Vaccini di origine vegetale contro i tumori associati al virus del ...
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Workshop ENEA, 4 <strong>di</strong>cembre 2003<br />
‘Molecular farming: produzione <strong>di</strong> cibi funzion<strong>al</strong>i, <strong>di</strong> nutraceutici e<br />
biofarmaceutici’<br />
<strong>Vaccini</strong> <strong>di</strong> <strong>origine</strong><br />
<strong>veget<strong>al</strong>e</strong> <strong>contro</strong> i <strong>tumori</strong><br />
<strong>associati</strong> <strong>al</strong> <strong>virus</strong> <strong>del</strong><br />
papilloma umano (HPV)<br />
Rosella Franconi<br />
BIOTEC GEN
SOMMARIO<br />
• Definizioni<br />
2. Il problema: il <strong>virus</strong> <strong>del</strong> papilloma umano<br />
• Caratteristiche<br />
• <strong>Vaccini</strong> profilattico<br />
• Vaccino terapeutico<br />
3. Le piante per lo sviluppo <strong>di</strong> vaccini anti-HPV<br />
a) le piante come biofabbriche<br />
b) sequenze da <strong>virus</strong> veget<strong>al</strong>i per vaccini a<br />
DNA<br />
4. Conclusioni e sviluppi
Definizioni<br />
ANTIGENI tutte le molecole in grado<br />
<strong>di</strong> indurre una risposta immunitaria<br />
VACCINI A SUBUNITA’ Viene usata solo una<br />
parte <strong>del</strong> patogeno capace <strong>di</strong> indurre una<br />
risposta immunitaria.<br />
ADIUVANTE sostanza in grado <strong>di</strong> aumentare<br />
l’immunogenicità <strong>di</strong> un dato antigene<br />
Molti <strong>al</strong>lo stu<strong>di</strong>o ma solo pochi approvati per uso umano<br />
(es. <strong>al</strong>cuni s<strong>al</strong>i miner<strong>al</strong>i: idrossido <strong>di</strong> <strong>al</strong>luminio, fosfato<br />
<strong>di</strong> c<strong>al</strong>cio). Non sono noti i meccanismi <strong>di</strong> azione
Princip<strong>al</strong>i vantaggi:<br />
Svantaggi:<br />
<strong>Vaccini</strong> a subunità<br />
•Sicurezza (utilizzata solo una parte <strong>del</strong> patogeno)<br />
•Possono essere prodotti in forma ricombinante<br />
•Le proprietà <strong>del</strong>l’immunogeno possono essere<br />
migliorate (da fusioni geniche o mutagenesi)<br />
•Poco immunogenici (richiedono a<strong>di</strong>uvanti e dosi<br />
multiple)<br />
•Costosi e poco stabili
Esempi <strong>di</strong> vaccini a subunità (ricombinanti)<br />
<strong>Vaccini</strong> basati su singole proteine o pepti<strong>di</strong> <br />
Esempio vaccino anti-epatite B.<br />
Espressi in sistemi eterologhi come cellule <strong>di</strong><br />
batterio, lievito, mammifero, insetto e pianta<br />
<strong>Vaccini</strong> a DNA (vaccini genetici) Viene<br />
inoculato <strong>di</strong>rettamente il plasmide che<br />
contiene il gene <strong>di</strong> interesse
Principi <strong>di</strong> base <strong>del</strong>la vaccinazione<br />
Quando si <strong>di</strong>segna un vaccino è necessario<br />
considerare il tipo <strong>di</strong> risposta immune desiderata<br />
IMMUNITA’ UMORALE (anticorpi: es. IgG, IgA)<br />
essenzi<strong>al</strong>e per l’eliminazione <strong>di</strong> patogeni<br />
extracellulari<br />
IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATA (citotossica,<br />
CTL) richiesta per l’eliminazione <strong>di</strong> patogeni<br />
intracellulari (es. <strong>virus</strong>) o cellule tumor<strong>al</strong>i
Il problema: il <strong>virus</strong> <strong>del</strong> papilloma umano-<br />
HPV<br />
55 nm
HPV e Cancro<br />
Più <strong>di</strong> 120 tipi <strong>di</strong> cui circa 30 tipi infettano<br />
le mucose genit<strong>al</strong>i<br />
‘basso rischio’ (HPV 6, 11): con<strong>di</strong>lomi<br />
‘<strong>al</strong>to rischio’ (HPV 16, 18, 31, 33, 45)<br />
agenti caus<strong>al</strong>i <strong>di</strong> più <strong>del</strong> 99.7% <strong>del</strong> cancro<br />
