Vaccini di origine vegetale contro i tumori associati al virus del ...
Vaccini di origine vegetale contro i tumori associati al virus del ...
Vaccini di origine vegetale contro i tumori associati al virus del ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Workshop ENEA, 4 <strong>di</strong>cembre 2003<br />
‘Molecular farming: produzione <strong>di</strong> cibi funzion<strong>al</strong>i, <strong>di</strong> nutraceutici e<br />
biofarmaceutici’<br />
<strong>Vaccini</strong> <strong>di</strong> <strong>origine</strong><br />
<strong>veget<strong>al</strong>e</strong> <strong>contro</strong> i <strong>tumori</strong><br />
<strong>associati</strong> <strong>al</strong> <strong>virus</strong> <strong>del</strong><br />
papilloma umano (HPV)<br />
Rosella Franconi<br />
BIOTEC GEN
SOMMARIO<br />
• Definizioni<br />
2. Il problema: il <strong>virus</strong> <strong>del</strong> papilloma umano<br />
• Caratteristiche<br />
• <strong>Vaccini</strong> profilattico<br />
• Vaccino terapeutico<br />
3. Le piante per lo sviluppo <strong>di</strong> vaccini anti-HPV<br />
a) le piante come biofabbriche<br />
b) sequenze da <strong>virus</strong> veget<strong>al</strong>i per vaccini a<br />
DNA<br />
4. Conclusioni e sviluppi
Definizioni<br />
ANTIGENI tutte le molecole in grado<br />
<strong>di</strong> indurre una risposta immunitaria<br />
VACCINI A SUBUNITA’ Viene usata solo una<br />
parte <strong>del</strong> patogeno capace <strong>di</strong> indurre una<br />
risposta immunitaria.<br />
ADIUVANTE sostanza in grado <strong>di</strong> aumentare<br />
l’immunogenicità <strong>di</strong> un dato antigene<br />
Molti <strong>al</strong>lo stu<strong>di</strong>o ma solo pochi approvati per uso umano<br />
(es. <strong>al</strong>cuni s<strong>al</strong>i miner<strong>al</strong>i: idrossido <strong>di</strong> <strong>al</strong>luminio, fosfato<br />
<strong>di</strong> c<strong>al</strong>cio). Non sono noti i meccanismi <strong>di</strong> azione
Princip<strong>al</strong>i vantaggi:<br />
Svantaggi:<br />
<strong>Vaccini</strong> a subunità<br />
•Sicurezza (utilizzata solo una parte <strong>del</strong> patogeno)<br />
•Possono essere prodotti in forma ricombinante<br />
•Le proprietà <strong>del</strong>l’immunogeno possono essere<br />
migliorate (da fusioni geniche o mutagenesi)<br />
•Poco immunogenici (richiedono a<strong>di</strong>uvanti e dosi<br />
multiple)<br />
•Costosi e poco stabili
Esempi <strong>di</strong> vaccini a subunità (ricombinanti)<br />
<strong>Vaccini</strong> basati su singole proteine o pepti<strong>di</strong> <br />
Esempio vaccino anti-epatite B.<br />
Espressi in sistemi eterologhi come cellule <strong>di</strong><br />
batterio, lievito, mammifero, insetto e pianta<br />
<strong>Vaccini</strong> a DNA (vaccini genetici) Viene<br />
inoculato <strong>di</strong>rettamente il plasmide che<br />
contiene il gene <strong>di</strong> interesse
Principi <strong>di</strong> base <strong>del</strong>la vaccinazione<br />
Quando si <strong>di</strong>segna un vaccino è necessario<br />
considerare il tipo <strong>di</strong> risposta immune desiderata<br />
IMMUNITA’ UMORALE (anticorpi: es. IgG, IgA)<br />
essenzi<strong>al</strong>e per l’eliminazione <strong>di</strong> patogeni<br />
extracellulari<br />
IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATA (citotossica,<br />
CTL) richiesta per l’eliminazione <strong>di</strong> patogeni<br />
intracellulari (es. <strong>virus</strong>) o cellule tumor<strong>al</strong>i
Il problema: il <strong>virus</strong> <strong>del</strong> papilloma umano-<br />
HPV<br />
55 nm
HPV e Cancro<br />
Più <strong>di</strong> 120 tipi <strong>di</strong> cui circa 30 tipi infettano<br />
le mucose genit<strong>al</strong>i<br />
‘basso rischio’ (HPV 6, 11): con<strong>di</strong>lomi<br />
‘<strong>al</strong>to rischio’ (HPV 16, 18, 31, 33, 45)<br />
agenti caus<strong>al</strong>i <strong>di</strong> più <strong>del</strong> 99.7% <strong>del</strong> cancro<br />
<strong>al</strong>la cervice (anche anogenit<strong>al</strong>i e <strong>al</strong>cuni <strong>tumori</strong> testacollo)<br />
Più <strong>del</strong> 50% dei <strong>tumori</strong> <strong>al</strong> collo <strong>del</strong>l’utero<br />
sono dovuti a HPV16
Proteine vir<strong>al</strong>i<br />
Le proteine <strong>di</strong> HPV<br />
Funzioni<br />
E6 oncoproteina<br />
E7 oncoproteina (17 KDa)<br />
E5 oncoproteina<br />
E2 fattore <strong>di</strong> trascrizione/replicazione<br />
E1 fattore <strong>di</strong> replicazione<br />
E4 facilita l’’escape’ vir<strong>al</strong>e (?)<br />
L1 proteina capsi<strong>di</strong>ca (55 KDa)<br />
