FASI SPERIMENTALI PRINCIPALI 1: I ... - Biocomputing.it

FASI SPERIMENTALI PRINCIPALI
1: I dentificazione, isolamento e clonaggio gene
codificante per proteina bersaglio (⇔ BIOINFORMATICA)
2: espressione in sistema eterologo
3: purificazione e caratterizzazione proteina wild type
(stabilità termodinamica e cinetica) (⇔ FOLDING)
4: progettazione, produzione e caratterizzazione versioni
mutate (⇔ BIOINFORMATICA)

ISOLAMENTO DEL GENE
ANALISI DI REPERTORI MOLECOLARI (gene o cDNA)
Isolamento per omologia (clone di topo per ottenere cDNA umano)
Genetica inversa (dalla proteina al gene)
Isolamento in base alla posizione genomica (informazioni genetiche)
Anticorpo (libreria di espressione)
CLONAGGIO DIRETTO
PCR (geni procariotici o cDNA)
SINTESI EX-NOVO
Oligonucleotidi sintetici (geni di piccole dimensioni)

Le caratteristiche di una libreria di cloni ideale
Completa – Almeno un clone per mRNA
Ben classificabile – Possibilità di formare sottogruppi
Flessibile – Cloni trasferibili in altri vettori velocemente
Esprimibile – I cloni devono essere completi e pronti per l’inserzione di
sequenze aggiuntive utili
Ad alta qualità – Tutti I cloni sequenziati
Economicamente accessibile –
Disponibilità commerciale e informazioni
www.invitrogen.com
mgc.nci.nih.gov
http://www.geneservice.co.uk/products/image/index.jsp

La completezza delle librerie è condizionata dalle
dimensioni degli inserti
N = [ln (1-P)]/[ln (1-f)]
P – probabilità di completezza
N – numero di cloni richiesti
f – proporzione di genoma nel singolo clone
Genoma umano - plasmidi (max 5
Kb)
P – 99%
f – 5 kb/4,400,000 kb = 1.14 x 10 -6
N = [ln .01]/[ln 0.99999886]
= -4.6/-1.14 x 10 -7
= 40,350,877 cloni
Batteriofagi (40kB)= 578, 616 cloni
YACs(500kB) = 40,350 cloni

ISOLAMENTO PER OMOLOGIA
Libreria di
geni umani
Cloni su filtro
Positivi sono
omologhi al gene di topo
Sonda costruita su gene
di topo

MOLTI METODI DI CLONAGGIO (e altro) SONO BASATI SULL’USO DELLA PCR
ATG TAA
….e i primers? Si scrivono sempre 5’->3’
Primer sense (forward) = filamento codificante -> 5’-ATG………-3’
Primer antisense (reverse) = reverse complement -> 5’-TTA……-3’

PCR Primers: ALCUNE REGOLE DA RICORDARE.....
1. Primer Length: Lunghezza ottimale 18-22 bp. Assicura specificità e facilità di legame.
2. Melting Temperature: è la temperatura a cui la metà di un duplex si denatura dando un
single strand. Tm= 52-58 o C danno risultati ottimali; primers con Tm più elevate (>65°C) tendono
a formare strutture secondarie.
Formula per calcolo T m (rigorosa e basata su la valutazione per coppie di basi delle interazioni):

FORMULE SEMPLIFICATE
1. Più corti di 18 basi
Tm= 4°C x (G +C) + 2°C x (A + T)
2. Più lunghi di 18 basi
Tm = 64.9°C + 41°C x [(G+C) – 16.4]/N
3. Tiene conto dell’effetto dei sali (Primer 3 program e altri)
T m = 81.5°C + 16.6°C x (log 10[Na+] + [K+]) + 0.41°C x (%GC) – 675/N
3. Calcolo del peso molecolare (accurato):
MW = (329.2 * G) + (313.2 * A) + (304.2 * T) + (289.2 * C)
Correzioni:
-78 per il 5' phosphate group (PO 3) sostituito da un idrogeno (primers defosforilati)
+17 per il 3’ OH .

4.Primer annealing temperature : Stima della stabilità dell’ibrido DNA-DNA.
T a troppo elevata: primer-template hybridization insufficiente: resa bassa prodotto PCR.
T a troppo bassa: prodotti aspecifici per la presenza di mismatches
T a = 0.3 x T m(primer) + 0.7 T m (prodotto) – 14.9
Dove T m(primer) = Melting Temperature dei primers
T m(product) = Melting temperature del prodotto di PCR
5. GC Content : (numero di G e C nel primer come % basi totali) dovrebbe essere 40-60%.
6. GC Clamp : La presenza di basi G o C nelle ultime 5 basi al 3’ dei primer ha un effetto positivo
(meglio non più di tre).
7. Strutture secondarie : La presenza di strutture secondarie abbassa la resa in prodotto
influenzando il processo di annealing primer-templato. Riduce la concentrazione effettiva dei
primers.
Hairpin : Intramolecolare nel primer. Sono tollerati: 3' -hairpin con DeltaG di -2 kcal/mol e
hairpin interni con DeltaG di -3 kcal/mol
Self Dimer : Intermolecolari tra primer omologhi. Sono tollerati: 3' - self dimer con DeltaG di -5
kcal/mol e self dimer interni con DeltaG di -6 kcal/mol.
Cross Dimer : Intermolecolari tra primer senso e antisenso. Sono tollerati: 3' - cross dimer con
DeltaG di -5 kcal/mol e cross dimer interni con DeltaG di -6 kcal/mol.