<strong>al</strong>la cervice (anche anogenit<strong>al</strong>i e <strong>al</strong>cuni <strong>tumori</strong> testacollo)<br />
Più <strong>del</strong> 50% dei <strong>tumori</strong> <strong>al</strong> collo <strong>del</strong>l’utero<br />
sono dovuti a HPV16
Proteine vir<strong>al</strong>i<br />
Le proteine <strong>di</strong> HPV<br />
Funzioni<br />
E6 oncoproteina<br />
E7 oncoproteina (17 KDa)<br />
E5 oncoproteina<br />
E2 fattore <strong>di</strong> trascrizione/replicazione<br />
E1 fattore <strong>di</strong> replicazione<br />
E4 facilita l’’escape’ vir<strong>al</strong>e (?)<br />
L1 proteina capsi<strong>di</strong>ca (55 KDa)<br />
L2 proteina capsi<strong>di</strong>ca
Integrazione vir<strong>al</strong>e nelle cellule<br />
cancerose
Integrazione vir<strong>al</strong>e nelle cellule<br />
cancerose
Prevenzione e <strong>di</strong>agnosi <strong>del</strong> cancro<br />
<strong>al</strong> collo <strong>del</strong>l’utero<br />
PAP test (metodo <strong>di</strong> screening, 20% f<strong>al</strong>si negativi)<br />
Meto<strong>di</strong> molecolari per identificare il <strong>virus</strong> (S-blot ( S-blot,<br />
ibridazione in in situ situ PCR etc.)<br />
Vaccino profilattico<br />
In un futuro prossimo:<br />
Anticorpi per in<strong>di</strong>viduare le oncoproteine vir<strong>al</strong>i<br />
(E5, E6, E7) espresse nelle fasi cancerose
Vaccino profilattico anti-HPV<br />
2002: anno <strong>del</strong> vaccino profilattico anti-HPV.<br />
Basato sulla proteina L1 prodotta in<br />
lievito che si auto-assembla in ‘Virus<br />
Like Particles’ (VLPs)<br />
Induce anticorpi neutr<strong>al</strong>izzanti <strong>contro</strong> il<br />
<strong>virus</strong> in grado <strong>di</strong> prevenire l’infezione.<br />
VLPs<br />
Sicuro e ben tollerato. Disponibile commerci<strong>al</strong>mente tra<br />
3-4 anni<br />
Tuttavia<br />
gli <strong>al</strong>ti costi <strong>di</strong> produzione e <strong>di</strong>stribuzione non<br />
permetteranno una applicazione <strong>di</strong>ffusa <strong>di</strong> questo vaccino
Terapia <strong>del</strong> tumore <strong>del</strong> collo<br />
<strong>del</strong>l’utero<br />
Chirurgia, ra<strong>di</strong>o-terapia, chemio-ra<strong>di</strong>o-terapia<br />
Circa il 35% <strong>del</strong>le pazienti sviluppa<br />
m<strong>al</strong>attia persistente o metastasi, per le<br />
qu<strong>al</strong>i non esiste adeguata terapia<br />
In futuro: vaccini terapeutici
Vaccino Terapeutico<br />
Deve stimolare una risposta immunitaria <strong>di</strong> tipo<br />
citotossica (CTL) <strong>contro</strong> proteine non-struttur<strong>al</strong>i<br />
in modo <strong>di</strong> promuovere la regressione <strong>del</strong><br />
tumore.<br />
Can<strong>di</strong>dati: proteine E6 e E7 (Antigeni specifici<br />
<strong>del</strong> Tumore). Poco immunogeniche.<br />
Molti ‘tri<strong>al</strong>’ clinici in corso basati su E7, come<br />
DNA o come proteina
Espressione <strong>di</strong> proteine eterologhe in pianta<br />
> SISTEMI DI ESPRESSIONE TRANSGENICA<br />
(nucleare-il gene eterologo è trasmesso <strong>al</strong>la progenie. Es.<br />
trasformazione me<strong>di</strong>ata da Agrobatterio)<br />
> SISTEMI DI ESPRESSIONE TRANSIENTE<br />
BASATI SU VIRUS VEGETALI (il gene eterologo non<br />
è ere<strong>di</strong>tato d<strong>al</strong>la progenie. Es. infezione con <strong>virus</strong> X <strong>del</strong>la<br />
patata, PVX)
Attività 1:<br />
Vaccino profilattico basato sulla proteina<br />
L1 espressa in modo stabile<br />
Risultati: molte linee transgeniche<br />
<strong>di</strong> pomodoro che esprimono il gene<br />
L1<br />
L’eventu<strong>al</strong>e assemblaggio <strong>di</strong> L1 in<br />
VLPs verrà v<strong>al</strong>utato (anche me<strong>di</strong>ante<br />
TEM)<br />
??????
