secondario.<br />
Quest’organello è coinvolto nel metabolismo lipidico e nella formazione del vacuolo<br />
parassitoforo. Inoltre, risulta essenziale per la sopravvivenza del parassita in quanto la sua<br />
distruzione previene l’invasione di nuove cellule dell’ospite. Il complesso apicale<br />
comprende vescicole citoplasmatiche, roptrie e micronemi, che secernono proteine di<br />
adesione ed enzimi litici coinvolti nell’invasione cellulare. Inoltre, è presente un conoide<br />
7
con al suo interno dei microtubuli a forma di serpentina, che permettono la motilità e la<br />
penetrazione all’interno della cellula ospite (Fig. 1.3).<br />
Figura 1.3 Rappresentazione schematica di un parassita<br />
protozoo appartenente al Phylum degli Apicomplexa (Ajioka<br />
et al., 2001)<br />
Si suppone che la storia evolutiva dell’agente eziologico della malaria, il plasmodio,<br />
preceda di milioni d’anni la comparsa dell’uomo. Una delle ipotesi più accreditate a tal<br />
riguardo suppone che il plasmodio discenda da parassiti delle cellule intestinali di gorilla<br />
(Cohen, 2010). Molto probabilmente, questi si propagavano attraverso la produzione di<br />
sporocisti emesse con le feci e in grado di resistere nell’ambiente esterno. Adattatisi a<br />
vivere nelle cellule degli organi interni e poi nel sangue, i parassiti dovettero trovare un<br />
sistema differente per passare da un ospite all’altro, adottando, come vettore, un insetto<br />
succhiatore di sangue quale la zanzara.<br />
Attualmente si conoscono quasi 200 specie di plasmodi che infettano, oltre all’uomo e agli<br />
altri primati, anche i roditori, gli uccelli e i rettili, appartenenti in tutti i casi alla Classe<br />
Sporozoa, Ordine Eucoccidiida, Famiglia Plasmodiidae Genere Plasmodium. Le quattro<br />
specie di Plasmodi in grado di parassitare l’uomo (Plasmodium falciparum, P. vivax, P.<br />
ovale e P. malariae) hanno cicli sostanzialmente simili; le principali differenze si<br />
riferiscono alla velocità dei processi moltiplicativi, al numero di parassiti prodotti in ogni<br />
fase di replicazione e alla patogenicità per l’uomo. Tuttavia, recentemente nel Borneo<br />
malaysiano, sono stati riportati dei casi di malaria umana trasmessi da P. knowlesi, un<br />
parassita che causa la malaria nei macachi (Singh et al., 2004). Queste specie presentano<br />
una distribuzione variabile: P. falciparum è principalmente diffuso nell’Africa sub-<br />
sahariana; P. vivax, invece, è maggiormente presente in Asia, America centrale e<br />
8
meridionale; P. malariae e P. ovale sono molto meno frequenti in Africa. Inoltre, P. ovale è<br />
distribuito anche in Papua Nuova Guinea e nelle Filippine (Tab 1)(Carter and Mendis,<br />
2002).<br />
1.3 Ciclo biologico<br />
Tabella 1 Distribuzione delle specie di Plasmodium nel mondo<br />
(Carter and Mendis, 2002)<br />
Come accennato precedentemente, la malaria umana è una malattia infettiva<br />
causata da quattro specie di protozoi con cicli dixeni in cui l’ospite intermedio è l’uomo e<br />
l’ospite definitivo è una zanzara appartenente al genere Anopheles. L'Uomo contrae la<br />
malattia in seguito alla puntura infettante della zanzara, che a sua volta si è infettata<br />
pungendo una persona nel cui sangue circolavano gli stadi infettanti del parassita.<br />
Lo sviluppo del parassita prevede il passaggio attraverso le seguenti fasi (Fig. 1.4):<br />
ciclo esoeritrocitario;<br />
ciclo eritrocitario;<br />
ciclo sporogonico.<br />
Figura 1.4 Ciclo biologico di Plasmodium falciparum (Pasvol, 2010).<br />
9
1.3.1 Il plasmodio nell’uomo: ciclo esoeritrociario<br />
L’infezione nell’uomo inizia quando una femmina di zanzara infetta punge l’uomo<br />
per compiere il pasto di sangue iniettando nel sistema circolatorio, insieme alla saliva, il<br />
parassita allo stato di sporozoita. Gli sporozoiti raggiungono quindi il parenchima epatico e<br />
invadono gli epatociti. Qui si accrescono in trofozoiti consumando poco a poco la cellula<br />
ospite. Dopo circa una settimana i trofozoiti si moltiplicano per schizogonia,<br />
trasformandosi in schizonti, in cui si divide il nucleo ma non il citoplasma. Quindi, dopo<br />
un periodo di maturazione che va dai 5 ai 12 giorni, a seconda delle specie di Plasmodio, lo<br />
schizonte maturo dà origine a migliaia di merozoiti unicellulari che, a questo punto, sono<br />
in grado di abbandonare il fegato e infettare direttamente gli eritrociti nel torrente<br />
sanguigno. Nel caso l’infezione sia dovuta a P. falciparum o P. malariae, dopo la fase<br />
schizogonica epatica inizia direttamente la fase ematica del ciclo. Questa modalità diretta<br />
può provocare “recrudescenze”, cioè manifestazioni cliniche successive al primo attacco,<br />
dovute a Plasmodi ancora presenti nel sangue. Non tutte le specie di Plasmodium seguono<br />
però questa modalità lineare di sviluppo. Infatti, gli sporozoiti di P. vivax e P. ovale<br />
possono restare quiescenti all’interno degli epatociti ("ipnozoiti") e riprendere lo sviluppo a<br />
distanza di mesi, causando quelle che vengono definite "recidive".<br />
1.3.2 Il plasmodio nell’uomo: fase eritrocitaria<br />
I parassiti compaiono nel sangue periferico dopo 7-15 giorni dall’inoculazione degli<br />
sporozoiti, a seconda della specie. I merozoiti formatisi nelle cellule epatiche penetrano nei<br />
globuli rossi ma restano in contatto con il plasma sanguigno attraverso il dotto<br />
parassitoforo, un canale delimitato da una membrana fospolipidica (Pouvelle et al., 1991).<br />
Dentro l’emazia si trasformano in trofozoiti, dotati di un vacuolo digestivo, e iniziano a<br />
sovvertire tutte le funzioni del globulo rosso: i parassiti si accrescono metabolizzando per<br />
glicolisi il glucosio del sangue e utilizzando fattori di crescita e ADP presenti<br />
nell’eritrocita. Il globulo rosso infettato aumenta di 50-100 volte il consumo di glucosio<br />
con produzione di acido lattico mentre la fonte di azoto è rappresentata dalla parte proteica<br />
dell’emoglobina. Gli eritrociti infetti scompaiono dal sangue periferico e vengono<br />
sequestrati nei capillari degli organi interni (cervello, intestino, ecc.), così da sfuggire alla<br />
distruzione nella milza, fenomeno chiamato “citoaderenza”. Il trofozoita si accresce<br />
all’interno del globulo rosso fino alla fase successiva di schizonte che, a maturazione,<br />
10
produrrà altri merozoiti, in numero variabile da 4 a 32 a seconda della specie di<br />
Plasmodium.<br />
A questo punto il globulo rosso si gonfia rapidamente fino a scoppiare liberando così nel<br />
circolo sanguigno i merozoiti che, a questo punto, possono penetrare in altri globuli rossi<br />
riprendendo la moltiplicazione schizogonica (Fig. 1.5).<br />
Figura 1.5 Globulo rosso infetto da merozoiti<br />
(http://www.smccd.edu/accounts/case/malaria/malaria_rbc.jpg)<br />
Quando l’uomo inizia a produrre anticorpi anti-plasmodio, il parassita cessa di<br />
moltiplicarsi e la morfologia cambia: iniziano a formarsi le forme sessuate che daranno<br />
origine ai gametociti maschili (microgametociti) e femminili (macrogametociti); questi<br />
resteranno nel globulo rosso in attesa che un anofele vettrice punga l’ospite infetto,<br />
ingerendoli con il pasto di sangue.<br />
1.3.3 Il plasmodio nell’Anofele: fase sporogonica<br />
Nell’apparato digerente del dittero i gametociti abbandonano l’eritrocita e si<br />
trasformano nelle forme sessuate mature (macro- e micro-gameti). La fecondazione del<br />
macrogamete ad opera del microgamete, avviene nell’arco di circa un’ora dall’infezione e<br />
origina uno zigote che, nell’arco di 24 ore, si trasforma in un oocinete mobile e<br />
vermiforme. Al fine di sfuggire all’ambiente ostile dell’intestino, caratterizzato da<br />
un’elevata concentrazione di enzimi digestivi, l’oocinete attraversa la membrana<br />
peritrofica. Quest’ultima si forma nell’intestino della zanzara, subito dopo il pasto di<br />
sangue, ed ha lo scopo di proteggere la zanzara da eventuali agenti patogeni ingeriti con il<br />
sangue (Billingsley and Rudin, 1992). Subito dopo, il parassita inizia il processo<br />
11
d’invasione dell’epitelio intestinale, mediato dal riconoscimento e successiva adesione<br />
dell’oocinete alla superficie dei microvilli che rivestono l’epitelio intestinale. Raggiunto il<br />
lato emocelico dell’intestino, al di sotto della membrana basale, l’oocinete si differenzia in<br />
oocisti e nel giro di 7-15 giorni dall’infezione rilascia nell’emolinfa migliaia di sporozoiti<br />
che raggiungono ed invadono le ghiandole salivari. Studi ultrastrutturali hanno dimostrato<br />
che il processo d’invasione consiste di due fasi: un’iniziale adesione alla lamina basale<br />
seguita dall’interazione con la membrana plasmatica e l’ingresso nelle cellule ghiandolari<br />
(Pimenta et al., 1994) (Fig. 1.6). Specifiche proteine sporozoitiche, come CSP<br />
(Circumsporozoite Protein) e MAEBL (Membrane Antigen/ Erythrocyte Binding Protein)<br />
sembrano svolgere un ruolo in questo processo (Rodriguez and Hernandez-Hernandez Fde,<br />
2004), mentre TRAP (thrombospondin related anonymous protein) sembra essere<br />
coinvolta non solo nell’invasione delle cellule ghiandolari ma anche degli epatociti<br />
(Robson et al., 1995; Matuschewski, 2006). Una volta raggiunte le ghiandole salivari gli<br />
sporozoiti sono pronti per essere inoculati con la saliva nell’ospite vertebrato, dando inizio<br />
a un nuovo ciclo infettivo.<br />
Figura 1.6 Ciclo vitale di Plasmodium nella zanzara vettore<br />
(Riehle et al., 2003).<br />
12
1.4 Clinica<br />
L’esito della malattia dipende da diversi fattori legati al parassita, all’ospite e alla<br />
condizione sociale e geografica. Ciò può avere come effetto un quadro clinico che va<br />
dall’infezione asintomatica fino alla malaria complicata che può portare alla morte del<br />
paziente (Tab. 2).<br />
Tabella 2 Schema riassuntivo dei fattori coinvolti nel esito<br />
della malattia (Miller et al., 2002).<br />
L’espressività clinica della malaria non complicata è caratterizzata dalla presenza di febbre<br />
accompagnata da brividi e sudorazione eccessiva, dovuto alla rottura sincrona dei globuli<br />
rossi con conseguente rilascio dei cataboliti del parassita nel plasma sanguigno. Gli episodi<br />
febbrili possono essere inizialmente poco caratterizzati, ma nel corso dell’infezione<br />
l’aumento della densità dei plasmodi nel sangue tende ad accentuare la sintomatologia. Le<br />
manifestazioni cliniche della malaria complicata (anemia, ingrossamento della milza,<br />
acidosi metabolica e malaria cerebrale) sono dovute all’invasione di tessuti e organi da<br />
parte del plasmodio. Come precedentemente accennato, le manifestazioni cliniche possono<br />
dipendere da fattori legati al parassita come, ad esempio, la resistenza ai farmaci, la<br />
velocità del ciclo schizogonico negli eritrociti o la citoaderenza (Miller et al., 2002).<br />
Plasmodium falciparum è responsabile della forma più virulenta di malaria umana con<br />
circa 1 milione di morti l'anno, principalmente concentrati nell'Africa tropicale sub-<br />
Sahariana. Ciò può dipendere, in una prima fase, dal fatto che il parassita può invadere<br />
oltre il 50% dei globuli rossi provocando la morte del paziente per grave anemia in una<br />
fase successiva, da un fenomeno assente nelle infezioni causate dalle altre 3 specie di<br />
Plasmodium: la già citata citoaderenza dei globuli rossi infetti (Dolan et al., 1990). Questi,<br />
13
infatti, esprimono sulla loro superficie molecole con proprietà adesive di produzione<br />
parassitaria che fanno sì che gli eritrociti aderiscano gli uni con gli altri e con gli endoteli<br />
dei vasi sanguigni, evitando così di essere trasportati alla milza dove verrebbero distrutti.<br />
Se questo fenomeno, detto sequestramento, avviene a livello delle reti capillari degli organi<br />
interni, ne consegue che i tessuti a valle dell'ostruzione non ricevono nutrimento ed<br />
ossigeno. Il risultato finale sarà la necrosi degli organi interessati, con effetti disastrosi che<br />
possono portare alla morte (es. malaria cerebrale). Invece, tra i vari fattori legati all’ospite,<br />
particolare importanza riveste l’immunità. L’uomo mostra una certa resistenza al<br />
plasmodio fino a circa sei mesi dalla nascita, dovuta sia alla difficoltà di questo a<br />
metabolizzare l’emoglobina fetale, sia ad una parziale difesa fornita dall’immunità<br />
materna. Di conseguenza, i soggetti più esposti al rischio di contrarre le forme gravi della<br />
malattia sono i bambini in età compresa tra i 6 mesi e i 5 anni di età. A questi si<br />
aggiungono le donne in gravidanza, coloro che hanno trascorso diversi anni fuori dall’area<br />
endemica di origine, turisti provenienti da zone in cui la malattia non è presente e soggetti<br />
immunodepressi. Infatti, anche dopo parecchie esposizioni al parassita, gli uomini non<br />
sono totalmente protetti da successive infezioni, ma sviluppano soltanto una parziale<br />
immunità che attenua ed a volte anche reprime completamente i sintomi della malattia.<br />
Quindi l’immunità che il soggetto acquisisce è principalmente funzione dell’intensità<br />
dell’infezione, ovvero dell’intensità della trasmissione. Anche i fattori sociali ed economici<br />
giocano un ruolo importante nell’esito della malattia. Molti paesi in via di sviluppo sono<br />
carenti nei servizi preventivi di base e l’inaccessibilità ai farmaci e cure adeguate può far<br />
progredire rapidamente l’infezione fino a comportare la morte del soggetto.<br />
1.5 Strategie e bersagli nella lotta antimalarica<br />
Negli anni ’50 e ’60, la malaria è stata eradicata dalla maggior parte dei Paesi<br />
temperati (Stati Uniti ed Europa), come conseguenza di un’evoluzione delle pratiche<br />
agricole, della costruzione di case in muratura e soprattutto di programmi mirati al controlli<br />
del vettore. Tuttavia nelle zone tropicali e sub-tropicali non si sono ottenuti gli stessi<br />
successi. Queste differenze dipendono dagli stessi fattori che influenzano l'epidemiologia<br />
della malaria, ossia dalle specie di plasmodio, dalle caratteristiche biologiche del vettore,<br />
dall'ecosistema cui esso è legato ed infine l'uomo stesso (organizzazione sociale e grado di<br />
immunità). Di fatto, il successo nell'eradicazione dell'infezione malarica fu ottenuto solo in<br />
quelle zone geografiche che erano climaticamente marginali rispetto all'ecosistema che<br />
mantiene stabilmente la malattia (ad esempio quello tropicale). L'endemia malarica nelle<br />
14
zone temperate era strettamente collegata all'endofilia del vettore, cioè alla tendenza a<br />
pungere all'interno delle abitazioni e, soprattutto, a ricercare ambienti domestici durante la<br />
fase di riposo post-prandiale. L’irroramento intradomiciliare di un insetticida ad azione<br />
residuale come il DDT costituì un efficace fattore di destabilizzazione del sistema di<br />
trasmissione, riducendo la densità dei vettori ed obbligando le zanzare a spostarsi<br />
nell'ambiente esterno. Nelle zone temperate, caratterizzate da un rigido clima invernale, la<br />
temperatura esterna risultò al di sotto della soglia necessaria al parassita per completare il<br />
suo ciclo di sviluppo nel vettore, interrompendo quindi la trasmissione (Corbellini, 1998).<br />
Come si è accennato, nei Paesi tropicali gli insetticidi ad azione residua non ebbero lo<br />
stesso successo. Le temperature dell'ambiente esterno sono, di fatto, generalmente<br />
favorevoli durante tutto l'anno alla sopravvivenza dei vettori ed allo sviluppo del<br />
plasmodio all'interno della zanzara. Inoltre il livello di trasmissione della malattia, che in<br />
alcune zone dell'Africa sub-sahariana può raggiungere e superare le 100 punture infettanti<br />
per uomo l’anno, è tale che persino una riduzione del 90% della trasmissione non avrebbe<br />
un impatto significativo sulla diffusione della malattia. Inoltre, in Italia i vettori malarici<br />
appartenevano principalmente al complesso di specie Anopheles maculipennis, i cui focolai<br />
larvali sono rappresentati prevalentemente da aree paludose permanenti, per cui la bonifica<br />
di queste aree ha dato un contributo decisivo alla lotta contro il vettore. I vettori del<br />
complesso An. gambiae, principali responsabili della trasmissione malarica nell'Africa sub-<br />
sahariana, ed in particolare la specie nominale An. gambiae sensu stricto ed An. arabiensis,<br />
sono, al contrario, strettamente legati all'uomo, ed utilizzano come ambiente larvale<br />
raccolte d'acqua soleggiate create anche dall'attività umana (pozzanghere temporanee<br />
alimentate dalle piogge e dai sistemi d'irrigazione, piccole impronte nel terreno, risaie<br />
ecc.). Tali tipi di habitat risultano favoriti dalla diffusione dell'agricoltura e dell’irrigazione<br />
nelle savane aride, dalla deforestazione e dalla desalinizzazione delle aree costiere. La<br />
situazione nei Paesi tropicali è, inoltre, spesso aggravata dall'instabilità socio-economica e<br />
dalla precarietà dei servizi sanitari (Greenwood and Mutabingwa, 2002; Sachs and<br />
Malaney, 2002).<br />
Attualmente le strategie di controllo della malaria si basano principalmente su:<br />
diagnosi e trattamento della malaria<br />
controllo del vettore<br />
Nel primo caso l’obiettivo principale è quello di ridurre la mortalità e la morbilità legati<br />
alla malaria nonché limitare la sua trasmissione attraverso la riduzione del serbatoio di<br />