8. Repeats : ripetizioni consecutive di due nucleotidi: possono dare errori di innesco.
Sono tollerati massimo 4 dinucleotidi
9. Runs : sequenze formate dallo stesso nucleotide: possono dare errori di innesco.
Esempio: AGCGGGGGATGGGG.
Sono tollerati runs di massimo 4 nucleotidi.
10. 3' End Stability : è il valore massimo del deltaG delle 5 basi al 3’. Non dovrebbe essere
molto negativo.
11. Evitare le zone in cui nel templato sono presenti strutture secondarie.
12. Evitare le regioni di cross-omologia tra geni presenti nella miscela di reazione.
ACUNI SITI ONLINE PER IL DISEGNO DI PRIMERS
PRIMER3
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

Cloning
Sequencing
Primer_List
Primer_Check

Differential Primers
PCR primer design per:
•Gene-specific primers (per multi-gene families)
-identificare specie o ceppi specifici
-diagnostica molecolare
•Consensus primers
amplificare geni appartenenti a una famiglia di
geni
BISOGNA LAVORARE SU ALLINEAMENTI MULTIPLI E TROVARE
ZONE CONSERVATE O MENO (CONSENSUS O SPECIFICHE)
Primer 3 at the MIT Whitehead Institute
http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi
GeneFisher by Folker Meyer & Chris Schleiermacher
at Bielefeld University, Germany
http://bibiserv.TechFak.Uni-Bielefeld.DE/genefisher2/

GENETICA INVERSA
1. La sequenza della proteina è nota e si può dedurre una sequenza genica
(o proteine omologhe)
NH 3 + -Met-Asp-Gly--------------Trp-Ser-Lys-COO -
5’-ATG-GAT-GCT TGG-AGT-AAA-3’
C C C G
A TCT
G C
A
G
2. Si possono progettare primers degenerati
Forward primer: 5’-ATGGAT/CGCN-3’ (sense)
Reverse primer: 5’-T/CTTNC/GT/ACCA-3’ (antisense)
Note: T/C = miscela di T e C;
N = miscela di 4 nucleotidi (anche dInosina)
NB La degenerazione diminuisce la concentrazione effettiva del singolo primer
(nell’esempio: sense= 1/4x1/2=1/8 ; antisense= 1/4x(1/2) 3 =1/32)
Evitare degenerazioni maggiori di 1/512…..

3. Si amplifica il frammento di gene mediante PCR
4. Si analizza una libreria di cloni
Libreria
Cloni su filtro
Positivi sono il gene umano di interesse
Sonda = frammento di PCR

ISOLAMENTO DIRETTO DA MATERIALE GENETICO
Fonti di materiale genetico di vario tipo
Microrganismi, Virus vegetali, Linee cellulari animali ed umane
SITO : www.dsmz.de
PCR su stampi a sequenza nota (genomi caratterizzati)
SINTESI EX-NOVO
Oligonucleotidi sintetici (geni di piccole dimensioni)
www.genscript.com < 1.5 USD/bp (da 1800 USD espressione)
www.geneart.com < 1 euro/bp

Polimerasi ad alta fedeltà
Taq polimerasi (dal termofilo Thermus aquaticus)
= 94 kDa con 2 attività catalitiche
A) 5’⇒3’ DNA polymerase (50-60 nucleotidi/sec)
B) 5’ ⇒ 3’ esonucleasi (rimuove nucleotidi al 5’)
Versioni ricombinanti di Taq
Manca la attività 3’ ⇒ 5’ esonucleasi
Frequenza di errore: 1 per 104 nucleotidi per un frammento di 400 bp amplificato per 106 volte
(=20 cicli) : 33% mutati
Polimerasi ad alta fedeltà
(= con attività 3’ ⇒ 5’ esonucleasi)
Riconosce se il nucleotide al 3’ si appaia con il templato.
A volte taglia anche i nucleotidi non appaiati al 3’ del primer (‘nibbling’)
Aumento di fedeltà 5-12 volte
Vent®, DeepVent®, Tli (Thermoccocus litoralis),Pfu (Pyrococcus furiosus)
Blunt ends invece che overhangs
(Si può fare ultimo ciclo con Taq per TA cloning)

I METODI DI CLONAGGIO SONO DI GRANDE IMPORTANZA
SIA NELL’ISOLAMENTO E PRODUZIONE DELLA PROTEINA WILD TYPE
CHE NELLA PRODUZIONE DI MUTANTI
-NECESSITA’ DI LAVORARE CON UN NUMERO ELEVATO DI CLONI
IN TEMPI SPERIMENTALI RAGIONEVOLI
SONO STATE SVILUPPATE NUOVE TECNOLOGIE DI CLONAGGIO RAPIDO