Attività 2:<br />
Vaccino terapeutico basato sulla proteina E7<br />
espressa in modo transiente tramite PVX<br />
125.6<br />
89.4<br />
64.9<br />
52.8<br />
39.8<br />
27.7<br />
21.8<br />
16.2<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10<br />
E7<br />
RISULTATI:<br />
a) L’ oncoproteina E7 è<br />
espressa in piante <strong>di</strong> N.<br />
benthamiana
) Gli estratti <strong>di</strong> pianta contenenti E7<br />
inducono una risposta immunitaria nel<br />
topo<br />
OD450nm<br />
2,5<br />
2<br />
1,5<br />
1<br />
0,5<br />
0<br />
Nb-PVXwt<br />
Nb-PVXE7<br />
His-E7+Quil A<br />
IgGtot IgG1 IgG2a IgG2b IgG3<br />
Umor<strong>al</strong>e (anticorpi)<br />
+<br />
IFN-gamma ELISPOT Numbers/2x10 5 Splenocytes<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
none<br />
With E7 peptide (aa. 49-57)<br />
Without E7 peptide<br />
Nb-PVXwt<br />
Nb-PVXE7<br />
His-E7+Quil A<br />
His-E7+Nb-PVXwt<br />
Cellulo-me<strong>di</strong>ata (ELISPOT su<br />
splenociti <strong>di</strong> topi vaccinati che<br />
producono Interferon-γ)
c) I topi vaccinati con gli estratti <strong>di</strong> pianta sono protetti<br />
d<strong>al</strong> tumore<br />
% Tumour free anim<strong>al</strong>s<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0 7 14 21 28 35 40 50 60<br />
Days after C3 ch<strong>al</strong>lenge<br />
Nb-PVXE7<br />
His-E7 + Quil A<br />
Nb-PVXw t<br />
none<br />
d) I topi vaccinati con gli estratti <strong>di</strong> pianta presentano<br />
ridotta massa tumor<strong>al</strong>e<br />
Tumour volume (cm 3 )<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
Nb-PVXE7<br />
His-E7 + Quil A<br />
Nb-PVXw t<br />
none<br />
7 14 21 28 35 42 49 56<br />
Days after C3 ch<strong>al</strong>lenge<br />
Il volume<br />
<strong>del</strong><br />
tumore è<br />
il 15% <strong>di</strong><br />
quello dei<br />
topi non<br />
vaccinati
Brevetto ENEA/ISS/IRE<br />
FRANCONI R. et <strong>al</strong>. (2001) ‘<strong>Vaccini</strong> a subunità e<br />
proce<strong>di</strong>menti per la loro produzione’ PCT/IT02/00354.
Conclusioni<br />
Stabilita una procedura economica ed<br />
efficace per produrre un vaccino antitumor<strong>al</strong>e<br />
da pianta basato sulla proteina E7<br />
Lavoro futuro<br />
Comprendere la natura dei macroaggregati<br />
e l’effetto a<strong>di</strong>uvante <strong>del</strong>l’estratto <strong>di</strong> pianta<br />
Aumento dei livelli <strong>di</strong> espressione e<br />
purificazione <strong>del</strong>la proteina E7 per sua<br />
caratterizzazione biochimica
S. Massa<br />
E. Illiano<br />
E. Benvenuto<br />
O. Bitti<br />
R. Franconi<br />
ENEA, BIOTEC GEN<br />
Prof. S. Duprè<br />
Dip. Biochimica<br />
Università ‘La Sapienza’, Sapienza’ , Roma<br />
A. Cirilli<br />
A. Muller<br />
P. Simeone<br />
A. Venuti<br />
Lab. <strong>di</strong> Virologia,<br />
Istituto Regina Elena, Roma<br />
L. Accar<strong>di</strong><br />
P. Di Bonito<br />
M. G. Donà<br />
C. Giorgi<br />
Lab. <strong>di</strong> Virologia<br />
Istituto Superiore <strong>di</strong> Sanità, Roma<br />
Finanziamenti<br />
PNR AIDS 2000-1-2<br />
Associazione it<strong>al</strong>iana Ricerca sul Cancro (AIRC) 2001-3<br />
Ricerca Fin<strong>al</strong>izzata Ministero <strong>del</strong>la S<strong>al</strong>ute 2000, 2002
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