infezione. Per ottenere ciò, si sta cercando di realizzare o migliorare l’accesso a strutture<br />
15
sanitarie in cui si possa effettuare una diagnosi rapida di malaria, permettendo di effettuare<br />
una terapia precoce dei casi clinici. Un’ulteriore strategia è quella di migliorare la<br />
disponibilità di farmaci antimalarici ed eseguire una profilassi nei soggetti a rischio<br />
(bambini di età inferiore a cinque anni e donne in stato di gravidanza) (Malaria Report,<br />
2008).<br />
La necessità di disporre nei prossimi anni di nuovi strumenti di controllo della malattia<br />
assume oggi particolare rilievo, in considerazione della progressiva diffusione di ceppi<br />
parassitari farmaco-resistenti. I farmaci a basso costo, come clorochina e sulfadoxina-<br />
pirimetamina, hanno infatti perso gran parte della loro efficacia sia nelle aree di origine<br />
della farmaco-resistenza (Sud-Est Asiatico), sia in Africa sub-sahariana, dove il livello<br />
economico delle popolazioni non è in grado di sostenere il costo dei farmaci di ultima<br />
generazione, in particolare di quelli basati su associazioni di<br />
più molecole tra le quali l’artemisina.<br />
Il controllo dei vettori costituisce una strategia fondamentale nella lotta alla malaria e<br />
in passato è stata determinante nell’eradicazione della malattia nelle zone temperate.<br />
L'interruzione del contatto tra vettore e uomo può avvenire con sistemi di protezione<br />
passiva e/o attiva. I sistemi di protezione passiva sono vere e proprie barriere meccaniche il<br />
cui scopo è quello di prevenire la possibilità di contatto con il vettore. Ad esempio, le<br />
zanzariere poste alle aperture delle abitazioni (ad es. porte e finestre) o intorno ai letti,<br />
costituiscono un sistema di protezione passiva efficace nell’impedire meccanicamente il<br />
passaggio dell’insetto (Fig. 1.7). Inoltre, il trattamento di queste con insetticidi piretroidi ne<br />
aumenta l’efficienza in quanto combina l’effetto meccanico a quello repellente o letale<br />
dell’insetticida. L’utilizzo delle zanzariere impregnate con insetticidi come strumento di<br />
controllo della malaria sia collettivo che individuale è stato introdotto negli anni quaranta<br />
e, come dimostrato da diversi studi fra cui quello di Alonso et al., (1991), l’uso di<br />
zanzariere e tende trattate con insetticida ha determinato una riduzione del 50% della<br />
morbidità infantile e del 20-30% della mortalità globale in Gambia, Ghana e Kenya.<br />
16
Figura 1.7 Una delle misure di lotta antimalarica è<br />
rappresentata da tende e zanzariere impregnate con<br />
insetticidi, da appendere alle aperture delle abitazioni e sui<br />
letti.<br />
La lotta attiva contro i vettori adulti prevede l’utilizzo di insetticidi ad azione residua<br />
che possono essere applicati all’interno delle abitazioni, all’esterno o, come<br />
precedentemente accennato, su tende e zanzariere da letto (Fig. 1.8). Il successo di queste<br />
strategie richiede il continuo monitoraggio dell’evoluzione e della diffusione di<br />
meccanismi di resistenza nelle popolazioni vettrici bersaglio. Infatti, a partire dal primo<br />
caso di resistenza al DDT osservato nel 1947, la prevalenza e l’incidenza della resistenza<br />
sono aumentate, di anno in anno, con un tasso allarmante.<br />
Figura 1.8 La diffusione di insetticidi ad azione residua<br />
all'interno delle abitazione rappresenta un esempio di lotta<br />
attiva contro la forma adulta del vettore.<br />
17
Un altro sistema di protezione attiva è quello rivolto alle larve (Fig. 1.9). Si realizza<br />
mediante il trattamento dei focolai con larvicidi chimici (ad es. il Temephos) o con ormoni<br />
regolatori della crescita (Diflubenzuron o Pyriproxyfen), che uccidono le larve o ne<br />
bloccano lo sviluppo alla fase adulta. Un altro metodo, volto all’abbattimento della<br />
popolazione larvale, è rappresentato dall’introduzione di pesci larvivori (ad es. Poeciliidae<br />
quali Gambusia affinis), oppure di altri organismi (ad es. Bacillus thuringensis o B.<br />
sphaericus) in grado di produrre spore tossiche per le larve. Queste spore sono molto<br />
efficaci, ma il loro impiego nella lotta antilarvale è limitato dal loro costo e dal fatto che,<br />
una volta liberate sul pelo dell’acqua, in breve tempo tendono a concentrarsi sul fondale. Il<br />
rimedio antilarvale senza dubbio più efficace è costituito dal risanamento ambientale. La<br />
corretta gestione delle acque stagnanti superficiali, infatti, ha una importanza cruciale nel<br />
controllo della densità della popolazione del vettore. Ad esempio, la produzione di mattoni<br />
di argilla a scopo edilizio comporta la formazione di fosse che facilmente possono<br />
riempirsi di acqua piovana e divenire focolai di sviluppo larvale. La creazione di canali di<br />
scolo in cemento costituisce un valido rimedio per impedire il ristagno di acqua.<br />
Figura 1.9 Controllo attivo sullo stadio larvale del vettore<br />
Nell’ambito delle strategie di controllo in fase di sperimentazione va infine<br />
menzionato il tentativo di mettere a punto zanzare transgeniche refrattarie alla trasmissione<br />
del parassita. Progressi notevoli in questa direzione sono stati ottenuti nella comprensione<br />
dei meccanismi molecolari alla base della risposta immunitaria innata del vettore verso il<br />
parassita e delle interazioni molecolari tra ospite invertebrato e parassita, che si verificano<br />
nel corso del ciclo sporogonico (per esempio durante la penetrazione dell’oocinete nella<br />
parete intestinale del vettore e/o nel processo di invasione delle ghiandole salivari). A<br />
questi indubbi progressi sperimentali non corrisponde però, allo stato attuale, un progresso<br />
18
parallelo delle conoscenze sulla fattibilità di sostituire popolazioni selvatiche del vettore<br />
con l’eventuale zanzara transgenica refrattaria e sulla possibilità di risolvere gli ostacoli<br />
etici che tale operazione, inevitabilmente, comporterebbe (Kilama and Ntuomi, 2009).<br />
19
1.6 Epidemiologia<br />
Per un’adeguata valutazione del livello di trasmissione malarica di una determinata area<br />
geografica è necessario conoscere non solo la diffusione della malattia nella/e<br />
popolazione/i che la abitano, ma anche il livello di trasmissione del parassita e la densità<br />
vettoriale. Vanno quindi prese in esame le diverse specie di Anopheles presenti nella<br />
regione, la loro abbondanza relativa, le loro abitudini alimentari, oltre a una serie di fattori<br />
ambientali che possono influenzare lo sviluppo e il comportamento del vettore, quali la<br />
temperatura, l’umidità, le piogge e la conformazione del territorio. Per quanto riguarda<br />
l’ospite è inoltre necessario avere informazioni sulle condizioni igienico-sanitarie generali<br />
della popolazione, oltre ad un esame specifico del sangue e della milza dei singoli soggetti.<br />
1.6.1 Vettore idoneo<br />
Il Genere Anopheles comprende 484 specie tra cui sono presenti le circa 60 specie vettrici<br />
accertate di malaria umana, ma di queste solo una trentina sono considerate efficienti<br />
vettori (Fig. 1.10; Hamon and Mouchet, 1961; Carnevale and Robert 2009).<br />
Figura 1.10 Distribuzione mondiale delle specie di Anopheles<br />
(Kiszewski et al., 2004)<br />
20
Vi sono infatti alcune fondamentali caratteristiche fisiologiche e comportamentali che<br />
rendono una zanzara anofelina un vettore idoneo alla trasmissione di un patogeno umano<br />
come il plasmodio della malaria:<br />
- deve essere antropofila, ovvero essere attratta preferenzialmente da stimoli olfattivi<br />
prodotti dall'uomo e compiere il pasto di sangue preferenzialmente su di esso;<br />
- deve essere endofaga, ovvero essere propensa ad entrare nelle abitazioni per<br />
pungere;<br />
- deve essere presente nel territorio con densità significative;<br />
- deve essere sufficientemente longeva per permettere il completamento del ciclo<br />
sporogonico. Infatti, se il ciclo sporogonico di Plasmodium falciparum impiega 10<br />
giorni a 30°C e la specie di anofele coinvolta nella trasmissione ha una longevità<br />
media da adulto di soli 9 giorni, è evidente che questa specie non potrà essere un<br />
vettore efficace, in quanto la maggior parte dei suoi individui morirà prima che la<br />
sporogonia sia completata;<br />
- deve avere abitudini tali da vivere a temperature relativamente elevate, perché il<br />
ciclo sporogonico di Plasmodium è temperatura-dipendente: se l'Anofele vive a<br />
temperature relativamente basse (per esempio inferiori a 22-23°C), la durata del<br />
ciclo sporogonico si allungherà molto, superando a volte 20 giorni, eccedendo<br />
quindi la longevità media del vettore. Uno dei fattori che hanno consentito<br />
l'eradicazione della malaria in Italia è stato proprio il fatto che il nostro Paese<br />
appartiene alla fascia climatica temperata, con inverni lunghi e freddi e con estati le<br />
cui notti, nelle zone rurali, possono avere temperature al di sotto dei 20°C. Di<br />
conseguenza, le zanzare sono soggette a temperature medie piuttosto basse, cui<br />
corrisponde un allungamento del ciclo sporogonico e una conseguente minore<br />
probabilità di avere sporozoiti infettanti nelle ghiandole salivari.<br />
Quindi, è la presenza contemporanea di queste caratteristiche che rende una zanzara un<br />
vettore efficace di malaria. Esempi emblematici sono le specie afrotropicali appartenenti al<br />
complesso Anopheles gambiae e al gruppo Funestus, responsabili di oltre il 90% della<br />
trasmissione malarica in Africa continentale, che da sola rappresenta più dell’85% dei casi<br />
di malaria e più del 90% dei portatori di plasmodi nel mondo.<br />
21
1.6.2 Indici entomologici di trasmissione<br />
La comprensione delle dinamiche di trasmissione della malaria all’interno di una<br />
popolazione è fondamentale per diversi motivi. Innanzitutto ci permette di delineare le<br />
zone a rischio e ottenere stime affidabili della malattia. Inoltre, è estremamente utile per la<br />
pianificazione e l’implementazione delle strategie di prevenzione e controllo. L’entità della<br />
trasmissione malarica in una data area si può stimare quantitativamente attraverso il<br />
calcolo di quattro indici principali: il Tasso di Inoculazione Entomologica (Entomological<br />
Inoculation Rate o EIR), il Tasso di Riproduzione di Macdonald, la Capacità Vettrice di<br />
Garrett-Jones e l’Indice di Stabilità.<br />
1.6.2.1 Tasso di Inoculazione Entomologica<br />
Il tasso di inoculazione entomologica, definito dal parametro h, è largamente utilizzato per<br />
la valutazione della trasmissione della malaria (Corran et al., 2007). Questo indice, che<br />
definisce il numero di punture infettanti per persona per unità di tempo (solitamente un<br />
anno), si ottiene moltiplicando per l’indice sporozoitico il numero di punture per persona<br />
per notte:<br />
h = MaS<br />
dove (Ma) è il numero di punture che il vettore compie nell’arco di tempo sull’uomo (M è<br />
il numero di Anopheles per persona ed a è il numero medio di persone punte da un<br />
Anopheles in un giorno), S è l’indice sporozoitico (la percentuale di zanzare infettanti sul<br />
totale).<br />
L’EIR è tutt’ora il metodo più diretto per la valutazione delle misure di controllo vettoriale,<br />
dato che quantifica la proporzione di zanzare infettanti e la loro propensione a trasmettere<br />
parassiti alla popolazione umana (Shaukat et al., 2010). I metodi entomologici usati per<br />
stimare l’indice h si basano su diverse modalità di cattura di zanzare adulte tra cui le<br />
catture con insetticidi piretroidi e l’utilizzo di trappole ad attrazione luminosa, tipo CDC.<br />
Altri metodi di cattura, come lo human landing catch, hanno lo svantaggio di impiegare<br />
adulti volontari come “esche”, sollevando numerosi problemi di ordine etico e<br />
introducendo bias di campionamento dovuti alla diversa attrattività dei soggetti utilizzati<br />
come esche e la diversa abilità nel catturare le zanzare in fase di puntura. In generale,<br />
questi diversi metodi di campionamento presentano efficienze di cattura molto diverse,<br />
oltre a presentare dei bias dovuti alle diverse proporzioni degli stadi fisiologici delle<br />
zanzare catturate (alcuni metodi sono più efficaci nel catturare alcuni stadi rispetto ad<br />
22
altri). Inoltre, la stima dell’EIR è soggetta all’influenza delle fluttuazioni stagionali e delle<br />
eterogeneità nei diversi microhabitat sulla dinamica di popolazione dei vettori. Infatti, le<br />
densità vettoriali possono variare di ordini di grandezza tra case adiacenti, condizionando<br />
fortemente le stime basate sul campionamento di zanzare a riposo all’interno delle<br />
abitazioni (Billingsley et al., 2006; Drakeley et al., 2003; Beier et al., 1999). A questo si<br />
aggiunge anche il confondente dovuto alla particolare dinamica di sviluppo delle<br />
popolazioni di Anopheles durante la stagione delle piogge, in cui si osserva uno sviluppo<br />
sincronizzato degli individui (coorti), che si traduce in una alternanza di fasi a densità<br />
elevate di zanzare giovani non infettanti e fasi con popolazioni più vecchie, con indici<br />
sporozoitici più elevati (Peterson et al., 2009). Quindi, la stima dell’EIR è soggetta ad<br />
errori di sovrastima o sottostima, soprattutto in zone in cui la densità di zanzare infette è<br />
molto bassa.<br />
1.6.2.2 Tasso di Riproduzione di Macdonald<br />
Il Tasso di Riproduzione z di Macdonald (1957) è definito dalla seguente formula:<br />
dove:<br />
- m è il numero medio di vettori per uomo;<br />
z = ma 2 bp n /r (-lnp)<br />
- a è il numero medio di punture su uomo per giorno per vettore; il valore di a è legato<br />
all’antropofilia del vettore. Si ricava dal rapporto della frequenza delle punture su uomo<br />
(HBI = Human Blood Index, un indice che definisce la proporzione di pasti di sangue su<br />
uomo; si ricava dall'identificazione della specie a cui appartiene il sangue ingerito dalla<br />
zanzara) diviso per frequenza in giorni di puntura del vettore, che può compiere un pasto di<br />
sangue ogni 2 o più giorni;<br />
- ma è quindi il numero medio di punture per uomo per giorno; questo parametro si ottiene<br />
per mezzo di osservazioni dirette sul campo, mediante la conta del numero di punture<br />
ricevute in un giorno da soggetti volontari (ad esempio tramite human landing catch);<br />
- b è la proporzione di anofeli portatori di sporozoiti (anofeli infette e infettanti);<br />
- r è la proporzione giornaliera della popolazione umana infettata che passa allo stato non<br />
infetto (tasso di guarigione parassitaria);<br />
23
- p è la probabilità di sopravvivenza quotidiana del vettore;<br />
- n è la durata in giorni del ciclo sporogonico o, in altre parole, il numero di giorni che<br />
intercorrono tra il momento in cui il vettore si infetta e quello in cui diviene infettante;<br />
- p n è la probabilità che il vettore infettato divenga infettante; ossia che sopravviva fino al<br />
termine del ciclo sporogonio;<br />
- p n /-ln(p) è l'attesa di vita dei vettori infettanti dopo n giorni;<br />
sulla base delle definizioni sopra descritte, la formula del tasso di riproduzione z è<br />
spiegabile nel seguente modo: un soggetto infetto, non immune al plasmodio, è infettante<br />
per 1/r giorni. Durante ciascuno di questi giorni, è punto da ma anofeli, ciascuna con una<br />
aspettativa di vita infettante di p n /(-lnp). Durante questo periodo ciascuna anofele pungerà<br />
a persone/giorno, con una proporzione b di punture infettanti. In queste condizioni, z<br />
rappresenta il numero totale di potenziali infezioni secondarie à partire da un caso<br />
primario. Se il tasso di riproduzione è inferiore a 1 la parassitosi avrà tendenza a sparire, se<br />
invece è superiore a 1 la propagazione del plasmodio persiste nella popolazione umana e,<br />
secondo questa formula, le caratteristiche epidemiologiche della trasmissione<br />
dipenderanno essenzialmente dalla longevità e dall’aggressività delle anofeli vettrici.<br />
In condizioni reali il tasso di riproduzione risente di fattori quali l’immunità degli ospiti e<br />
l’esistenza di infezioni precedenti nei soggetti umani (sovra-infezioni e immunità<br />
concomitante), nonché infezioni precedenti nelle anofeli, che limitano la possibilità di<br />
acquisire nuove infezioni. Di conseguenza, in condizioni di malaria stabile si calcola un<br />
tasso “netto” di riproduzione z0:<br />
z0 = p n / p n -s<br />
composto esclusivamente dai parametri entomologici longevità (p), infettività (s) e<br />
sviluppo sporogonico (n). Il tasso z0 ha avuto un ruolo centrale nell’epidemiologia della<br />
malaria (e di altre malattie infettive) poiché fornisce un indice di intensità della<br />
trasmissione definendo anche delle soglie teoriche.<br />
24
1.6.2.3 Capacità vettrice<br />
La capacità vettrice (C) è definita come il numero di punture potenzialmente infettanti che<br />
possono originare, in un giorno, da un soggetto portatore di gametociti in grado di infettare<br />
tutti i potenziali vettori che compiono su di esso un pasto di sangue. La relazione che<br />
intercorre tra i parametri che influenzano la capacità vettrice è stata descritta da Garrett-<br />
Jones (1964) attraverso la seguente formula:<br />
C ma<br />
2<br />
p<br />
n<br />
ln<br />
Quindi, un portatore di gametociti è punto in media da ma vettori per giorno; una frazione<br />
p n di questi vettori sopravvive per un periodo di n giorni equivalente alla durata del ciclo<br />