CLONAGGI: Approccio tradizionale
(ligasi)
Approccio per ricombinazione
• Strategia comune per clonare in
vettori diversi
• Singola reazione di breve durata
• Alta resa (HTP)
• Efficienza quasi 100%
• No mutazioni
SISTEMI GATEWAY E TOPO (Invitrogen)

Il sistema Gateway
si basa sul processo di ricombinazione tra fago lambda ed E. coli
Integrase (Int)
Host Integration Factor (IHF)
Int+IHF+ Excisionase (Xis)

Il principio Gateway: le reazioni LR e BP
La LR clonasi comprende le attività
Int, IHF e Xis
(= excisione di lambda)
Il costrutto di espressione:
-ha selezione positiva (Ap r )
- non ha selezione negativa (ccdB)
ccdB gene= gene killer: interferisce con l’attività della DNA girasi causando
morte cellulare (plasmide F con ccdA=antidoto)

La procedura sperimentale è semplice

IL VETTORE DI INGRESSO PUO’ ESSERE COSTRUITO
CON STRATEGIE DIVERSE
1. Restrizione e clonaggio
in vettore Gateway attL
2. PCR con primers attB
(>20-25 basi extra) e
clonaggio in vettore Gateway attP
3. Libreria di clonaggio
4. Libreria di espressione

QUALSIASI VETTORE PUÒ DIVENTARE VETTORE DI DESTINAZIONE
Deve essere replicato in un ceppo con una mutazione nella
DNA girasi (gyrA462) (DB3.1)

I vettori di destinazione possono avere caratteristiche
diverse a seconda dello scopo dell’esperimento

……e i tempi?
3 giorni:
6 prodotti di fusione
e loro espressione

Il sistema TOPO si basa sulla attività della topoisomerasi I
1. Si lega covalentemente al gruppo fosfato di una sequenza specifica
2. Svolge il DNA
3. Riforma il legame covalente (attività = ligasi)

1 (TOPO) La topoisomerasi è covalentemente legata ad un gruppo fosfato presente
alle estremità del vettore di clonaggio
2 (TOPO) L’inserto ha una estremità 3’ che si allinea al vettore
3 (TOPO) L’enzima forma il legame covalente (attività = ligasi) e poi si stacca

Il metodo di clonaggio è molto veloce
Il sistema TOPO può essere trasformato in sistema di clonaggio
ad alta resa (High-Throughput,HT) se nella singola provetta sono presenti
molte reazioni (es. 500)

I sistemi
Gateway e TOPO
possono essere
combinati

I vantaggi di questi sistemi sono molteplici:
1. i tempi sperimentali si abbreviano

Si possono progettare esperimenti
HTP (High-throughput)

E.coli E.coli expression screenings (1)
Expression screening (normalized)
with auto-inducing medium in 24
well plate followed by anti-His Dot-
Blot and Ni affinity purification
with 96-well filter plate
Freedom Tecan robot
for 1-4 mL cultures
Fully automated expression screening: 8 hours for 160 cultures
reference scale
• 3 classes:
-soluble
-partially soluble
-not soluble
Total Soluble
Total expression (mg/L of culture) Soluble Fraction (mg/L of culture)
0.27 3.34 0.48 3.78 11.94 0.60 1.51 0.04 2.85 0.27
0.04 3.38 0.18 2.50 1.50 0.14 3.93 0.26 4.99 0.09
1.31 10.09 0.34 13.87 1.30 1.38 0.82 0.19 0.46 0.13
1.00 0.75 0.55 2.73 0.82 1.22 1.20 0.46 7.88 0.25
8.20 24.56 0.83 7.77 51.64 1.58 25.00 1.35 16.97 2.61
9.64 1.65 12.10 20.31 21.94 1.24 1.34 0.33 1.57 8.42
22.37 18.75 6.13 12.87 19.40 1.53 0.23 0.02 0.54 15.38
0.61 10.87 6.74 9.65 3.22 0.17 0.08 -0.02 0.77 1.23
No expression Soluble < 2mg/L No expression Soluble > 2mg/L Not Soluble
No expression Soluble > 2mg/L No expression Soluble > 2mg/L Not Soluble
Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L No expression Not Soluble Not Soluble
Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L Not Soluble Soluble > 2mg/L Not Soluble
Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L Soluble > 2mg/L
Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L
Soluble < 2mg/L Not Soluble Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L
Not Soluble Not Soluble Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L
Vincentelli R et al. (2005) Anal. Bioch.

Si possono ottenere molteplici
informazioni sulla stessa proteina
Localizzazione
Interazioni
Saggio funz #1
Saggio funz #2
Saggio funz #3
Purificazione
n
A
–
–
+
1
c
B
–
–
–
2
n
A
–
–
+
1
c
X
+
–
–
2
p
Y
–
–
–
7
c
Z
–
–
–
6
c
C
–
–
–
1
n
L
–
–
–
1