sporogonico; i sopravvissuti vivono in media per altri 1/-loge(p) giorni, durante i quali<br />
prenderanno a pasti di sangue su uomo per giorno. Il valore C che ne risulta è una stima<br />
del numero medio di punture infettanti che derivano giornalmente da un caso infettante di<br />
malaria ed è molto simile allo z di Macdonald, dato che differisce solo per l’assenza dei<br />
parametri b ed r. Infatti, la capacità vettrice non tiene conto dell’infettività dell’ospite<br />
umano per l’anofele (1/r) e dell’infettività dell’anofele per l’uomo (b), da cui: C = z r/b. La<br />
capacità vettrice deve essere calcolata per ogni specie anofelica considerata e, nel caso di<br />
situazioni epidemiologiche comprendenti più specie vettrici, la capacità vettrice<br />
p complessiva sarà la somma dei valori di C di ciascuna specie.<br />
1.6.2.4 Indice di stabilità<br />
L’indice di stabilità, anche questo calcolato da Macdonald (1957) è definito dalla formula<br />
a/-lnp. È un indice interamente entomologico che tiene conto di 3 parametri: l’antropofilia,<br />
la durata del ciclo gonotrofico (il cui rapporto permette di calcolare a) e la longevità p. Da<br />
questo indicatore si ottiene quindi il numero di contatti ospite-vettore nel corso della vita di<br />
quest’ultimo. Più grande sarà questo valore, più alto sarà l’indice di stabilità. Secondo<br />
Macdonald, se l’indice è inferiore a 0,5 siamo in condizioni di malaria instabile, se è<br />
superiore a 2,5 siamo in una condizione di malaria stabile. Tra queste due soglie si<br />
definiscono varie condizioni intermedie (Macdonald, 1957; Mouchet et al., 2004).<br />
Un’analisi comparativa dei fattori sopra elencati ha permesso di individuare<br />
all’interno del genere Anopheles le specie più efficienti quali vettori di plasmodi umani e,<br />
in particolare, di riconoscere in alcune specie appartenenti al complesso An. gambiae i<br />
principali vettori di malaria al mondo (Coluzzi, 1984; 1992). Tali specie sono responsabili<br />
25
dell’elevatissimo livello di trasmissione della malaria che si osserva nell’Africa sub-<br />
sahariana (con valori di capacità vettrice spesso superiori a 10, con punte di 30), molto<br />
superiore a quello osservato in altre zone tropicali con paragonabili situazioni socio-<br />
economiche e sanitarie.<br />
1.6.3 Indici parassitologici di trasmissione<br />
Gli indici entomologici sopra descritti non rappresentano l’unica misura possibile della<br />
trasmissione malarica. Esistono infatti metodi indiretti di largo utilizzo, come gli indici<br />
parassitologici. Tra questi, quelli maggiormente utilizzati sono: l’indice parassitario (PR),<br />
l’indice parassitario annuale (API) e l’indice splenico (SR) (Shaukat et al., 2010).<br />
L’indice parassitario misura la percentuale della popolazione che presenta parassiti<br />
asessuati nei globuli rossi. Tale misurazione può anche essere effettuata sui gametociti<br />
(indice gametocitico), in cui si considera la percentuale di individui di una popolazione il<br />
cui sangue periferico contiene forme pre-sessuate del parassita. Con questo parametro,<br />
inoltre, si stabilisce il potenziale infettante della popolazione stessa. Non tutte le persone<br />
infette hanno però un numero di gametociti sufficiente per infettare le zanzare: è necessario<br />
almeno un gametocita maturo di P. falciparum ogni 200 leucociti perché si abbia la<br />
trasmissione (De Carneri, 1997). Entrambi gli indici possono essere calcolati stratificando<br />
la popolazione per gruppi di età. Questa misurazione ha il vantaggio di dare un’ immagine<br />
diretta dell’inoculazione e dell’immunità dell’ospite nonché dell’efficacia di eventuali<br />
trattamenti.<br />
L’indice parassitario annuale, invece, misura il numero di casi di malaria su 1000<br />
persone per anno che si verificano in un’area geografica ben definita. Il vantaggio pratico<br />
di quest’indice è quello di fornire un riscontro pratico sugli effetti delle misure di<br />
prevenzione e di controllo malarico attuate in un’area geografica.<br />
Entrambi gli indici presentano diversi svantaggi dovuti alla bassa sensibilità della metodica<br />
in situazioni di grande variazioni dei livelli parassitari nel tempo. Ciò è dovuto alla breve<br />
persistenza (circa 2 settimane) della parassitemia nel sangue periferico in seguito ad ogni<br />
infezione (Pringle and Avery-Jones, 1966). Inoltre, la stima degli indici può essere<br />
influenzata anche da altri fattori. L’uso di farmaci antimalarici, così come la presenza di<br />
ceppi resistenti, possono comportare effetti non prevedibili sulla prevalenza del parassita<br />
in popolazioni non-immuni residenti in zone a bassa trasmissione. Ancora, la quantità dei<br />
parassiti circolanti può essere sottostimata in zone ad alta trasmissione per via<br />
26
dell’immunità acquisita dell’individuo. Infatti, in condizioni di alti livelli di immunità<br />
acquisita si verifica una rapida clearance dei parassiti dalla circolazione sanguigna,<br />
comportando una sottostima della trasmissione. Inoltre, l'individuazione dei parassiti<br />
mediante microscopia necessita di personale altamente qualificato, di precisione e<br />
sensibilità, soprattutto in zone di bassa trasmissione.<br />
Infine, un’altra misura indiretta del rischio di malaria è l’indice splenico, che fu<br />
introdotto per la prima volta in India da Dempster nel 1848, prima ancora che si scoprisse<br />
l’agente eziologico della malaria. Quest’indice si basa sul principio per cui un’esposizione<br />
cronica alla malaria comporta l’ingrossamento della milza. Di conseguenza, la misurazione<br />
della percentuale di individui che presentano ingrossamento della milza è direttamente<br />
correlata con il rischio di infezione all’interno di una comunità. Generalmente, l’indice<br />
viene calcolato sui bambini di 2-9 anni in quanto l’ingrossamento della milza è maggiore<br />
nel momento in cui si sviluppa il sistema immunitario. Mediante questo indice, una<br />
determinata area geografica può essere definita:<br />
Ipoendemica: se l’indice splenico è compreso tra 0 e 10%. Sono aree in cui<br />
la trasmissione è bassa.<br />
Mesoendemica: se l’indice splenico è compreso tra 11 e 50%. Si tratta<br />
tipicamente di zone rurali in regioni subtropicali con un’intensità di<br />
trasmissione variabile.<br />
Iperendemica: quando l’indice splenico supera il 50% nei bambini ed è<br />
elevato anche negli adulti. Sono zone con trasmissione intensa ma<br />
stagionale, che non consente alle popolazioni che vi abitano di sviluppare<br />
un’immunità sufficiente a prevenire i sintomi della malaria.<br />
Oloendemiche: quando l’indice splenico supera il 75% nei bambini ed è<br />
invece bassso negli adulti. Si tratta di zone ad alta trasmissione costante; le<br />
popolazioni che le abitano sviluppano di solito un considerevole livello di<br />
immunità in tutte le fascie d’età, in particolare negli adulti (Bruce-Chwatt,<br />
1985).<br />
Tuttavia, questo indice è soggetto a una sovrastima dei casi di splenomegalia dovuti alla<br />
malaria, quindi potrebbe non fornire una precisa misura delle differenti esposizioni<br />
all’infezione. Infatti, l’ingrossamento della milza è stato visto anche per altre parassitosi<br />
quali leishmaniosi viscerale e nell'infestazione da Schistosoma mansoni. Inoltre, in<br />
condizioni di epidemia di malaria, in cui il rischio di infezione può essere molto alto,<br />
27
l’indice può risultare vicino allo zero in quanto l’esposizione è acuta ma non cronica.<br />
Quindi, l’indice splenico risulta utile, come misura relativa del rischio, solo in situazioni di<br />
malaria stabile (Denise L. Doolan, 2002).<br />
1.6.4 Indicatori sierologi di trasmissione<br />
Considerando i limiti dati dai metodi entomologici e parassitologici, recentemente si è<br />
assistito allo sviluppo di altri metodi per la valutazione del rischio di esposizione: sono<br />
state create numerose mappe per ottenere modelli climatici arricchiti di informazioni<br />
riguardanti le precipitazioni, la temperatura e l’umidità relativa. Questi sono sicuramente<br />
fattori importanti per la sopravvivenza e la riproduzione dell’insetto vettore e lo sviluppo<br />
del parassita nel vettore stesso. Tuttavia, sebbene mostrino un buon accordo con i dati<br />
empirici a livello regionale e di nazione (Craig et al., 1999), questi modelli non si prestano<br />
per predizioni di endemicità malarica a livello della comunità individuale (Omumbo et al.,<br />
2004). Risulta, quindi, fondamentale avere misurazioni dirette della trasmissione di malaria<br />
all’interno della comunità. Inoltre, è necessario che questi metodi siano caratterizzati da<br />
un’elevata sensibilità, in modo da poterne usufruire anche in zone in cui la trasmissione è<br />
bassa.<br />
In seguito allo sviluppo di affidabili tecniche sierologiche, la misurazione della prevalenza<br />
di anticorpi anti-malaria nella popolazione locale rappresenta un potenziale indicatore del<br />
livello di trasmissione della malaria (Burattini et al., 1993). Draper, Voller e Carpenter,<br />
furono tra i primi ad applicare i dati sierologici ad un modello matematico al fine di<br />
stimare il tasso di infezione. Inoltre, misero in evidenza una proprietà importante dei dati<br />
sierologici: i dati raccolti in un indagine sierologica rappresentano la prevalenza di un<br />
“periodo” (l’esperienza totale di malaria in una comunità) in netto contrasto con la<br />
prevalenza del “momento” ottenuta dai dati parassitologici (Draper et al., 1972). Infatti, gli<br />
anticorpi possono persistere per mesi o anni dopo l’infezione rendendo questo metodo<br />
relativamente robusto a variazioni nella trasmissione che avvengono a breve termine<br />
(Corran et al., 2007) ma inappropriato per stimare l’esposizione alla malaria al livello<br />
individuale. Sebbene sia ancora dibattuta la persistenza degli anticorpi anti-malaria (Struik<br />
and Riley, 2004) è stato osservato che persistono decisamente più a lungo rispetto alle<br />
infezioni individuali e alle zanzare infette. Inoltre, è stato dimostrato che i livelli<br />
anticorpali aumentano rapidamente in individui che sono nuovamente esposti durante un<br />
epidemia (Migot et al., 1995), come anche in popolazioni da cui la malaria è stata<br />
eliminata di recente (Kaneko et al., 2000). Tuttavia, l’esistenza di una memoria della<br />
28
isposta anticorpale della durata di diversi anni (Bouchaud et al., 2005) è stata osservata<br />
negli adulti, mentre nei bambini al di sotto dei 5 anni la durata della risposta anticorpale è<br />
di circa 3-4 mesi (Akpogheneta et al., 2008) e si osserva una variazione in accordo alla<br />
stagione di trasmissione (Taylor et al., 1996). Nel corso degli anni, gli studi sierologici<br />
sono stati usati per valutare l’intensità di trasmissione (Voller and Bruce-Chwatt, 1968), la<br />
sua riduzione in seguito all’applicazione di misure di controllo (Cornille-Brogger et al.,<br />
1978) e l’eradicazione (Bruce-Chwatt et al., 1973). Le analisi sierologiche sono state<br />
utilizzate anche per valutare il rischio relativo di infezione in viaggiatori europei di ritorno<br />
da aree malariche (Nothdurft et al., 1999). Quindi, la prevalenza degli anticorpi verso<br />
antigeni malarici ha fornito in varie occasioni un’indicazione indiretta del rischio di<br />
infezione correlandola con i tassi splenici, la prevalenza di strisci di sangue positivi e la<br />
densità parassitaria (Genton et al., 1995; Al-Yaman et al., 1995; May et al., 1999).<br />
Tuttavia, è stato visto che l’uso di un singolo antigene per le indagini siero-<br />
epidemiologiche può comportare una riduzione della sensibilità del saggio. Inoltre, la<br />
risposta anticorpale può risentire dei polimorfismi antigenici che determinano una diversità<br />
di risposta (Good et al., 1993; Taylor et al., 1996). Sembrerebbe quindi vantaggioso<br />
utilizzare una combinazione di antigeni di differenti specie (Drakeley and Cook, 2009)<br />
oppure antigeni altamente immunogenici quali AMA-1 (Apical Membrane Antigen 1) in<br />
zone di bassa trasmissione o in aree in cui è necessario confermare l’eradicazione, mentre<br />
si potrebbe sfruttare la bassa immunogenicità di antigeni come MSP-119 (Merozoite<br />
Surface Protein 119) in zone ad alta trasmissione (Corran et al., 2007). Tuttavia, nessun<br />
test sierologico attualmente disponibile rappresenta un’alternativa affidabile ai metodi<br />
entomologici per una misura quantitativa della trasmissione malarica (Doolan, 2002).<br />
29
1.7 Interazione zanzara-ospite<br />
1.7.1 Le ghiandole salivari e la saliva<br />
Nel processo di trasmissione del plasmodio della malaria, le ghiandole salivari di<br />
zanzare vettrici rappresentano un organo di estrema importanza. Ogni zanzara ha una<br />
coppia di ghiandole localizzate nella porzione ventrale del torace. Le ghiandole salivari di<br />
Anopheles presentano un dimorfismo sessuale in relazione al fatto che le femmine, oltre a<br />
nutrirsi di liquidi zuccherini di origine vegetale, fanno anche un pasto di sangue.<br />
Quest’ultimo è essenziale per la riproduzione in quanto viene utilizzato per sintetizzare il<br />
tuorlo delle uova (James and Rossignol, 1991). Le ghiandole femminili sono circa cinque<br />
volte più grandi di quelle maschili e differiscono, oltre che morfologicamente, anche per le<br />
proprietà biochimiche delle molecole di superficie nonché per le secrezioni salivari (James,<br />
1994, Lombardo et al., 2006). Ciascuna ghiandola è costituita da tre lobi, due laterali ed<br />
uno mediano (Fig. 1.11) con quelli laterali distinguibili in una porzione prossimale ed una<br />
distale. Studi di espressione genica condotti su Aedes aegypti e Anopheles gambiae hanno<br />
dimostrato che i geni coinvolti nell’assunzione del pasto di sangue sono espressi<br />
principalmente nella porzione distale-laterale; invece la porzione prossimale-laterale<br />
esprime geni coinvolti nella digestione di zuccheri o in altre funzioni ghiandolari più<br />
generali (James, 1994; Arcà et al., 1999). Queste evidenze morfologiche e biochimiche si<br />
correlano in modo positivo con l’osservazione che gli sporozoiti invadono<br />
preferenzialmente i lobi nella porzione distale-laterale. Il lobo mediano è connesso ai due<br />
lobi laterali mediante una corta regione, simile a un collo di bottiglia, ed è stato ipotizzato<br />
un suo ruolo nel trasporto dei fluidi. Ognuno dei tre lobi è composto da un singolo strato di<br />
cellule epiteliali che rivestono un dotto centrale; i tre dotti di ogni ghiandola si fondono<br />
assieme convergendo in un unico canale salivare che si apre al livello dell’ipofaringe.<br />
30
Figura 1.11 Immagini al microscopio ottico di<br />
ghiandole salivari di An. gambiae. Sono evidenziate le<br />
regioni corrispondenti al dotto salivare (sd), al lobo<br />
mediale (m) ed alla porzione prossimale (pl) e distale (dl)<br />
dei lobi laterali (Lombardo et al., 2006).<br />
Durante il pasto di sangue, la zanzara inietta nell’ospite la saliva che ha la funzione<br />
di facilitare l’assunzione del pasto di sangue grazie alla presenza di fattori anti-emostatici,<br />
anti-infiammatori ed immunomodulatori. Lo studio della saliva di artropodi ematofagi ha<br />
permesso di individuare fattori in grado di contrastare tutte e tre le componenti della<br />
risposta emostatica dei vertebrati: coagulazione, aggregazione piastrinica e<br />
vasocostrizione. Sebbene siano state studiate solo un numero limitato delle oltre 15.000<br />
specie di artopodi ematofagi risulta evidente una profonda diversità delle sostanze secrete.<br />
Ciò conferma l’idea che l’adattamento all’ematofagia abbia avuto origine<br />
indipendentemente più volte nell’evoluzione, rappresentando quindi un buon esempio di<br />
evoluzione convergente (Ribeiro, 1995; Ribeiro and Arcà, 2009).<br />
Meccanismi estremamente diversi vengono usati da differenti artropodi ematofagi<br />
per ottenere vasodilatazione. Per esempio gli emitteri Cimex lectularius e Rhodnius<br />
prolixus usano le nitroforine: si tratta di proteine in grado di trasportare e di rilasciare<br />
ossido nitrico (NO) nel sito d’inoculazione e di legare successivamente istamina, un<br />
importante modulatore della risposta infiammatoria (Valenzuela and Ribeiro, 1998;<br />
Champagne et al., 1995). Aedes aegypti, invece, utilizza le sialochinine I e II, dei<br />
decapeptidi capaci di stimolare il rilascio di NO da parte delle cellule endoteliali. Le<br />
anofeline, infine, impiegano un enzima ad attività perossidasica in grado di distruggere<br />
ammine biogeniche quali la serotonina e la norepirefrina, inibendo così la vasocostrizione<br />
(Ribeiro and Nussenzveig, 1993).<br />
31
Una simile ampia varietà è stata riscontrata per gli anticoagulanti. Si è visto che le<br />
sostanze principalmente sintetizzate dagli emitteri (R. prolixus e Eutriatoma maculatus)<br />
sono dirette contro il fattore VIII e la trombina mentre il dittero simulide Simulum vittatum<br />
sintetizza inibitori del fattore Xa, del fattore VII e un antitrombinico. Poiché i tempi<br />
d’innesco per la coagulazione sono superiori alla durata media di un pasto di sangue si<br />
suppone che queste sostanze giochino un ruolo importante nel prevenire la formazione di<br />
coaguli che potrebbero ostruire l’apparato boccale. Inoltre, in Anopheles è stato osservato<br />
che tali molecole potrebbero facilitare i processi digestivi che seguono la pre-diuresi<br />
durante la quale vengono concentrate cellule e proteine sieriche e viene secreta l’acqua in<br />
eccesso nel sangue (James, 1994, Ribeiro, 1995).<br />
Gli antipiastrinici mostrano invece una minore eterogeneità nel bersaglio. La<br />
maggior parte degli artropodi ematofagi impiega molecole con attività apirasica.<br />
Quest’enzima è responsabile della conversione dell’ATP e ADP in AMP e pirofosfato, in<br />
modo da inibire il processo d’aggregazione e reclutamento delle piastrine ADP-dipendente.<br />
L’analisi molecolare ha rilevato l’esistenza di 3 classi di apirasi con origini evolutive<br />
differenti. In Aedes e Anopheles l’attività apirasica è svolta da un membro della famiglia<br />
delle 5’-nucleotidasi (Champagne et al., 1995; Lombardo et al., 2000). Negli emitteri (C.<br />
lectularius e R. prolixus) e nel flebotomo Phlebotomus papatasi tale attività e svolta da una<br />
differente famiglia di proteine strettamente dipendenti dal calcio (Valenzuela et al., 2001).<br />
La terza classe di apirasi appartiene alla famiglia delle ecto-ATPasi ed è stata isolata<br />
originariamente in Toxoplasma gondii (NTPasi I e II), oltre ad essere stata ritrovata in una<br />
grande varietà di organismi, tra cui piante e uomo (Asai et al., 1995).<br />
1.7.2 Risvolti applicativi dello studio sulle ghiandole salivari<br />
Negli ultimi anni lo studio delle ghiandole salivari di vettori di malattie quali<br />
malaria, dengue o leishmaniosi ha suscitato notevole interesse negli entomologi<br />
molecolari. Ciò è in parte da attribuirsi alla necessità di una più adeguata comprensione del<br />
loro ruolo nella trasmissione del patogeno e delle proprietà biochimico-farmacologiche<br />
della saliva. Esistono però anche importanti risvolti applicativi legati a questi studi, come<br />
ad esempio la possibilità di sviluppare componenti di vaccini (Titus et al., 2006).<br />
Numerose indicazioni suggeriscono che la saliva degli insetti vettori svolge un<br />
ruolo importante nella trasmissione dei parassiti ed il modello esemplare, in questo senso, è<br />
rappresentato da un modello murino di leishmaniosi. Infatti, la saliva di Lutzyomyia<br />
32
longipalpis aumenta considerevolmente la frequenza e la gravità dell’infezione del<br />
parassita in topi non esposti in precedenza a punture di flebotomo (Titus and Ribeiro.,<br />
1988). Tuttavia, topi immunizzati con la saliva dell’insetto acquisiscono un certo grado di<br />
protezione dalla leishmaniosi cutanea. La caratterizzazione delle proteine coinvolte ha<br />
permesso di sviluppare due possibili nuovi vaccini che conferiscono protezione contro<br />
l’infezione da L. major e sono basati su due proteine salivari: il maxadilan (Max) e SP15.<br />
Max è una molecola che interferisce con la normale attività macrofagica in quanto inibisce<br />
la produzione di NO e TNF-γ essenziali per una risposta protettiva nei confronti del<br />
parassita (Titus et al., 2006). Invece, la funzione svolta dalla saliva di Anopheles nella<br />
trasmissione del plasmodio è molto meno chiara. Il raggiungimento della piena infettività<br />
degli sporozoiti non sembra essere, come supposto in precedenza, ghiandola-dipendente. In<br />
vivo, in un modello murino, è stato dimostrato che dopo l’inoculazione un piccolo numero<br />
di sporozoiti entra nei capillari sanguigni, mentre un numero più elevato raggiunge i<br />
linfonodi o rimane nel derma fino a 7 ore dopo l’iniezione (Amino et al., 2006). Inoltre,<br />
alcuni dati sperimentali indicano che esposizioni ripetute a punture di zanzare non infette<br />
(quindi unicamente alla loro saliva) inducono una risposta locale e sistemica che, in una<br />
successiva infezione con Plasmodium yoelii, è in grado di contenere lo sviluppo del<br />
parassita (Donovan et al., 2007). È evidente quindi come l’individuazione delle<br />
componenti salivari in grado di indurre questo tipo di risposta potrebbe essere di grande<br />
interesse per l’inclusione in vaccini multi-stage.<br />
Un’ulteriore interessante possibilità applicativa è quella di sfruttare la risposta<br />
anticorpale dell’ospite alla saliva di insetti ematofagi come possibile marcatore di<br />
esposizione. A tale riguardo risultati incoraggianti sono stati ottenuti nel caso di proteine<br />
salivari di vettori di leishmaniosi e del morbo di Chagas (Barral et al., 2000; Nascimento et<br />
al., 2001). Recentemente è stato suggerito che la risposta anticorpale alla saliva di An.<br />
gambiae possa rappresentare una misura del grado di esposizione a rischio di contrarre<br />
malaria (Remoue et al., 2006). In questo studio condotto in Senegal su bambini di età<br />
inferiore ai 5 anni è riportato che il livello di IgG anti-saliva aumenta con il grado di<br />
esposizione a punture anofeliche (basso, medio, elevato). Inoltre, è stata osservata una<br />
correlazione positiva tra livelli di IgG rilevati e il rischio di sviluppare la malattia nei tre<br />
mesi successivi. La possibilità dell’uso della saliva quale marcatore di esposizione<br />
potrebbe essere estremamente utile ma è limitato da alcuni importanti fattori. Innanzitutto<br />
la saliva di An. gambiae, come quella di altre specie di zanzare e di altri artropodi<br />
ematofagi, è una miscela complessa costituita da differenti proteine con un diverso grado<br />
33
di immunogenicità. Inoltre è verosimile che possa esistere una certa cross-reattività con<br />
proteine salivari di altre zanzare (o di altri artropodi ematofagi). Questa potenziale cross-<br />
reattività, che resta ancora da valutare, potrebbe limitare notevolmente la significatività di<br />
una determinata misurazione, complicandone notevolmente l’interpretazione. Da questo<br />
punto di vista un grosso salto di qualità sarebbe rappresentato dall’individuazione di<br />
singole proteine salivari immunogeniche da usare, in luogo della saliva in toto, per la<br />
misurazione dei livelli di IgG nel siero. A questo riguardo l’analisi del trascrittoma salivare<br />
di An. gambiae e di altre zanzare (Arcà et al., 2005; Ribeiro et al., 2007; Valenzuela et al.,<br />
2003; Calvo et al., 2007; Arcà et al., 2007) ha consentito di individuare una serie di<br />
proteine salivari tipiche di Anopheles, cioè assenti negli altri generi di culicidi e altri insetti<br />
ematofagi (Tab. 3 da Lombardo et al., 2006; Ribeiro, Mans and Arcà, 2010). Queste<br />
proteine, se immunogeniche, potrebbero essere adoperate quali sensibili e specifici<br />
marcatori del grado di esposizione a punture di Anopheles, rappresentando quindi uno<br />
strumento importante per stimare in modo rapido i livelli di esposizione a vettori di malaria<br />
e il relativo rischio di trasmissione. Questo potrebbe rivelarsi particolarmente prezioso<br />
soprattutto nei casi di analisi epidemiologiche in cui sia difficile acquisire con altre<br />
modalità gli opportuni dati entomologici, come nel caso di situazioni con basse densità di<br />
vettori.<br />
34
protein or<br />
protein family1 comment<br />
D7 (8) D7 family of salivary<br />
proteins<br />
SG1 (6) SG1 family of salivary<br />
proteins<br />
expression other<br />
pattern1, 2 anopheline3 sg (6), enr (2) + +<br />
culicine 3<br />
sg (3), enr (3) + -<br />
gVAG Antigen 5 salivary protein enr + +<br />
Mucins (3) salivary mucins sg/m + +<br />
SG2 salivary protein SG2 sg/m + -<br />
SG2a salivary protein SG2a sg/m + -<br />
gSG5 salivary protein gSG5 sg - -<br />
gSG6 salivary protein gSG6 sg + -<br />
gSG7 salivary protein gSG7 enr + -<br />
gSG7-2 salivary protein gSG7-2 enr + -<br />
gSG8 salivary protein gSG8 sg - +<br />
gSG9 salivary protein gSG9 sg/m + -<br />
hyp 6.2 hypothetical salivary<br />
protein 6.2<br />
enr + -<br />
hyp 6.3 hypothetical salivary<br />
protein 6.3<br />
sg/m - -<br />
hyp 8.2 hypothetical salivary<br />
protein 8.2<br />
enr + -<br />
hyp 10 hypothetical salivary<br />
protein 10<br />
sg/m + -<br />
hyp 12 hypothetical salivary<br />
protein 12<br />
sg/m + -<br />
hyp 15 hypothetical salivary<br />
protein 15<br />
enr + -<br />
hyp 17 hypothetical salivary<br />
protein 17<br />
enr + -<br />
30 kDa 30 kDa allergen enr + +<br />
hyp 37.7 putative 37.7 kDa salivary<br />
protein<br />
sg + -<br />
hyp 55.3 putative 55.3 kDa salivary sg/m + +<br />
protein<br />
cE5 Anophelin sg/m + -<br />
Ag_Sal_peroxidase salivary peroxidase sg + +<br />
Sal_serpro2 cub-domain protease sg - +<br />
Sal_tryp_XII salivary trypsin (similar to sg - -<br />
FXII)<br />
apyrase Apyrase sg + +<br />
5p_nuc 5’-nucleotidase enr + +<br />
Ag_epoxy_hydrolase epoxide hydrolase enr - -<br />
Sal_serpro1 trypsin-like serin protease enr - -<br />
Sal_galectin salivary galectin enr - -<br />
Ag_Sal_amy salivary amylase sg/m - +<br />
Ag_Sal_maltase salivary maltase sg/m + +<br />
Tabella 3 Lista di putative proteine secrete individuate nelle ghiandole salivari di An. gambiae.<br />
1. Il numero in parentesi si riferisce al numero di geni presenti nella stessa famiglia.<br />
2. il pattern di espressione è determinato mediante RT-PCR (Arcà et al., 2005): sg, presente esclusivamente<br />
nelle ghiandole salivari di femmine adulte; enr, arricchite nelle ghiandole salivari di femmine adulte; sg/m,<br />
ghiandole salivari di femmine adulte e maschi adulti.<br />
35
3. + or -, presenza o assenza di sequenze omologhe nei trascittomi salivari di altre specie di zanzare<br />
determinata mediante analisi blastp contro il database non–ridondante del NCBI.<br />
1.7.3 gSG6 (gambiae Salivary Gland protein 6)<br />
gSG6 (gambiae Salivary Gland protein 6) è una piccola proteina salivare di ~10 kDa che è<br />
espressa specificamente nelle ghiandole salivari femminili e che nella sua forma matura,<br />
cioè dopo rimozione del peptide segnale, misura 87 amminoacidi. gSG6 è espressa<br />
specificamente nelle porzioni distali dei lobi laterali (Fig. 1.12) ed è secreta nella saliva<br />
della zanzara, come suggerito non solo dalla presenza di un segnale secretorio, ma anche<br />
da saggi di puntura su membrana e successiva rivelazione con anticorpi policlonali anti-<br />
gSG6 (Lombardo et al., 2006).<br />
Figura 1.12 Immunolocalizzazione di anticorpi anti-gSG6 su<br />
ghiandole femminili di An. gambiae (Lombardo et al., 2009)<br />
Mediante RNA interference (RNAi) è stato dimostrato che la diminuzione dei livelli della<br />
proteina gSG6 comporta una riduzione della capacità di compiere il pasto di sangue da<br />
parte della zanzara. In particolare, una riduzione dei livelli di gSG6 determina una<br />
diminuzione dell’abilità di compiere il pasto di sangue in confronto a zanzare di controllo.<br />
Infatti 6 giorni dopo il trattamento il numero di individui che aveva effettuato il pasto di<br />
sangue dopo 10 minuti di esposizione all’ospite (cavia peruviana) era del 28% (17/60) per<br />
zanzare iniettate con gSG6-dsRNA, 46% (27/61) per zanzare iniettate con DsRed-dsRNA e<br />
del 66% per zanzare iniettate con soluzione fisiologica (Figura 1.13). Inoltre la<br />
misurazione del tempo di probing, cioè dell’intervallo di tempo tra il momento in cui la<br />
zanzara punge l’ospite e l’inzio dell’ingestione del sangue mostrava che le zanzare trattate<br />
con gSG6-dsRNA richiedono circa il doppio del tempo per iniziare il pasto di sangue<br />
rispetto alle zanzare non trattate (p
Figura 1.13 Effetto della deplezione di gSG6 sulla capacità di<br />
compiere il pasto di sangue da parte di An. gambie. A.<br />
Prevalenze di zanzare che hanno compiuto il pasto di sangue<br />
(•)percentuale di non trattati;( ) trattati con dsRed-dsRNA;<br />
trattati con gSG6-dsRNA( ). B. Tempo di probing in: (•)non<br />
trattati;( ) trattati con dsRed-dsRNA; trattati con gSG6dsRNA(<br />
)(Lombardo et al., 2009)<br />
Effettuando ricerche nelle banche dati usando la sequenza proteica di gSG6 di An. gambiae<br />
come query si vede che questa proteina è ristretta a specie del genere Anopheles ma è<br />
assente nei trascrittomi salivari di culicini quali Culex quinquefasciatus, Aedes aegypti e<br />
Aedes albopictus (Arcà et al., 2007; Ribeiro et al., 2007, 2004). Nell’ambito delle<br />
anofeline gSG6 mostra un’elevata percentuale di identità (99% -100%) con omologhi da<br />
specie appartenti al complesso An. gambiae; la percentuale di identità scende a circa l’80%<br />
nel confronto con omologhi da altre specie del subgenere Cellia, tra cui An. funestus (81%)<br />
e An. stephensi (81%). Infine, l’ identità diminuisce ulteriormente (~70%) quando la<br />
proteina di An. gambiae è confrontata con l’omologo dal vettore di malaria americano An.<br />
freeborni, appartenete al gruppo Maculipennis, subgenere Anopheles (Fig. 1.14)<br />
(Lombardo et al., 2009).<br />
Figura 1.14 Allineamento delle sequenze anofeliche di gSG6.<br />
La sequenza del peptide segnale è stata delineata dal box. In<br />
grigio sono mostrati gli aminoacidici conservati nelle diverse<br />
specie (Lombardo et al., 2009).<br />
37
La precedente espressione in forma ricombinante della proteina SG6 da An.<br />
gambiae nel lievito Pichia pastoris aveva permesso di ottenere delle indicazioni<br />
preliminari riguardo alla sua immunogenicità (Poinsignon et al., 2008) ed incoraggiando la<br />
sua produzione su larga scala per ulteriori indagini epidemiologiche.<br />
1.7.4 Anophelin/cE5<br />
Una altra proteina salivare Anopheles-specifica è l’anofelina (Anophelin/cE5), una piccola<br />
proteina salivare di circa 8,6 kDa espressa nelle ghiandole salivari femminili di An.<br />
gambiae ma in una certa misura anche nei maschi ed in altri tessuti (Arcà et al., 2005 e dati<br />
non pubblicati). In seguito alla rimozione del peptide segnale la proteina, nella sua forma<br />
matura, misura 80 amminoacidi e mostra il 32% di identità (26/80) con l’omonima proteina<br />
di An. albimanus (Fig. 1.15).<br />
Figura 1.15 Allineamento della sequenza aminoacidica<br />
(rimossa del peptide segnale) di An. gambiae con l’omologa<br />
di An. albimanus. (In giallo sono mostrati gli aminoacidi<br />
conservati tra le due specie).<br />
Dati in letteratura indicano che l’anofelina di An. albimanus è un potente inibitore della α-<br />
trombina ed è quindi in grado di inibire la coagulazione del sangue (Valenzuela et al.,<br />
1999; Francischetti et al., 1999). Infatti, la funzione principale della α-trombina è quella di<br />
tagliare il fibrinogeno generando la fibrina e un coagulo insolubile. Inoltre regola<br />
l’attivazione di fattori coinvolti nella cascata della coagulazione quali il fattore V, VIII, XI<br />
e la proteina C. Il ruolo cruciale svolto dall’ α-trombina nei processi fisiologici della<br />
coagulazione e negli eventi trombotici ha esercitato una pressione evolutiva negli<br />
organismi ematofagi che ha portato alla selezione di molecole biologicamente attive in<br />
grado di inibire la α-trombina. Inoltre, sono stati isolati inibitori della trombina anche dal<br />
veleno di serpenti e dalle piante (Francischetti et al., 1999).<br />
Confrontando le due sequenze dell’anofelina in figura 1.15, si osservano: una regione<br />
altamente conservata all’estremità N-terminale (APQYA), aminoacidi conservati carichi<br />
38
negativamente (D8, D13, E14, D18, D13 e E43) nella regione centrale ed una arginina (R53)<br />
conservata all’estremità C-terminale. Queste corrispondenze hanno portato all’ipotesi che<br />
l’anofelina di An. gambiae sia anch’essa un’inibitore della trombina, al pari dell’omologa<br />
di An. albimanus (Valenzuela et al., 1999).<br />
Mediante esperimenti di RNAi è stato dimostrato che l’anofelina di An. gambiae è<br />
coinvolta effettivamente nel pasto di sangue. In particolare, zanzare sottoposte a<br />
silenziamento genico mostrano, rispetto alle zanzare non trattate, sia una riduzione di circa<br />
il 15% della capacità di compiere il pasto di sangue sia un aumento del tempo di probing<br />
(rispettivamente p=0,03 e p=0,012). Questa minore tendenza all’alimentazione da parte<br />
delle zanzare trattate potrebbe essere dovuta alla diminuzione del flusso di sangue nella<br />
sede di inoculo giustificata dalla mancanza dell’inibitore α-trombinico (Das et al., 2010).<br />
39
2 Scopo della tesi<br />
Come ampiamente discusso nell’introduzione, durante il pasto di sangue la zanzara inietta<br />
nell’ospite un cocktail di proteine salivari con svariate attività biochimico-farmacologiche<br />
necessarie per l’efficace assunzione del sangue (Ribeiro et al., 2009). Allo stesso tempo,<br />
però, alcune di queste molecole inducono nell’ospite una risposta immunitaria specifica<br />
alla saliva. Tale risposta può essere sfruttata per valutare l’esposizione alle punture di<br />
specie vettrici di patogeni come il plasmodio della malaria e quindi anche al rischio di<br />
trasmissione di tali malattie. Tuttavia, l’utilizzo della saliva come marcatore sierologico<br />
può comportare dei bias nelle stime dovuti alla sua natura che, essendo una miscela<br />
complessa di proteine, può cross-reagire con antigeni di altri organismi ematofagi. Un<br />
aspetto interessante, che sta emergendo dalla analisi comparativa dei trascrittomi salivari di<br />
zanzare appartenenti ai generi Anopheles, Aedes, Culex e di altri insetti ematofagi, è la<br />
possibilità di individuare proteine salivari esclusive del solo genere Anopheles. Queste<br />
proteine, se immunogeniche, potrebbero rappresentare dei validi marcatori sierologici di<br />
esposizione a punture anofeliche ed essere quindi estremamente utili nelle indagini<br />
immuno-epidemiologiche di malaria.<br />
Il mio progetto di dottorato si inquadra in uno studio finalizzato a identificare<br />
proteine salivari di Anopheles gambiae da impiegare quali marcatori epidemiologici di<br />
esposizione umana a punture di questa specie. In particolare, ho concentrato la mia<br />
attenzione principalmente su gSG6, una piccola proteina salivare coinvolta nell’assunzione<br />
del pasto di sangue (Lombardo et al., 2009).<br />
Al fine di ottenere informazioni sulla validità di questo marcatore, sono stati affrontati i<br />
seguenti punti:<br />
1. valutare la sua immunogenicità<br />
2. misurare i livelli anticorpali anti-gSG6 in individui esposti ad elevate densità<br />
anofeliche<br />
3. validarla come marcatore di esposizione a punture<br />
Ho inoltre testato l’immunogenicità di un’altra proteina, l’anofelina, un inibitore α-<br />
trombinico presente nella saliva di An. gambiae. Infine, è stata valutata la cross-reattività<br />
tra gli omologhi gSG6 di An. gambiae e An. funestus.<br />
L’importanza di questi confronti risiede nel fatto che queste due specie, insieme ad An.<br />
arabiensis, rappresentano i tre principali vettori afrotropicali di malaria. Di conseguenza, è<br />
di fondamentale importanza comprendere la cross-reattività della risposta anticorpale alle<br />
40
diverse gSG6, così come all’anofelina, al fine di poter mettere a punto efficaci protocolli di<br />
esposizione alle punture di queste tre specie.<br />
41
3.1 Area di studio e popolazione<br />
3 Materiali e Metodi<br />
Il Burkina Faso, situato nell’Africa Occidentale, è uno degli Stati più poveri del mondo,<br />
con un prodotto interno pro capite tra i dieci più bassi in ordine mondiale e un economia di<br />
tipo prevalentemente rurale. Il paese conta circa 13 milioni di abitanti di cui il 46% ha età<br />
compresa tra 0 e 14 anni. L’aspettativa di vita media è di 44,2 anni e la mortalità infantile è<br />
di circa l’8%. La distribuzione della popolazione e l’andamento economico sono<br />
profondamente influenzati dall’impatto delle malattie infettive e dalla desertificazione. Il<br />
paese è abitato da circa 60 gruppi etnici di cui i sette principali sono: Mossi (più del 40%),<br />
Gurunsi, Senufo, Lobi, Bobo, Mande e i Fulani (www.cia.gov/library/publications/the-<br />
world-factbook/geos/uv.html).<br />
I sieri sono stati raccolti durante sette inchieste trasversali svolte in tre anni successivi<br />
(1994, 1995, 1996) e comprendono sia la stagione delle piogge (Agosto e Ottobre), di alta<br />
trasmissione malarica, che la stagione secca (Marzo) di bassa trasmissione. I campioni di<br />
sangue sono stati raccolti in due villaggi a 35km a nord-est di Ouagadougou (Burkina<br />
Faso) e distanti tra loro 5 km, Barkoundouba e Barkoumbilen (Fig. 3.1). L’area si estende<br />
nel “plateau Mossi”, nella fascia eco-climatica di savana sudanese. La popolazione presa in<br />
esame appartiene a 2 gruppi etnici: Mossi e Fulani. Quest’ultimi, noti come Peulh e<br />
residenti a Barkoundouba, mostrano un background genetico e culturale ben distinto da<br />
quello dei Mossi. Sono pastori nomadi in parte stanziali caratterizzati da tratti non negroidi<br />
di possibile origine caucasoide. Invece, il gruppo etnico dei Mossi proveniente dal<br />
villaggio Barkoumbilen, è una popolazione negroide Sudanese tradizionalmente dedita<br />
all’agricoltura e con una lunga tradizione nell’allevamento stanziale.<br />
42
Figura 3.1 Area di studio<br />
Il campione analizzato in questa tesi consiste complessivamente di 2066 individui. Per<br />
ciascun individuo sono state registrate informazioni relative a età e sesso. Prima<br />
dell’ultima stagione di trasmissione della malaria (che in quest’area va da maggio a<br />
ottobre), esattamente nel mese di giugno del 1996, sono state distribuite a tutta la<br />
popolazione di entrambi i villaggi zanzariere impregnate di permetrina (concentrazione di<br />
1g/m 2 ). Come controllo negativo sono stati usati i sieri di 60 individui di età compresa 1-77<br />
anni recatesi in un noto ospedale romano per analisi ematiche di routine e il cui livello di<br />
esposizione alle punture anofeliche è scarso o addirittura nulla.<br />
3.2 Osservazioni entomologiche<br />
Per ogni inchiesta è stata monitorata e stimata la presenza di zanzare Anopheles vettrici di<br />
malaria presenti in ciascun villaggio. Sono state effettuate catture con insetticidi piretroidi<br />
all’interno delle abitazioni in tre giorni successivi per ciascun mese, da agosto a novembre<br />
1994, a marzo 1995 e da luglio a ottobre per il 1995 e il 1996. Mediante i metodi<br />
immunoenzimatici è stato stimato l’indice di positività alla proteina circumsporozoitica<br />
(CSP) di P.falciparum e l’indice del pasto di sangue umano sulle zanzare raccolte (An.<br />
gambiae e An. funestus). Quindi è stato calcolato il tasso di inoculazione entomologico<br />
moltiplicando l’indice sporozoitico e l’indice del pasto di sangue umano, il prodotto è stato<br />
a sua volta moltiplicato per il numero di zanzare che hanno compiuto il pasto di sangue<br />
nella stanza di cattura e infine il valore derivante è stato suddiviso per il numero di persone<br />
che dormivano nella stessa stanza (Modiano et al., 1998). Le densità anofeliche in ciascuna<br />
inchiesta sono state calcolate dividendo il numero di zanzare raccolte all’interno<br />
dell’abitazione per il numero di occupanti.<br />
43
3.3 Espressione e purificazione di proteine salivari<br />
L’espressione e la purificazione delle proteine salivari sono state eseguite dal Dott.<br />
Raffaele Ronca del Dipartimento di Biologia Strutturale e Funzionale, Università Federico<br />
II di Napoli. Sia la procedura di espressione che di purificazione sono riportate in dettaglio<br />
in Rizzo et al., 2011.<br />
3.4 ELISA<br />
La tecnica ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), che consente di<br />
rivelare complessi antigene-anticorpo, è stata impiegata per verificare la presenza di<br />
anticorpi contro le tre proteine salivari: gSG6 e l’anofelina di An.gambiae e gSG6 di<br />
An.funestus. L’adsorbimento è stato effettuato depositando 50 µl di antigene diluito in<br />
coating buffer (15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, 3mM NaN3, pH 9.6) sul fondo dei<br />
pozzetti di una micropiastra da 96 (Nunc, Multiwell immune plate Maxisorp, M9410 ).<br />
Dopo un’ incubazione over night a 4°C è stato eseguito un lavaggio con PBST (1x PBS,<br />
0.05% Tween 20) e altri tre con acqua distillata per allontanare l’eccesso di antigene non<br />
legato. Successivamente, al fine di saturare i siti liberi, si è provveduto ad una incubazione<br />
di 3 ore a temperatura ambiente con 150 µl di blocking buffer [1% (w/v) latte in polvere<br />
(Marvel) in PBS-T] seguita da altri 4 lavaggi con PBST e acqua distillata. La reazione<br />
antigene-anticorpo è stata fatta avvenire aggiungendo in ciascun pozzetto 50 µl di siero<br />
diluito in Blocking buffer. Ciascun siero è stato testato in duplicato e in un terzo pozzetto<br />
senza antigene. Le piastre sono state incubate overnight a 4°C e quindi lavate di nuovo con<br />
PBST e acqua distillata per eliminare l’eccesso di anticorpi non legati. La rilevazione del<br />
complesso antigene-anticorpo è stata effettuata mediante incubazione per 3 ore a<br />
temperatura ambiente con 100 µl di anticorpo secondario diluito in Blocking buffer. Dopo<br />
aver effettuato 3 lavaggi con PBST si è provveduto all’aggiunta di 100 µl di o-<br />
phenylenediamine dihydrochloride (OPD Sigma #P8287) in 0.05 M di soluzione citrato-<br />
fosfato (pH 5.0) contenente H2O2. Dopo 15 minuti di incubazione al buio e a temperatura<br />
ambiente la reazione colorimetrica è stata bloccata mediante l’aggiunta di 25 µl di H2SO4<br />
2M. A questo punto la presenza del complesso antigene-anticorpo è stata quantificata<br />
mediante lettura della piastra a 492 nm. Nella Tab. 4, sono riportate le concentrazioni degli<br />
antigeni e le diluzioni di anticorpi primari e secondari utilizzati per ciascun esperimento.<br />
44
Ig Antigene [Ag] Diluzione AbI Diluzione AbII<br />
IgG<br />
IgG1<br />
IgG4<br />
Anofelina<br />
gSG6 An. gambiae 10 µg/ml * 1:100<br />
gSG6 An. funestus 10 µg/ml 1:100<br />
gSG6 An. gambiae<br />
+ gSG6 An.<br />
funestus<br />
5 µg/ml<br />
+<br />
5 µg/ml<br />
1:100<br />
gSG6 An. gambiae 10 µg/ml 1:20<br />
gSG6 An. gambiae 10 µg/ml 1:20<br />
Anofelina An.<br />
gambiae<br />
5µg/ml 1:100<br />
1:5000<br />
Anti human-IgG<br />
HRP (Dako P0214)<br />
1:5000<br />
Anti human-IgG<br />
HRP (Dako P0214)<br />
1:5000<br />
Anti human-IgG<br />
HRP (Dako P0214)<br />
1:1000<br />
Anti human IgG1 e<br />
IgG4 (Binding Site<br />
AP006)<br />
1:1000<br />
Anti human IgG1 e<br />
IgG4 (Binding Site<br />
AP009)<br />
1:5000<br />
Anti human-IgG<br />
HRP (Dako P0214)<br />
Tabella 4 Concentrazioni degli antigeni e diluzioni dei sieri utilizzati nelle diverse indagini sperimentali<br />
([Ag]= Concentrazione antigene; Ab I= anticorpo primario; Ab II= anticorpo secondario; * nell’analisi<br />
comparativa con l’anofelina la concentrazione di gSG6 utilizzata per il coating era di 5 µg/ml).<br />
3.5 Analisi statistica<br />
I livelli di anticorpi IgG anti gSG6, espressi come OD finali, sono stati calcolati per<br />
ciascun siero come il valore medio della densità ottica per i pozzetti con l’antigene a cui è<br />
stato poi sottratto il valore OD senza antigene. Quando il coefficiente di variazione nei<br />
duplicati dei sieri è risultato superiore al 20% questi sono stati esclusi dall'analisi. La<br />
variazione intra e inter-specifica del saggio è risultata al di sotto del 20% dei valori medi<br />
dei controlli.<br />
La soglia di sieropositività è stata calcolata come media delle densità ottiche dei sieri di<br />
controllo +3 deviazioni standard. Le differenze stagionali dei livelli di IgG sono state<br />
calcolate mediante il test non parametrico di Kruskal-Wallis corretto con il Dunn’s post<br />
test per comparazioni multiple. Le differenze dei livelli anticorpali tra gruppi indipendenti<br />
è stata effettuata con il test di Mann-Whitney. Le comparazioni di frequenze sono state<br />
45
comparate mediante test del Chi-quadro. I programmi utilizzati per l’analisi statistica sono<br />
stati i seguenti: Statistica 8 (StatSoft Inc, Tulsa, USA) e GraphPad Prism 5.0 (GraphPad<br />
Software Inc., La Jolla, CA).<br />
46
4 Risultati e discussioni<br />
4.1 Espressione e purificazione di gSG6 di An. gambiae<br />
Come precedentemente menzionato, la proteina salivare gSG6 è stata espressa dal Dott. R.<br />
Ronca presso il Dipartimento di Biologia Strutturale e Funzionale dell’Università Federico<br />
II. Per completezza vengono qui riportati i passaggi principali dell’espressione e<br />
purificazione della proteina in E. coli.<br />
Dopo induzione dell’espressione con IPTG, la presenza della proteina è stata verificata<br />
mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS. Come è possibile<br />
osservare in Fig. 4.1 la proteina è presente in abbondanza nel campione (banda a circa<br />
13kDa).<br />
Figura 4.1 Analisi dell’espressione di gSG6 in E.coli<br />
(Un=campione non indotto; Ind= campione indotto; MW=<br />
marcatore di peso molecolare).<br />
La solubilità della proteina è stata verificata mediante sonicazione ed analisi delle frazioni,<br />
solubile ed insolubile. La proteina gSG6 è risultata presente nella porzione insolubile e di<br />
conseguenza è stato necessario solubilizzarla con agenti denaturanti. Una volta isolata dai<br />
corpi di inclusione è stata sottoposta a cromatografia d’affinità in condizioni denaturanti ed<br />
il grado di purificazione di gSG6 dopo cromatografia d’affinità è mostrata nella Fig. 4.2.<br />
47
Figura 4.2 Analisi della frazione di gSG6 ottenuta dopo<br />
cromatografia d'affinità (AC= frazione di eluato; MW=<br />
marcatore di peso molecolare).<br />
Successivamente, le frazioni purificate sono state rinaturate e ulteriormente purificate<br />
mediante cromatografia a scambio anionico (Fig. 4.3).<br />
Figura 4.3 Analisi della frazione di gSG6 ottenuta dopo<br />
cromatografia a scambio anionico (IEC= frazione di eluato; MW<br />
marcatore di peso molecolare).<br />
Infine la proteina è stata ulteriormente purificata mediante RP-HPLC (Reverse Phase High<br />
Pressure Liquid Chromatography) per verificarne l’omogeneità come mostrato in Fig. 4.4<br />
A, dove si vedono 2 picchi con tempi di ritenzione diversi. Il primo picco corrisponde ad<br />
uno spike elettrico che si verifica ad inizio corsa cromatografica, dovuto ad un<br />
cambiamento nella conduttanza conseguente al cambio di tampone. Il secondo picco<br />
corrisponde invece alla proteina ricombinante gSG6. Infine, mediante spettrometria di<br />
massa (Fig. 4.4B) è stato possibile identificare un picco principale corrispondente a una<br />
massa di 12244.4 Da che corrisponde alla massa attesa per gSG6 ricombinante.<br />
48
A B<br />
Figura 4.4 (A) Analisi della frazione purificata di gSG6<br />
mediante Reverse Phase HPLC; (B) Analisi della frazione<br />
purificata mediante Spettrometria di massa.<br />
4.2 Densità anofeliche nei due villaggi campionati<br />
Le specie osservate all’interno delle abitazioni dei due villaggi sono An gambiae ed An<br />
funestus. Quest’ultima, osservata con frequenze relative nettamente inferiori della prima, è<br />
stata rilevata occasionalmente (ottobre 1994, marzo 1995 e ottobre 1995). Da questo dato<br />
emerge come i soggetti utilizzati per il presente studio fossero esposti a punture<br />
provenienti principalmente da An. gambiae (Fig. 4.5).<br />
Figura 4.5 Densità di Anopheles gambiae e An. funestus.<br />
Le densità di An. gambiae per persona per notte osservate non sono significativamente<br />
diverse tra i due villaggi campionati per tutte le inchieste, fatta eccezione agosto 1994<br />
(p=0.008), mentre si osserva una evidente variabilità stagionale. Infatti, le densità osservate<br />
mostrano livelli elevati durante la stagione delle piogge (agosto-ottobre) e minimi durante<br />
la stagione secca (marzo) del periodo 1994-1995. Al contrario, si osserva un netto calo<br />
delle densità anofeliche durante il campionamento dei mesi di agosto e ottobre 1996.<br />
49
Questa differenza, significativamente diversa dalle stagioni precedenti (p
del 58,5% (p=0,01) e del 94,5 % (p=0.001) di An. gambiae s.l. e di An. funestus che<br />
avevano effettuato il pasto di sangue (Gimnig et al.,2003). I dati in bibliografia indicano<br />
quindi che la riduzione delle densità anofeliche osservata nel nostro studio del 1996 era<br />
effettivamente da attribuirsi all’applicazione delle zanzariere impregnate nei due villaggi di<br />
studio.<br />
4.3 Analisi della risposta IgG anti- gSG6 di An. gambiae<br />
4.3.1 Immunogenicità di gSG6<br />
Analizzando i livelli anticorpali anti gSG6 negli individui esposti e in quelli di controllo si<br />
osserva una risposta significativamente maggiore (p
Sebbene la figura consideri i soli individui considerati “responders”, ovvero quei individui<br />
il cui valore di OD è al di sopra del cut-off, la stessa analisi effettuata senza questa<br />
distinzione mostra uno schema simile in tutti i periodi campionati. Bisogna inoltre tenere in<br />
considerazione che, nonostante An. gambiae non sia presente nelle aree geografiche di<br />
provenienza degli individui di controllo (città di Roma), questi ultimi potrebbero essere<br />
esposti, presumibilmente a basso livello e principalmente nelle zone rurali piuttosto che<br />
urbane, a punture provenienti da anofeli italiane appartenenti ad altre specie, come ad<br />
esempio An. plumbeus o specie appartenenti al complesso An. maculipennis oppure ad altri<br />
culicidi. Quindi, la risposta negli individui di controllo pressoché nulla conferma che in<br />
persone non esposte a punture di An. gambiae non si ha alcuna cross-reazione con altre<br />
proteine salivari.<br />
È importante osservare come, anche durante i periodi a bassa esposizione a punture<br />
(marzo), i soggetti esposti mostrino valori apprezzabili di OD. Questa osservazione<br />
suggerisce che gSG6 potrebbe essere utilizzata efficacemente anche in contesti a bassa o<br />
media esposizione a punture di An. gambiae, dove le stime basate sull’utilizzo dei metodi<br />
tradizionali risultano di scarsa efficacia.<br />
Osservando il valore di OD individuale per tutte le inchieste complessivamente si rileva<br />
una eterogeneità nella risposta anticorpale (Fig. 4.8). I livelli di IgG anti gSG6 assumono<br />
valori di OD che vanno da 0 a 1,8 mostrando un intervallo di risposta molto variabile.<br />
Stabilendo la soglia di positività (descritta nel paragrafo 3.5) corrispondente a 0,133 OD, la<br />
percentuale di non rispondenti è pari al 34% mentre i rispondenti rappresentano il 66%<br />
della popolazione. Questo valore suggerisce che gSG6 è fortemente immunogenica e in<br />
grado di stimolare una risposta immunitaria specifica nell’ospite. La variabilità riscontrata<br />
nei valori di OD, così come la percentuale di non rispondenti all’interno del campione<br />
analizzato, potrebbero essere dovuti a diversi fattori legati all’ospite come l’età, la stagione<br />
di trasmissione e il gruppo etnico, che verranno presi in esame nei paragrafi successivi.<br />
52
Figura 4.8 Distribuzione dei valori OD misurati in tutti gli<br />
individui esposti.<br />
4.3.2 Variazione del titolo anticorpale in accordo alla stagione di trasmissione<br />
Come accennato nell’Introduzione, la trasmissione della malaria è strettamente legata a<br />
fattori climatici quali la temperatura e le precipitazioni piovose. La temperatura influenza<br />
direttamente il periodo di incubazione del parassita nel vettore, così come la durata dello<br />
sviluppo larvale e del ciclo gonotrofico di quest’ultimo, mentre le precipitazioni svolgono<br />
un ruolo cruciale nella determinazione della distribuzione e della dinamica di popolazione<br />
delle specie vettrici, dato che lo sviluppo larvale di queste avviene in raccolte d’acqua<br />
stagnante. In linea generale è quindi possibile affermare che i livelli di trasmissione della<br />
malaria sono correlati alla stagionalità. In Burkina Faso, come in tutti i paesi delle fasce<br />
ecoclimatiche di Savana Sudanese e Guineana dell’Africa sub-Sahariana, si distinguono<br />
due stagioni: la stagione delle piogge (che va da maggio ad ottobre) e quella secca. In Fig.<br />
4.9 è stato riportato il tasso di inoculazione entomologico (Entomological Inoculation Rate<br />
o EIR) calcolato per le tre diverse inchieste e suddiviso per i due villaggi: Barkoumbilen e<br />
Barkoundouba. Durante la stagione delle piogge del 1994, si osserva come la trasmissione<br />
aumenta gradualmente da agosto ad ottobre per poi diminuire a novembre. Il livello si<br />
abbassa notevolmente raggiungendo valori prossimi allo zero durante la stagione secca<br />
(marzo ’95) per poi innalzarsi nuovamente durante la successiva stagione delle piogge<br />
(1995). I livelli di trasmissione che si raggiungono in questo caso sono più bassi rispetto<br />
alla stagione precedente, molto probabilmente a causa delle scarse precipitazioni<br />
verificatesi nel 1995 (860 mm nel 1994, 609 mm nel 1995). Nel 1996 invece, si registrano<br />
dei valori di EIR molto bassi (Modiano et al., 1998). Ciò è in accordo con quanto<br />
precedentemente descritto per le densità anofeliche nel paragrafo 4.2. Infatti,<br />
l’applicazione delle zanzariere impregnate di permetrina all’inizio della stagione di<br />
53
trasmissione nelle due villaggi non solo comporta un abbassamento delle densità vettoriali<br />
ma determina anche una riduzione della trasmissione all’interno dell’abitazione pari al<br />
90% rispetto alle inchieste precedenti. Inoltre, confrontando i valori di EIR delle due etnie<br />
provenienti dai due villaggi esaminati non si riscontrano differenze significative per quanto<br />
riguarda tutte le tre inchieste.<br />
Figura 4.9 Tasso di inoculazione entomogico misurato nelle 3<br />
inchieste e stratificato per gruppo etnico (Modiano et al.,<br />
1998).<br />
L’analisi della risposta anticorpale alla proteina salivare gSG6 nelle sette diverse inchieste<br />
si mostra un andamento che varia in accordo con le stagioni di trasmissione. Come<br />
mostrato in Fig. 4.10 la risposta IgG anti- gSG6 nei “responders” aumenta o persiste ad alti<br />
livelli durante la stagione delle piogge, momento in cui le densità di Anopheles sono tali da<br />
esporre l’individuo a frequenti e continue punture. Invece, durante la stagione secca si<br />
assiste a una caduta significativa del titolo anticorpale, che si innalza nuovamente durante<br />
la successiva stagione di trasmissione, evidenziando una dinamica temporanea della<br />
risposta immunitaria alla proteina salivare. Questo fenomeno riveste un ruolo cruciale nella<br />
prospettiva di utilizzare gSG6 (e più in generale le proteine salivari) come marcatori di<br />
esposizione ad Anopheles, in quanto permette di seguire l’andamento temporale<br />
dell’esposizione all’antigene salivare e quindi alle punture del vettore. È infatti importante<br />
sottolineare che, dopo pochi mesi di bassa esposizione al vettore, la produzione di IgG<br />
decresce in maniera significativa per poi riprendere nella stagione successiva quando la<br />
stimolazione antigenica raggiunge livelli costanti ed elevati. Infatti, come è possibile<br />
osservare dalla Fig. 4.10, i livelli anticorpali aumentano significativamente da marzo ad<br />
agosto-ottobre 1995 (p
differenza nel titolo anticorpale tra periodi di diversa esposizione. Bisogna notare come<br />
questa dipendenza della risposta immunitaria dell’ospite umano all’esposizione antigenica<br />
di An. gambiae sia già stata descritta in lavori simili. In uno studio longitudinale di 8 mesi,<br />
effettuato su un gruppo di 88 soldati francesi, è stata misurata la risposta anticorpale alla<br />
saliva di An. gambiae prima, durante e al ritorno da un viaggio in paesi dell’Africa<br />
tropicale. I livelli di IgG anti-saliva aumentavano nel 41% degli individui durante il<br />
periodo di soggiorno (p
percentuale di responders rimane alta durante questa stagione probabilmente a causa di un<br />
livello basale di esposizione della popolazione dovuto a punture di Anopheles all’esterno<br />
delle abitazioni durante le ore serali.<br />
Figura 4.11 Percentuali di responders nelle 7 inchieste<br />
(wiskers: 95% intervallo di confidenza; i valori di p sono stati<br />
calcolati mediante test del Chi Quadro e corretti secondo il<br />
metodo Yates; **, 0,001< p
Figura 4.12 Livelli di OD nei responders appartenenti ai due gruppi<br />
etnici nelle 7 inchieste (M=Mossi; F=Fulani; box: 25%-75%; wiskers:<br />
5%-95%; linea: mediana; punti:outlier; i valori di p sono stati calcolati<br />
mediante Mann-Whitney U test; *, p
Figura 4.13 Percentuali di responders nei due gruppi etnici e<br />
nelle 7 inchieste (M=Mossi; F=Fulani; wiskers: 95% intervallo<br />
di confidenza; i valori di p sono stati calcolati mediante test<br />
del Chi-quadro; **, 0,001< p
e 1995) si assiste ad un aumento significativo della percentuale dei responders (p
(Modiano D et al., 1996,1998,1999; Luoni et al., 2001). Risultati simili sono stati ottenuti<br />
in uno studio condotto tra il 1998 e il 2000 in 4 villaggi del Mali, abitati da due gruppi<br />
etnici: Fulani e Dogon. I livelli di IgM, IgE, IgG, IgG1 e IgG3 per estratti di parassita nella<br />
forma di schizonte sono risultati molto più elevati per i Fulani rispetto ai Dogon (Dolo et<br />
al., 2005, Bolad et al., 2005). Inoltre, questa forte risposta immunitaria osservata nei Fulani<br />
non si limita solo agli antigeni di P. falciparum bensì anche ad altri agenti patogeni. In<br />
particolare è stata riscontrata una risposta umorale maggiore a Toxoplasma gondii e al<br />
Morbillivirus (agente eziologico del morbillo) nei Fulani quando questi sono stati<br />
confrontati con gruppi simpatrici del Burkina Faso e del Mali (Bolad et al., 2005). Infine,<br />
sempre confrontando i Fulani con le altre etnie simpatriche provenienti dal Burkina Faso,<br />
sono stati rilevati nei Fulani alti livelli anticorpali ad antigeni di Schistosoma<br />
haematobium, HBV (virus dell’epatite B) e Cytomegalovirus (Modiano D., dati non<br />
pubblicati). Questa forte risposta immunitaria verso i differenti antigeni potrebbe essere<br />
dovuta ad alcuni mediatori cellulari o solubili della risposta innata e della risposta Th1 o<br />
Th2, o ancora coinvolgere le cellule T regolatorie (Treg).<br />
Per verificare tali ipotesi sono state effettuate delle analisi di espressione di geni correlati<br />
alla risposta Th1 (cellulo-mediata) e Th2 (umorale) delle cellule mononucleate del sangue<br />
periferico di Mossi e Fulani provenienti dal Burkina Faso. L’analisi ha mostrato che la<br />
maggior parte dei geni presi in considerazione rivelano un maggiore profilo di espressione<br />
nei Fulani rispetto ai Mossi. I geni maggiormente espressi sono citochine e fattori di<br />
trascrizione correlati alla risposta Th1 (INF-gamma, IL-18) e Th2 ( IL-4, IL-9 GATA-3).<br />
Tuttavia, nei Fulani si osserva una ridotta espressione dei geni FOXP3 e CTLA4 che<br />
svolgono un ruolo importante nella tolleranza immunologica. La ridotta espressione di<br />
FOXP3 nelle cellule mononucleate del sangue dei Fulani coinvolge direttamente l’attività<br />
delle cellule Treg suggerendo che l’elevata risposta Th1 e Th2 riscontrata nei Fulani possa<br />
essere collegata ad alterazioni della risposta immunosoppressiva mediata da questo tipo<br />
cellulare (Torcia et al., 2008).<br />
Le cellule T regolatorie, infatti, giocano un ruolo cruciale nella regolazione della risposta<br />
immunitaria ai patogeni e nel mantenimento dell’omeostasi immunologica in quanto<br />
responsabili dei meccanismi di immunosoppressione e del riconoscimento di antigeni<br />
autologhi e non. Le Treg sono prodotte naturalmente nel timo o negli organi linfoidi<br />
secondari in risposta ad antigeni esogeni. Esprimono le glicoproteine di membrana CD4 e<br />
CD25 e dopo attivazione esprimono il fattore di trascrizione FOXP3, cruciale per il loro<br />
sviluppo e la loro funzione. Il loro effetto immunosoppressivo avviene attraverso il<br />
60
contatto cellulare e/o produzione di citochine down regolatorie quali IL-10 e TGF-beta<br />
(Janeway, 2005). Nelle infezioni parassitarie, le Treg limitano l’entità della risposta<br />
effettrice riducendo in questo modo il danno tissutale ma nello stesso tempo favoriscono la<br />
sopravvivenza del patogeno (Belkaid et al., 2006).<br />
L’analisi dei profili di espressione di geni correlati alla funzione delle Treg in cellule<br />
CD4+ e CD25+ di Mossi e Fulani, hanno dimostrato che quest’ultimi presentano una bassa<br />
espressione di geni cruciali per l’attività delle Treg. In particolare, i Fulani mostrano bassi<br />
livelli di espressione della citochina TGF-beta, del recettore CTLA-4 e di FOXP3 (Torcia<br />
et al., 2008), suggerendo che, per quest’etnia, l’attività regolatoria potrebbe essere<br />
inefficiente o addirittura assente.<br />
4.3.4 Variazione del titolo anticorpale con l’età<br />
La risposta IgG anti-gSG6 è stata analizzata in relazione all’età dei soggetti testati. Il<br />
campione esaminato è stato diviso in cinque gruppi di età, così ripartiti: 1-5 anni (a cui mi<br />
riferirò nella successiva discussione come gruppo 1), 5-10 anni (gruppo 2), 10-20 anni<br />
(gruppo 3), 20-40 anni (gruppo 4) e >40 anni (gruppo 5). Dall’analisi è emerso un<br />
andamento simile per entrambi i gruppi etnici, con una diminuzione progressiva del titolo<br />
anticorpale in funzione dell’avanzamento dell’età. Come mostrato in Fig. 4.16, la risposta<br />
ha inizio in età precoce e si mantiene a livelli elevati fino a circa 10 anni per poi diminuire<br />
progressivamente e raggiungere livelli più bassi negli anziani. Tuttavia, la risposta non<br />
scende mai al di sotto di quella osservata nei gruppi di controllo. A differenza dei Mossi, i<br />
Fulani rivelano una forte risposta anticorpale anti-gSG6 nei primissimi anni di vita (1-5<br />
anni) e il titolo anticorpale diminuisce in modo più marcato con l’aumento dell’età. Questo<br />
andamento, mostrato in Fig. 4.16 per Agosto 1994, è simile con piccole variazioni anche<br />
in tutte le altre stagioni esaminate.<br />
61
Figura 4.16 Variazione dei livelli di OD fra i responders in<br />
funzione dell'età (Agosto 1994) (M=Mossi; F=Fulani; box:<br />
25%-75%; wiskers: 5%-95%; linea: mediana; punti:outlier).<br />
Analizzando per ciascuna inchiesta la percentuale di responders nei 5 gruppi di età si<br />
osserva un trend molto simile. Per ciascuna stagione, la prevalenza dei responders<br />
diminuisce con l’aumento dell’età raggiungendo valori minimi intorno al 20% nel gruppo 4<br />
(Fig. 4.17 e 4.18). Le prevalenze dei Fulani nei primi due gruppi di età sono marcatamente<br />
più alte rispetto a quelle dei Mossi. In particolare, la percentuale dei responders nei<br />
bambini al di sotto dei 10 anni di età supera per la maggior parte delle stagioni l’80% con<br />
uno scarto percentuale del 20% (Fig. 4.18). Nei Mossi, invece, si osserva una maggiore<br />
variabilità stagionale con prevalenze nettamente al di sotto dell’80% osservato per i Fulani<br />
(Fig. 4.17). Nonostante ciò i Mossi mostrano, a differenza dei Fulani, una maggiore<br />
variabilità di risposta in funzione della stagione in tutti i gruppi di età.<br />
62
110%<br />
100%<br />
90%<br />
80%<br />
70%<br />
60%<br />
50%<br />
40%<br />
30%<br />
20%<br />
10%<br />
0%<br />
110%<br />
100%<br />
90%<br />
80%<br />
70%<br />
60%<br />
50%<br />
40%<br />
30%<br />
20%<br />
10%<br />
0%<br />
Mossi<br />
0-5 5-10 10-20 20-40 >40<br />
Figura 4.17 Variazione stagionale della percentuale dei<br />
responders nel gruppo etnico dei Mossi in funzione dell’ età<br />
Fulani<br />
0-5 5-10 10-20 20-40 >40<br />
Figura 4.18 Variazione stagionale della percentuale dei<br />
responders nel gruppo etnico dei Fulani in funzione dell’ età<br />
Ago '94<br />
Ott '94<br />
Mar '95<br />
Ago '95<br />
Ott '95<br />
Ago '96<br />
Ott '96<br />
Ago '94<br />
Ott '94<br />
Mar '95<br />
Ago '95<br />
Ott '95<br />
Ago '96<br />
Ott '96<br />
Questa suddivisione in cinque gruppi ha permesso di osservare le differenze tra le classi di<br />
età in intervalli molto ristretti, tuttavia il basso numero di individui non permette in alcuni<br />
casi di effettuare una analisi statistica attendibile. Dal momento che è stata osservata una<br />
differenza, sia di riposta anticorpale che di prevalenza, tra i primi 2 gruppi di età e i restanti<br />
3 gruppi, si è deciso di dividere il campione esaminato in 2 gruppi principali: 1-10 (gruppo<br />
a) e >20 (gruppo b) anni. In questo modo è stato possibile verificare eventuali differenze<br />
63
statistiche tra i due gruppi di età. Nella Tab. 5, è stato riportato, per ciascuna inchiesta, la<br />
mediana dei valori OD fra i responders e la prevalenza suddivisi per gruppo di età e per<br />
etnia, nonché il valore p di significatività statistica calcolata. In tutte le stagioni si<br />
osservano livelli anticorpali anti-gSG6 più alti nei bambini rispetto agli adulti. Inoltre, in<br />
otto casi su quattordici le differenze sono statisticamente significative. La differenza di<br />
risposta tra i due gruppi si evidenzia maggiormente analizzando le prevalenze. In quasi<br />
tutte le inchieste la percentuale dei responders è superiore nei bambini, eccetto nel mese di<br />
Marzo 1995 in cui si registra un valore simile nei due gruppi. Le differenze sono<br />
statisticamente significative in dieci casi su quattordici.<br />
stagione etnia Mediana OD prevalenze<br />
Ago ‘94<br />
Ott ‘94<br />
Mar ‘95<br />
Ago ‘95<br />
Ott ‘95<br />
M 0,614<br />
(46)<br />
F 0,714<br />
(44)<br />
M 0,535<br />
(52)<br />
F 0,686<br />
(18)<br />
M 0,290<br />
(20)<br />
F 0,661<br />
(27)<br />
M 0,592<br />
(75)<br />
F 0,646<br />
(53)<br />
M 0,519<br />
(77)<br />
F 0,925<br />
(45)<br />
1-10 (n) >20 (n) p M 1-10 (n) >20 (n) p C<br />
0,242<br />
(27)<br />
0,298<br />
(18)<br />
0,327<br />
(20)<br />
0,342<br />
(11)<br />
0,229<br />
(15)<br />
Ago ‘96<br />
Ott ‘96<br />
M 0,414<br />
(23)<br />
F 0,958<br />
(20)<br />
M 0,505<br />
(21)<br />
F 0,718<br />
(55)<br />
0,405<br />
(10)<br />
ns 0,72 (32) 0,37 (27) 0,0154<br />
0,379 (7) ns 1 (20) 0,41 (17)
Figura 4.19 Prevalenze e livelli anticorpali contro alcuni<br />
antigeni di Plasmodium falciparum in Mossi e Fulani<br />
(Modiano, 1999)<br />
Al contrario, ci sono pochi dati in letteratura che descrivono la risposta anticorpale alla<br />
saliva e/o proteine salivari di An. gambiae in funzione dell’età. Per quanto riguarda la<br />
risposta umorale alla saliva di An. gambiae, sono stati misurati i livelli di anticorpi del tipo<br />
IgG in sieri di bambini senegalesi da 2 mesi a 5 anni di età, evidenziando che il titolo<br />
66
anticorpale diminuisce gradualmente a partire da 1 anno di età (Fig. 4.20) (Remoue F et<br />
al., 2006).<br />
Figura 4.20 Livello di anticorpi IgG antisaliva in funzione<br />
dell’età in bambini senegalesi (Remoue et al.,2005).<br />
In uno studio successivo, gli stessi autori hanno misurato i livelli di anticorpi specifici IgG<br />
in bambini del Senegal di età compresa tra 6 mesi e 5 anni utilizzando, al posto della<br />
saliva, un peptide di gSG6 di An. gambiae: gSG6-P1. Il trend osservato nei bambini è<br />
simile a quello riscontrato precedentemente utilizzando la saliva come antigene. L’analisi<br />
effettuata anche su bambini di età compresa tra 2 e 12 mesi di età ha permesso di<br />
evidenziare la presenza di elevati livelli di IgG specifiche in questa fascia di età. Dal<br />
momento che i bambini vengono maggiormente protetti con zanzariere dalle loro madri, è<br />
possibile che, almeno in parte, l’elevata presenza di anticorpi anti- gSG6-P1 sia dovuta a<br />
trasferimento passivo da madre a figlio durante la gravidanza e/o l’allattamento. E’ noto,<br />
infatti, che le IgG materne possono persistere nel sangue del bambino fino a nove mesi<br />
dopo la nascita ( Grindstaff et al., 2003).<br />
L’andamento della risposta anticorpale in funzione dell’età osservata nei nostri esperimenti<br />
trova riscontro anche in studi precedenti condotti su Aedes vexans. In particolare, sono stati<br />
misurati i livelli di IgE e IgG specifici ad estratti salivari in 1460 canadesi di età compresa<br />
tra 1 mese e 70 anni. I livelli di IgG raggiungono livelli elevati precocemente, intorno a 1-6<br />
mesi di età. Successivamente, il titolo anticorpale diminuisce gradualmente dopo i 5 anni<br />
67
di età e il livello raggiunto intorno ai 20 anni è simile a quello poi osservato negli adulti<br />
(Fig. 4.21) (Peng and Simons, 2004).<br />
Figura 4.21 Livelli anticorpali anti-saliva di Ae. Vexans in<br />
funzione dell’età (Peng and Simons, 2004)<br />
È stato ipotizzato che questo descrescendo della risposta anticorpale con l’età sia correlato<br />
ad una naturale desensitizzazione dovuta a ripetute e prolungate esposizioni alle punture.<br />
Infatti, le reazioni cutanee umane a punture di zanzara sono state classificate in 5 fasi<br />
(Mellanby, 1946) che coinvolgono diversi meccanismi immunologici, alcuni dei quali si<br />
sovrappongono. Le fasi sono così suddivise:<br />
Fase 1: gli individui che non sono mai stati esposti ad una determinata specie di zanzara<br />
non mostrano reazioni in seguito alla prima puntura. Ci sono molte indicazioni che<br />
dimostrano la necessità di un periodo di sensitizzazione alla puntura di zanzara prima di<br />
sviluppare una reazione cutanea. I primi studi effettuati da Dubin e collaboratori nel 1948<br />
dimostrarono che estratti totali di An. quadrimaculatus erano in grado di stimolare una<br />
risposta immediata nei conigli e Hudson 10 anni più tardi (1958) mostrò che erano<br />
necessarie 12 punture di Ae. aegypti per indurre la risposta nel coniglio. Heilesen (1949)<br />
confermò nei bambini quanto visto da Mellanby negli adulti, dimostrando che, se questi<br />
non sono mai stati esposti ad Ae. aegypti, la prima puntura non determina lo sviluppo di<br />
una reazione ma che sono necessari un paio di giorni. Infine, Brummer-Korvenkontio<br />
(1990) dimostrò che dopo 40-60 punture di Ae. aegypti la produzione di IgG coincideva<br />
con il manifestarsi delle reazioni cutanee.<br />
68
Fase 2: in pochi giorni, e dopo altre punture, si manifesta una reazione ritardata. A tal<br />
riguardo esperimenti in vitro condotti da Peng e collaboratori (1996b) con estratti di<br />
ghiandole salivari di Ae. Vexans, hanno dimostrato che in soggetti con una reazione<br />
ritardata, la proliferazione linfocitaria è maggiore. Questo dato è stato ulteriormente<br />
confermato da Simons e Peng (2001) che per i loro studi hanno utilizzato allergeni<br />
ricombinanti della saliva di Ae. aegypti.<br />
Fase 3: in seguito a ripetute punture si sviluppa una reazione immediata a cui fa seguito<br />
una riduzione del periodo di latenza precedente alla reazione ritardata (McKiel and West,<br />
1961). Questa fase appare a pochi minuti dalla puntura e raggiunge nell’uomo il livello<br />
massimo in 15-30 minuti (McKiel, 1959). La reazione consiste in un ponfo circondato da<br />
un alone eritematoso e accompagnato da prurito. Diversi studi hanno dimostrato che questo<br />
tipo di reazione è mediato da anticorpi di tipo IgE ed IgG e da istamine (Brummer-<br />
Korvenkontio et al., 1994; Peng et al., 1995, 1996a; Reunala et al., 1994; Horsmanheimo<br />
et al., 1996). In particolare, sono state identificate delle IgG specifiche appartenenti alle<br />
sottoclassi IgG1 e IgG4 (Reunala et al., 1990, 1994; Brummer-Korvenkontio et al., 1994).<br />
Sebbene sia ancora da chiarire il ruolo svolto dalle IgG specifiche è stato ipotizzato una<br />
correlazione con lo sviluppo della risposta cutanea (Wilson and Clements, 1965) oppure<br />
che possano essere coinvolte nello sviluppo della reazione allergica, probabilmente<br />
attraverso un meccanismo locale di ipersensibilità mediata da complessi antigene (della<br />
zanzara) e anticorpi specifici (Peng et al., 1996b).<br />
Fase 4: dopo successive esposizione, scompare la risposta ritardata e persiste soltanto una<br />
reattività di tipo immediato.<br />
Fase 5: individui ripetutamente esposti per un lungo periodo a elevato numero di punture<br />
possono sviluppare tolleranza e non mostrare più una risposta cutanea. In uno studio<br />
prospettico, Peng e collaboratori, hanno sottoposto un individui, fino ad allora mai esposto<br />
a Cx. quinquefasciatus, a 100 punture ogni 2 settimane per 48 settimane. I risultati hanno<br />
dimostrato che la risposta ritardata e immediata si sviluppa verso la terza settimana,<br />
raggiungendo livelli elevati tra la 5-19 a settimana e scompare alla 26 a settimana insieme<br />
alla risposta IgE e IgG (Peng and Simons, 1998). Questi risultati suggeriscono che<br />
l’andamento decrescente della risposta IgG-anti gSG6 in funzione dell’età possa essere<br />
correlata al fenomeno di desensitizzazione che probabilmente avviene durante l’infanzia e<br />
l’adolescenza (16-18 anni).<br />
69
4.4 Analisi delle sottoclassi IgG1 e IgG4 anti- gSG6 di An. gambiae<br />
Come precedentemente descritto, durante la fase di sensitizzazione vengono prodotti<br />
diversi isotipi anticorpali contro la saliva di zanzara, tra cui le IgE e le IgG. Inoltre, diversi<br />
studi dimostrano la produzione e quindi la presenza di specifiche sottoclassi di IgG in<br />
seguito all’esposizione a punture di insetti ematofagi. In particolare, sono state rilevate le<br />
sottoclassi IgG1 e IgG4 in risposta alla saliva sia di Triatoma infestans, responsabile della<br />
malattia di Chagas (Nascimento et al., 2001), sia di Aedes vexans (Simons and Peng,<br />
1999) sia di Ae. communis (Brummer-Korvenkontio et al., 1994). Dal momento che i dati<br />
in letteratura si riferiscono alla specificità di questi anticorpi verso la saliva o gli estratti<br />
salivari, abbiamo ritenuto opportuno verificare la presenza di una risposta specifica delle<br />
sottoclassi di IgG alla proteina salivare gSG6 di An. gambiae. La misurazione dei livelli di<br />
IgG1 e IgG4 è stata effettuata su un sottocampione della popolazione del Burkina Faso,<br />
costituito da individui appartenenti ad entrambi i gruppi etnici classificati nell’analisi<br />
precedente come responders a gSG6 e che sono stati campionati per tre inchieste<br />
consecutive: Agosto 1994, Ottobre 1994 e Marzo 1995.<br />
4.4.1 Variazione stagionale dei livelli di IgG1 e IgG4<br />
Sono stati confrontati i livelli di IgG1 e IgG4 per ciascuna inchiesta suddividendo il<br />
campione per etnia. Come mostrato in figura 4.22, entrambe le sottoclassi esibiscono, in<br />
generale, una variazione del titolo in accordo alla stagione di trasmissione; in accordo con<br />
quanto già visto e discusso in precedenza questa variazione è evidente nei Mossi e non nei<br />
Fulani. In particolare, mentre nei Fulani i livelli di IgG1 non mostrano delle differenze<br />
stagionali, nei Mossi si rileva una differenza statisticamente significativa del titolo<br />
anticorpale tra la stagione delle piogge (alta trasmissione) e la successiva stagione secca<br />
(bassa trasmissione) (Agosto 1994-Marzo 1995, p
Figura 4.22 Andamento stagionale dei livelli di IgG1 e IgG4<br />
anti gSG6 nei due gruppi etnici, Mossi e Fulani (linea:<br />
mediana; i valori di p sono stati calcolati mediante Kruskal-<br />
Wallis test; i confronti multipli sono stati corretti secondo il<br />
metodo di Dunn;**, 0,001< p
1.8<br />
1.6<br />
1.4<br />
1.2<br />
1.0<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
0.0<br />
Mossi Fulani<br />
Ago ‘94 Ott ‘94 Mar ’95<br />
(60) (56) (32)<br />
IgG1<br />
IgG4<br />
1.8<br />
1.6<br />
1.4<br />
1.2<br />
1.0<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
0.0<br />
**<br />
*** ***<br />
Ago ‘94 Ott ‘94 Mar ’95<br />
(63) (30) (29)<br />
Figura 4.23 Differenze dei livelli di IgG1 e IgG4 in ciascuna<br />
inchiesta ed etnia (box: 25%-75%; wiskers: 5%-95%; punto:<br />
mediana; i valori di p sono stati calcolati mediante Mann<br />
Whitney; **, 0,001< p
emerge che le IgG4 sono associate a diverse condizioni cliniche. Alcune di queste<br />
associazioni suggeriscono un effetto protettivo nell’immunoterapia allergene specifica ma<br />
anche nell’induzione della tolleranza (Ruiter et al., 2007). Sono state ipotizzate due<br />
modalità con cui le IgG4 possono indurre il fenomeno della desensitizzazione:<br />
intervenendo come anticorpi bloccanti oppure interferendo con la presentazione facilitata<br />
dell’allergene alle IgE (Aalberse et al., 2009). Nel primo caso le IgG4 risultano dotate di<br />
una notevole affinità per l’allergene specifico, al quale sono in grado di legarsi in<br />
competizione con le IgE. Sono pertanto definite “bloccanti”, poiché impediscono<br />
all’allergene di raggiungere la cellula bersaglio a livello dell’organo di reazione, inibendo<br />
l’attivazione mastocitaria e il rilascio di mediatori. Il secondo meccanismo prevede<br />
l’interferenza delle IgG4 con il meccanismo di presentazione dell’antigene alle IgE.<br />
Normalmente, in presenza di cellule presentanti l’antigene (APCs) dotate di recettori per le<br />
IgE, la dose di allergene richiesta per l’attivazione delle cellule T da parte delle IgE<br />
mediante APC è molto bassa. Tuttavia, quando i livelli di IgG4 sono elevati questo<br />
meccanismo viene impedito, molto probabilmente a causa della competizione con le IgE<br />
(Aalberse et al., 2009).<br />
4.4.2 Differenze inter-etnica dei livelli di IgG1 e IgG4<br />
Le differenze inter-etniche dei livelli di IgG1 e IgG4 sono state analizzate stratificando il<br />
campione per il gruppo etnico in ciascuna inchiesta. Come si può osservare in Fig. 4.24, la<br />
produzione di IgG1 anti-gSG6 è molto simile nei due gruppi etnici per le due stagioni di<br />
alta esposizione/trasmissione (Agosto 1994 e Ottobre 1994) mentre è significativamente<br />
diversa per la stagione di bassa esposizione/trasmissione, in cui i Fulani mostrano livelli di<br />
IgG1 anti-gSG6 superiori rispetto a quelli dei Mossi (Marzo 1995, p=0,018; Mann-<br />
Whitney test). Invece, le IgG4 mostrano valori di mediana più elevati nei Fulani in tutte e<br />
tre le inchieste con differenze statisticamente significative rispetto ai Mossi per Agosto<br />
1994 (p=0,02; Mann-Whitney test) e Marzo (p
Figura 4.24 Confronto inter-etnico dei livelli di IgG1 e IgG4<br />
anti -SG6 in ciascuna stagione (i valori di p sono stati calcolati<br />
mediante il test di Mann- Whitney).<br />
4.4.3 Variazione dei titoli di IgG1 e IgG4 con l’età<br />
La risposta IgG1 e IgG4 anti-gSG6 è stata analizzata in relazione all’età degli individui<br />
testati. Il campione esaminato è stato diviso in cinque gruppi di età, così ripartiti: 1-5 anni,<br />
5-10 anni, 10-20 anni, 20-40 anni e >40 anni. Dall’analisi è risultato che la risposta IgG1 e<br />
IgG4 decresce con l’età in tutte le inchieste e per entrambe le etnie (Fig. 4.25). In<br />
particolare, la diminuzione in funzione dell’età dei livelli di IgG1 e di IgG4 risulta<br />
statisticamente significativa ad Agosto 1994 sia per i Mossi che per i Fulani (Mossi: IgG1<br />
(p=0,038), IgG4 (p=0,002); Fulani: IgG1 (p=0,011), IgG4 (p=0,02); Kruskal-Wallis test).<br />
74
Figura 4.25 Stratificazione dei livelli di IgG1 e IgG4 in funzione<br />
dell’età, della stagione e del gruppo etnico (M=Mossi;<br />
F=Fulani; box: 25%-75%; wiskers: 5%-95%; linea: mediana;<br />
punti:outlier; i valori di p sono stati calcolati mediante il test di<br />
Kruskal-Wallis).<br />
Il trend è simile nelle altre inchieste anche se non raggiunge la significatività statistica,<br />
probabilmente anche a causa della numerosità del campione. Da quest’analisi emerge<br />
75
anche una diversa distribuzione e cinetica di produzione delle due sottoclassi nei diversi<br />
gruppi di età, in particolare nei primi anni di vita. Per osservare questo fenomeno in modo<br />
più dettagliato si è proceduto a scomporre ulteriormente i gruppi di età in classi così<br />
rappresentate: 1-3 anni, 3-5 anni, 5-7 anni, 7-11 anni, 11-16 anni, 16-21 anni, 21-30 anni e<br />
>30 anni. Questa suddivisione non consente di avere un corretto supporto statistico per via<br />
della bassa numerosità di alcuni gruppi di età, ma risulta ugualmente utile in quanto<br />
permette di osservare l’andamento nei primi anni di vita degli individui. Nella Fig. 4.26, è<br />
stata mostrata la percentuale di contributo di ciascuna sottoclasse alla risposta totale<br />
osservata. È stato riportato solo l’andamento osservato per i due gruppi etnici nell’inchiesta<br />
di Agosto 1994 in quanto rappresentativa di un andamento comune. Da questo tipo di<br />
rappresentazione emerge che la percentuale di contributo della risposta IgG1 raggiunge,<br />
per entrambi i gruppi etnici, il livello più alto solo nei primissimi anni di vita (1-3 anni)<br />
successivamente il contributo maggiore è dato dalla risposta IgG4 con percentuali che<br />
oscillano tra il 75- 50% per i Mossi e il 75- 60% per i Fulani.<br />
100%<br />
90%<br />
80%<br />
70%<br />
60%<br />
50%<br />
40%<br />
30%<br />
20%<br />
10%<br />
0%<br />
Mossi<br />
1-3 3-5 5-7 7-11 11-16 16-21 21-30 >30<br />
IgG4<br />
IgG1<br />
100%<br />
90%<br />
80%<br />
70%<br />
60%<br />
50%<br />
40%<br />
30%<br />
20%<br />
10%<br />
0%<br />
Fulani<br />
1-3 3-5 5-7 7-11 11-16 16-21 21-30 >30<br />
Figura 4.26 Contributo percentuale di ciascuna sottoclasse<br />
IgG alla risposta totale osservata ad Agosto 1994.<br />
Invece, nella Fig. 4.27 è stato riportato il confronto inter-etnico della risposta IgG1 e IgG4<br />
in funzione delle classi di età adoperate nell’analisi precedente. Dalla figura appare<br />
evidente come nei due gruppi etnici lo sviluppo della risposta IgG1 e IgG4 avvenga in<br />
tempi diversi. Infatti le IgG1 raggiungono nei Fulani il picco più alto nella fascia di età 1-3<br />
anni mentre nei Mossi avviene successivamente, intorno ai 3-5 anni di età. In entrambe le<br />
etnie, poi, il livello diminuisce e rimane a livelli più bassi dall’età di 11 anni in poi. Le<br />
IgG4, invece, nei Mossi sono presenti a livelli molto bassi nei primi anni di vita e<br />
incominciano a crescere dopo i 3 anni per raggiungere il picco massimo nella fascia di età<br />
5-7 anni. Nei Fulani la cinetica è leggermente diversa con i livelli di IgG4 già elevati a 1-3<br />
IgG4<br />
IgG1<br />
76
anni con un picco intorno ai 5 anni. Successivamente questa sottoclasse diventa<br />
predominante negli anni successivi per entrambe le etnie. Ciò fa supporre che lo switch<br />
isotipico da IgG1 a IgG4, e quindi il fenomeno della tolleranza, avvenga precocemente nel<br />
gruppo etnico dei Fulani (prima dei 5 anni di età) mentre nei Mossi si presenterebbe più<br />
tardi (dopo i 5 anni di età).<br />
OD<br />
OD<br />
1.4<br />
1.2<br />
1<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
0<br />
1.4<br />
1.2<br />
1<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
0<br />
Agosto '94: IgG1<br />
1-3 3-5 5-7 7-11 11-16 16-21 21-30 >30<br />
Agosto '94 IgG4<br />
1-3 3-5 5-7 7-11 11-16 16-21 21-30 >30<br />
Mossi<br />
Fulani<br />
Mossi<br />
Fulani<br />
Figura 4.27 Confronto inter-etnico della riposta IgG1 e IgG4<br />
anti gSG6 stratificata per gruppi di età (Agosto 1994)(i punti<br />
rappresentano la media aritmetica).<br />
La differente cinetica di risposta delle IgG1 e delle IgG4 in funzione dell’età, sebbene non<br />
sia ancora stata verificata in lavori su culicidi, è in accordo con quanto visto nelle risposte<br />
anticorpali ad alcuni alimenti. In particolare, il rapporto IgG4/IgG1è minore nei bambini di<br />
1-3 anni e aumenta nell’adolescenza. Questo slittamento della risposta a favore delle IgG4<br />
è stato correlato con una stimolazione cronica dell’antigene, in cui questa sottoclasse si<br />
sostituisce alle IgG1 nella risposta anticorpale (Calkhoven et al.,1991). Inoltre, i bassi<br />
livelli di espressione di IgG4 nei primissimi anni di vita potrebbero dipendere dalla<br />
mancanza di cellule accessorie mature (come macrofagi e cellule dendritiche) che<br />
77
successivamente stimoleranno la produzione di IgG4 mediante il rilascio di IL-10<br />
(Punnonen et al., 1993).<br />
4.5 Analisi comparativa della risposta IgG alla proteina salivare gSG6 di Anopheles<br />
funestus e di Anopheles gambiae<br />
Come descritto nel paragrafo 1.7.3, la proteina gSG6 di An. gambiae presenta una identità<br />
di sequenza con An. arabiensis e An. funestus rispettivamente del 99% e del 81%. Quindi,<br />
mentre per An. arabiensis la cross-reattività può essere data per scontata, per verificare la<br />
possibilità di una sovrapposizione nella risposta ai due antigeni di An. gambiae e An.<br />
funestus abbiamo effettuato un’analisi comparativa con le due proteine. La cross reattività<br />
tra queste proteine fornirebbe l’opportunità di utilizzare un solo marcatore sierologico per<br />
valutare contemporaneamente l’esposizione a punture dei tre principali vettori di malaria<br />
africani. Inoltre, dal momento che le densità di An. funestus abbondano tra la fine della<br />
stagione delle piogge e l’inizio della stagione secca, sostituendo quindi An. gambiae nelle<br />
densità relative (Ilboudo-Sanogo et al., 2010), l’uso di un marcatore comune potrebbe<br />
rivelarsi utile al fine valutare il rischio durante tutto il periodo di alta trasmissione.<br />
4.5.1 Espressione e purificazione di gSG6 di Anopheles funestus<br />
La proteina salivare gSG6 di Anopheles funestus è stata espressa in forma ricombinante e<br />
purificata dal Dott. R. Ronca (Università Federico II, Napoli) in maniera del tutto simile a<br />
quanto fatto in precedenza per la proteina omologa di An. gambiae. In Fig. 4.28 è mostrata<br />
la banda di circa 13kDa corrispondente alla proteina di interesse dopo induzione con IPTG.<br />
78
10 kDa<br />
UN MW IN<br />
Figura 4.28 Analisi dell’espressione di gSG6 An. funestus in<br />
E.coli (Un=campione non indotto; Ind= campione indotto;<br />
MW= marcatore di peso molecolare)<br />
Anche in questo caso è stato necessario solubilizzare la proteina dai corpi di inclusione per<br />
poi procedere a cromatografia d’affinità in condizioni denaturanti (Fig. 4.29).<br />
MW AC<br />
Figura 4.29 Analisi della frazione di gSG6 An. funestus<br />
ottenuta dopo cromatografia d'affinità (AC= frazione di<br />
eluato; MW= marcatore di peso molecolare).<br />
Infine, le frazioni purificate sono state rinaturate e ulteriormente purificate mediante<br />
cromatografia a scambio anionico (Fig. 4.30).<br />
79
MW IEC<br />
Figura 4.30 Analisi della frazione di gSG6 ottenuta dopo<br />
cromatografia a scambio anionico (IEC= frazione di eluato;<br />
MW marcatore di peso molecolare).<br />
4.5.2 Immunogenicità di gSG6 di An.funestus<br />
L’analisi della risposta anticorpale IgG specifica alla proteina gSG6 di Anopheles funestus<br />
è stata effettuata su un sottocampione del Burkina Faso di 335 individui appartenente<br />
all’etnia dei Mossi. I sieri analizzati fanno parte del periodo di trasmissione che<br />
comprende: agosto 1994, ottobre 1994 e marzo 1995. La risposta anticorpale è stata<br />
confrontata con quella ottenuta sugli stessi individui usando come antigene: gSG6 di An.<br />
gambiae ed una combinazione di gSG6 di An. gambiae e di An. funestus insieme in uguale<br />
concentrazione. Nella successiva trattazione dell’analisi, per facilitare la lettura, mi riferirò<br />
a questi antigeni come gSG6 ga (in riferimento a gSG6 di An. gambiae), gSG6 fu (in<br />
riferimento a gSG6 di An. funestus) e gSG6 ga&fu (in riferimento a gSG6 di An. gambiae e<br />
di An. funestus).<br />
L’immunogenicità di gSG6 fu è stata innanzitutto confermata confrontando la risposta<br />
anticorpale in individui esposti e in un sottogruppo di 48 individui di controllo. L’analisi<br />
conferma che gSG6 fu è immunogenica e non si ha cross-reazione con altre proteine in<br />
individui non esposti. La differenza risulta statisticamente significativa per tutte le<br />
inchieste (p
OD<br />
OD<br />
OD<br />
1.4<br />
1.3<br />
1.2<br />
1.1<br />
1.0<br />
0.9<br />
0.8<br />
0.7<br />
0.6<br />
0.5<br />
0.4<br />
0.3<br />
0.2<br />
0.1<br />
0.0<br />
1.4<br />
1.3<br />
1.2<br />
1.1<br />
1.0<br />
0.9<br />
0.8<br />
0.7<br />
0.6<br />
0.5<br />
0.4<br />
0.3<br />
0.2<br />
0.1<br />
0.0<br />
1.4<br />
1.3<br />
1.2<br />
1.1<br />
1.0<br />
0.9<br />
0.8<br />
0.7<br />
0.6<br />
0.5<br />
0.4<br />
0.3<br />
0.2<br />
0.1<br />
0.0<br />
Agosto 1994<br />
esposti controlli<br />
Ottobre 1994<br />
esposti controlli<br />
Marzo 1995<br />
esposti controlli<br />
Median<br />
25%-75%<br />
5%-95%<br />
Median<br />
25%-75%<br />
5%-95%<br />
Median<br />
25%-75%<br />
5%-95%<br />
Figura 4.31 Analisi delle risposta anticorpale a gSG6 di An.<br />
funestus in individui esposti e controlli nelle tre inchieste<br />
(Agosto 1994: esposti (57), controlli (47); Ottobre 1994:<br />
esposti (56), controlli (47); esposti (34), controlli (47)).<br />
81
4.5.3 Variabilità stagionale della risposta a gSG6 di An.funestus<br />
Come atteso sulla base delle analisi precedenti anche la risposta anticorpale a gSG6 fu<br />
mostra un andamento stagionale che è in accordo con il periodo di trasmissione<br />
(p=0,0015). In particolare, come mostrato in Fig. 4.32, i livelli anticorpali fra i responders<br />
aumentano significativamente durante la stagione delle piogge/alta trasmissione, da Agosto<br />
1994 a Ottobre 1994 (p
Figura 4.33 Confronto stagionale della risposta anticorpale ai<br />
tre marcatori salivari (box: 25%-75%; wiskers: 5%-95%; linea:<br />
mediana)<br />
Figura 4.34 Confronto stagionale delle prevalenze ai tre<br />
marcatori salivari (wiskers: intervallo di confidenza al 95%).<br />
Nonostante nella zona di studio An. funestus non rappresenti mai più del 20%, quest’analisi<br />
dimostra abbastanza chiaramente la cross reattività tra i due marcatori. La possibilità di<br />
sfruttare la risposta IgG anti-gSG6 di An. gambiae come marcatore di esposizione a tutti e<br />
tre i principali vettori di malaria in Africa è particolarmente vantaggiosa consentendo<br />
valutazioni attendibili su un vasto territorio come quello africano.<br />
83
4.6 Analisi della risposta anticorpale alla proteina salivare: anofelina<br />
Come riportato nell’introduzione l’anofelina è un polipeptide ad azione antitrombinica<br />
caratteristico di zanzare del genere Anoheles. La proteina è stata espressa in forma<br />
ricombinate nel laboratorio del Dott. B. Arcà presso l’Università federico II di Napoli dove<br />
è attualmente in corso di caratterizzazione funzionale. La descrizione della procedura di<br />
espressione e purificazione esula gli scopi di questa tesi e sarà oggetto di uno specifico<br />
manoscritto (R. Ronca, in preparazione). Ai fini del lavoro riportato in questa tesi mi<br />
limiterò a citare che la proteina è stata espressa in forma ricombinante in E. coli e<br />
purificata all’omogeneità come anche confermato da analisi di spettrometria di massa. Mi<br />
limiterò quindi, qui di seguito, a riportare alcuni dati preliminari che indicano<br />
nell’anofelina di An. gambiae un ulteriore potenziale marcatore di esposizione a punture di<br />
Anopheles.<br />
4.6.2 Immunogenicità dell’anofelina<br />
L’analisi della risposta IgG specifica all’anofelina di An. gambiae è stata effettuata su un<br />
sottocampione di circa 30 individui del Burkina Faso campionati nell’inchiesta di Agosto<br />
1995, appartenenti ad entrambe le etnie Fulani e Mossi, e su un sottocampione di controllo<br />
costituito da 30 individui di origine europea. Questa risposta anticorpale è stata inoltre<br />
confrontata nello stesso esperimento e sugli stessi individui con la risposta anticorpale anti-<br />
gSG6 di An. gambiae. Analizzando i livelli anticorpali anti-anofelina negli individui<br />
esposti a punture anofeliche e in quelli di controllo si osserva una risposta<br />
significativamente maggiore (p
OD<br />
1.6<br />
1.4<br />
1.2<br />
1.0<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
0.0<br />
Esposti (20) Controlli (25)<br />
Mean<br />
Mean±SE<br />
Mean±0.95 Conf. Interval<br />
Figura 4.35 Risposta anticorpale all’anofelina in individui<br />
esposti e di controllo (in parentesi è indicata la numerosità del<br />
campione).<br />
4.6.3 Confronto della risposta anticorpale all’anofelina e a gSG6 di An. gambiae<br />
La risposta IgG anti-anofelina è stata confrontata con la risposta IgG anti-gSG6 degli<br />
individui considerati responders per entrambe le proteine. Dall’analisi è emerso che la<br />
risposta anticorpale all’anofelina è significativamente maggiore rispetto a quella osservata<br />
per gSG6 (p=0,02) (Fig. 4.36).<br />
OD<br />
2.6<br />
2.4<br />
2.2<br />
2.0<br />
1.8<br />
1.6<br />
1.4<br />
1.2<br />
1.0<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
Anophelina (17) gSG6 (17)<br />
Median<br />
25%-75%<br />
5%-95%<br />
Figura 4.36 Confronto della risposta anticorpale all’anofelina<br />
e a gSG6 (in parentesi il numero di responders ad entrambe le<br />
proteine)<br />
85
Dal momento che il campione così analizzato comprende al suo interno individui di<br />
entrambe le etnie, si è proceduto a confrontare la risposta anticorpale alle due proteine<br />
salivari stratificando il campione per gruppo etnico al fine di mettere in evidenza potenziali<br />
differenze nella risposta inter-etnica. Come mostrato in Fig. 4.37, sia nei Mossi che nei<br />
Fulani i livelli anticorpali anti-anofelina sono più elevati rispetto a quelli per gSG6. Questa<br />
differenza non è supportata da una significatività statistica, a causa della scarsa numerosità<br />
del campione, quindi si può concludere che l’anofelina possiede una immunogenicità circa<br />
paragonabile a quella di gSG6.<br />
OD<br />
OD ME<strong>DI</strong>A an<br />
2.6<br />
2.4<br />
2.2<br />
2.0<br />
1.8<br />
1.6<br />
1.4<br />
1.2<br />
1.0<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
2.6<br />
2.4<br />
2.2<br />
2.0<br />
1.8<br />
1.6<br />
1.4<br />
1.2<br />
1.0<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
Mossi<br />
Anophelina (6) gSG6 (6)<br />
Fulani<br />
Anophelina (11) gSG6 (11)<br />
Median<br />
25%-75%<br />
5%-95%<br />
Median<br />
25%-75%<br />
5%-95%<br />
Figura 4.37 Confronto della risposta anticorpale all’anofelina<br />
e a gSG6 nei due gruppi etnici, Mossi e Fulani (in parentesi il<br />
numero di responders ad entrambe le proteine).<br />
86
Inoltre, dalla Fig. 4.37 si deduce anche una variabilità inter-etnica nella risposta<br />
all’anofelina. Stratificando il campione per gruppo etnico e confrontato la risposta<br />
anticorpale specifica nei due gruppi si osserva come anche per quanto riguarda l’anofelina,<br />
al pari di gSG6, i Fulani mostrano una risposta anticorpale più elevata rispetto ai Mossi<br />
(Fig. 4.38).<br />
OD<br />
1.8<br />
1.6<br />
1.4<br />
1.2<br />
1.0<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
Anofelina<br />
Fulani (12) Mossi (8)<br />
Mean<br />
Mean±SE<br />
Mean±0.95 Conf. Interval<br />
Figura 4.38 Confronto inter-etnico della risposta anticorpale<br />
all’anofelina (in parentesi il numero di responders ad<br />
entrambe le proteine).<br />
4.6.4 Differenze di sensibilità tra anofelina e gSG6<br />
Confrontando per ciascun individuo testato il valore della risposta anticorpale a ciascuna<br />
proteina si rileva una eterogeneità che è comune ad entrambi gli antigeni (Fig. 4.39). Infatti<br />
ci sono individui la cui risposta IgG anti- gSG6 risulta maggiore rispetto a quella anti-<br />
anofelina e viceversa oppure risposte molto simili tra di loro.<br />
87
OD<br />
3<br />
2.5<br />
2<br />
1.5<br />
1<br />
0.5<br />
0<br />
Variabilità individuale<br />
Individui<br />
gSG6<br />
Anofelina<br />
Figura 4.39 Variabilità individuale della risposta anticorpale<br />
all’anofelina e a gSG6.<br />
Se consideriamo la soglia di positività per entrambe le proteine (gSG6=0,39 OD;<br />
anofelina=0,48 OD), la prevalenza dei responders è pari al 96% (24 individui su 25; limiti<br />
fiduciali al 95%= 80,5%-99,3%) per gSG6 e al 72% (18 individui su 25; limiti fiduciali al<br />
95%= 52,4%-85,7%) per l’anofelina (Fig. 4.40).<br />
100%<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
Prevalenze di individui responders<br />
gSG6 Anofelina<br />
Figura 4.40 Prevalenze dei responders all’anofelina e a gSG6<br />
(gSG6 n=24; anofelina=18; individui tot:25)<br />
Quindi, l’analisi preliminare della risposta anticorpale specifica all’anofelina fornisce<br />
evidenti indicazioni sull’immunogenicità di questa proteina, che sembra rappresentare<br />
un’addizionale utile marcatore epidemiologico di esposizione a punture anofeliche.<br />
Ulteriori studi, estesi ad un campione più rappresentativo, sono certamenti necessari per<br />
confermare le differenze qui osservate. Ad ogni modo, è verosimile che l’utilizzo<br />
88
combinato di gSG6 e anofelina, possa consentire di ottenere una maggiore sensibilità nella<br />
diagnosi sierologica che potrebbe essere particolarmente utile per analisi epidemiologiche<br />
in zone a bassa esposizione/trasmissione.<br />
89
5 Conclusioni<br />
I risultati riportati in questa tesi dimostrano per la prima volta, in uno studio su<br />
larga scala, che singole proteine salivari di Anopheles possono essere impiegate per<br />
misurare la risposta anticorpale specifica contro antigeni salivari nell’ospite umano. In<br />
particolare, la proteina gSG6 si è dimostrata essere un sensibile marcatore di esposizione a<br />
punture di specie vettrici di malaria in Africa (An. gambiae s.l. ed An. funestus), aprendo<br />
nuovi scenari per lo sviluppo di protocolli di valutazione del rischio di esposizione e di<br />
verifica degli interventi di controllo. Infatti, la determinazione del rischio di trasmissione e<br />
di esposizione ai vettori malarici, attualmente effettuata mediante metodi entomologici e di<br />
diagnosi parassitologica, rappresenta un aspetto fondamentale nell’organizzazione e nella<br />
valutazione dell’efficienza di un programma di controllo. Tuttavia, questi metodi risultano<br />
scarsamente sensibili in situazioni di basse densità anofeliche e richiedono competenze e<br />
risorse non sempre disponibili. I risultati qui riportati indicano la possibilità di impiegare la<br />
risposta anticorpale anti-gSG6 come metodo affidabile ed in grado di complementare<br />
efficacemente le misure entomologiche classiche. Una metodologia di questo tipo, inoltre,<br />
ha il vantaggio di permettere una valutazione del reale contatto uomo-anofele, cioè<br />
dell’esposizione “effettiva” a punture anofeliche.<br />
Innanzitutto la risposta umorale umana alla proteina salivare gSG6 è risultata<br />
direttamente correlata alla STAGIONALITÀ. Infatti, abbiamo visto che il titolo anticorpale<br />
aumenta durante la stagione delle piogge, quando le densità anofeliche e l’intensità della<br />
trasmissione malarica sono ai massimi livelli. Invece, durante la stagione secca, con basse<br />
densità anofeliche e bassa trasmissione, si assiste a una caduta significativa del titolo<br />
anticorpale evidenziando una <strong>DI</strong>NAMICA A BREVE TERMINE della risposta. Queste sono<br />
caratteristiche di base e di fondamentale importanza che un buon marcatore sierologico<br />
deve possedere. Inoltre, il titolo anticorpale ha mostrato una <strong>DI</strong>PENDENZA DALL’ETÀ con<br />
un andamento che è risultato opposto rispetto a quello noto per gli antigeni malarici. In<br />
particolare, la risposta ha inizio precocemente, raggiunge il picco intorno ai 2 anni di età e<br />
permane a livelli elevati fino a circa 10 anni, per poi diminuire progressivamente. È<br />
verosimile che tale andamento sia dovuto all’instaurarsi nell’ospite di fenomeni di<br />
tolleranza immunologica causati dalle lunghe e ripetute esposizioni agli antigeni salivari.<br />
Sebbene i sottostanti meccanismi non siano ancora ben chiariti, numerosi dati riportati in<br />
letteratura sostengono questa ipotesi, che trova ulteriore conferma nei risultati forniti<br />
dall’analisi delle sottoclassi IgG1 ed IgG4. Infatti gli elevati livelli di IgG4 anti-gSG6<br />
nonché lo switch IgG1/IgG4 che avviene precocemente (intorno ai 5 anni di età) sono<br />
90
completamente in accordo con l’ipotizzata tolleranza. I nostri dati, inoltre, sottolineano<br />
come il BACKGROUND GENETICO, laddove possibile, vada tenuto nella debita<br />
considerazione. Infatti, stratificando il campione secondo i due differenti gruppi etnici<br />
presenti nel nostro campione, Fulani e Mossi, si osserva una risposta IgG anti-gSG6<br />
costantemente più alta nei primi rispetto ai secondi. Questo dato è in linea con quanto in<br />
precedenza riportato in letteratura riguardo ai Fulani, che mostrano una più elevata risposta<br />
anticorpale ad antigeni malarici ed una minore suscettibilità alla malaria. Quindi la nostra<br />
analisi, nel suo complesso, fornisce una serie di informazioni essenziali per la messa a<br />
punto di protocolli da applicare a popolazioni eterogenee e con forti stagionalità nei livelli<br />
di trasmissione della malattia.<br />
Abbiamo sottolineato che la proteina gSG6 è Anopheles-specifica ed è assente in<br />
altri culicidi e altri artropodi ematofagi, ed abbiamo effettuato il nostro studio su larga<br />
scala impiegando la proteina gSG6 di An. gambiae. Dal momento che An. gambiae s.s. è<br />
certamente il principale, ma non l’unico, vettore africano di malaria è ovvio chiedersi quale<br />
sia il grado di cross-reattività con omologhi da altri importanti vettori. A questo proposito<br />
possiamo individuare in An. gambiae s.s., An. arabiensis ed An. funestus i tre principali<br />
vettori africani, responsabili di oltre il 90% della trasmisione nell’area sub-Sahariana. Per<br />
quanto riguarda An. arabiensis, un membro del complesso di An. gambiae, la cross-<br />
reattività può essere data per scontata dal momento che i due omologhi mostrano il 99% di<br />
identità. Le proteine gSG6 di An. gambiae e di An. funestus presentano invece un’identità<br />
di sequenza del 81%, lasciando aperto l’interrogativo sul grado di cross-reattività. L’analisi<br />
comparativa con le proteine di An. gambiae e di An. funestus indica chiaramente una larga<br />
sovrapposizione nella risposta ai due antigeni, suggerendo che la proteina gSG6 può essere<br />
utilizzata come MARCATORE <strong>DI</strong> ESPOSIZIONE AI TRE I PRINCIPALI VETTORI <strong>DI</strong> MALARIA<br />
AFRICANI. Il dato di cross-reattività tra le proteine gSG6 di An. gambiae e di An. funestus<br />
rende verosimile ipotizzare uno scenario simile anche con An. stephensi (importante<br />
vettore asiatico di malaria), con cui gSG6 di An. gambiae condivide l’81% dei residui<br />
aminoacidici. Se quest’ipotesi fosse confermata, si potrebbero ottenere con un unico<br />
marcatore informazioni atte alla valutazione del rischio di trasmissione su più contesti<br />
epidemiologici e geografici.<br />
È importante evidenziare che i risultati ottenuti si riferiscono ad una sola area<br />
geografica e ad una situazione epidemiologica caratterizzata da elevati livelli di<br />
trasmissione malarica e che, quindi, i dati qui riportati andranno estesi al livello<br />
macrogeografico e validati in condizioni di bassi livelli di trasmissione. In ogni caso,<br />
91
questo lavoro di tesi rappresenta un’importante prova di principio circa l’applicabilità di un<br />
metodo di valutazione dell’esposizione a punture di zanzare mediante l’impiego di antigeni<br />
salivari ricombinanti. Questo scenario è certamente di grande interesse ed implica<br />
ripercussioni che vanno oltre l’epidemiologia della malaria e che potrebbero trovare<br />
interessanti applicazioni ad altre malattie a trasmissione vettoriale.<br />
92
6 Bibliografia<br />
Aalberse, R. C., S. O. Stapel, et al. (2009). "Immunoglobulin G4: an odd antibody." Clin<br />
Exp Allergy 39(4): 469-77.<br />
Aalberse, R. C., R. van der Gaag, et al. (1983). "Serologic aspects of IgG4 antibodies. I.<br />
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