L2 proteina capsi<strong>di</strong>ca
Integrazione vir<strong>al</strong>e nelle cellule<br />
cancerose
Integrazione vir<strong>al</strong>e nelle cellule<br />
cancerose
Prevenzione e <strong>di</strong>agnosi <strong>del</strong> cancro<br />
<strong>al</strong> collo <strong>del</strong>l’utero<br />
PAP test (metodo <strong>di</strong> screening, 20% f<strong>al</strong>si negativi)<br />
Meto<strong>di</strong> molecolari per identificare il <strong>virus</strong> (S-blot ( S-blot,<br />
ibridazione in in situ situ PCR etc.)<br />
Vaccino profilattico<br />
In un futuro prossimo:<br />
Anticorpi per in<strong>di</strong>viduare le oncoproteine vir<strong>al</strong>i<br />
(E5, E6, E7) espresse nelle fasi cancerose
Vaccino profilattico anti-HPV<br />
2002: anno <strong>del</strong> vaccino profilattico anti-HPV.<br />
Basato sulla proteina L1 prodotta in<br />
lievito che si auto-assembla in ‘Virus<br />
Like Particles’ (VLPs)<br />
Induce anticorpi neutr<strong>al</strong>izzanti <strong>contro</strong> il<br />
<strong>virus</strong> in grado <strong>di</strong> prevenire l’infezione.<br />
VLPs<br />
Sicuro e ben tollerato. Disponibile commerci<strong>al</strong>mente tra<br />
3-4 anni<br />
Tuttavia<br />
gli <strong>al</strong>ti costi <strong>di</strong> produzione e <strong>di</strong>stribuzione non<br />
permetteranno una applicazione <strong>di</strong>ffusa <strong>di</strong> questo vaccino
Terapia <strong>del</strong> tumore <strong>del</strong> collo<br />
<strong>del</strong>l’utero<br />
Chirurgia, ra<strong>di</strong>o-terapia, chemio-ra<strong>di</strong>o-terapia<br />
Circa il 35% <strong>del</strong>le pazienti sviluppa<br />
m<strong>al</strong>attia persistente o metastasi, per le<br />
qu<strong>al</strong>i non esiste adeguata terapia<br />
In futuro: vaccini terapeutici
Vaccino Terapeutico<br />
Deve stimolare una risposta immunitaria <strong>di</strong> tipo<br />
citotossica (CTL) <strong>contro</strong> proteine non-struttur<strong>al</strong>i<br />
in modo <strong>di</strong> promuovere la regressione <strong>del</strong><br />
tumore.<br />
Can<strong>di</strong>dati: proteine E6 e E7 (Antigeni specifici<br />
<strong>del</strong> Tumore). Poco immunogeniche.<br />
Molti ‘tri<strong>al</strong>’ clinici in corso basati su E7, come<br />
DNA o come proteina
Espressione <strong>di</strong> proteine eterologhe in pianta<br />
> SISTEMI DI ESPRESSIONE TRANSGENICA<br />
(nucleare-il gene eterologo è trasmesso <strong>al</strong>la progenie. Es.<br />
trasformazione me<strong>di</strong>ata da Agrobatterio)<br />
> SISTEMI DI ESPRESSIONE TRANSIENTE<br />
BASATI SU VIRUS VEGETALI (il gene eterologo non<br />
è ere<strong>di</strong>tato d<strong>al</strong>la progenie. Es. infezione con <strong>virus</strong> X <strong>del</strong>la<br />
patata, PVX)
Attività 1:<br />
Vaccino profilattico basato sulla proteina<br />
L1 espressa in modo stabile<br />
Risultati: molte linee transgeniche<br />
<strong>di</strong> pomodoro che esprimono il gene<br />
L1<br />
L’eventu<strong>al</strong>e assemblaggio <strong>di</strong> L1 in<br />
VLPs verrà v<strong>al</strong>utato (anche me<strong>di</strong>ante<br />
TEM)<br />
??????
Attività 2:<br />
Vaccino terapeutico basato sulla proteina E7<br />
espressa in modo transiente tramite PVX<br />
125.6<br />
89.4<br />
64.9<br />
52.8<br />
39.8<br />
27.7<br />
21.8<br />
16.2<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10<br />
E7<br />
RISULTATI:<br />
a) L’ oncoproteina E7 è<br />
espressa in piante <strong>di</strong> N.<br />
benthamiana
) Gli estratti <strong>di</strong> pianta contenenti E7<br />
inducono una risposta immunitaria nel<br />
topo<br />
OD450nm<br />
2,5<br />
2<br />
1,5<br />
1<br />
0,5<br />
0<br />
Nb-PVXwt<br />
Nb-PVXE7<br />
His-E7+Quil A<br />
IgGtot IgG1 IgG2a IgG2b IgG3<br />
Umor<strong>al</strong>e (anticorpi)<br />
+<br />
IFN-gamma ELISPOT Numbers/2x10 5 Splenocytes<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
none<br />
With E7 peptide (aa. 49-57)<br />
Without E7 peptide<br />
Nb-PVXwt<br />
Nb-PVXE7<br />
His-E7+Quil A<br />
His-E7+Nb-PVXwt<br />
Cellulo-me<strong>di</strong>ata (ELISPOT su<br />
splenociti <strong>di</strong> topi vaccinati che<br />
producono Interferon-γ)
c) I topi vaccinati con gli estratti <strong>di</strong> pianta sono protetti<br />
d<strong>al</strong> tumore<br />
% Tumour free anim<strong>al</strong>s<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0 7 14 21 28 35 40 50 60<br />
Days after C3 ch<strong>al</strong>lenge<br />
Nb-PVXE7<br />
His-E7 + Quil A<br />
Nb-PVXw t<br />
none<br />
d) I topi vaccinati con gli estratti <strong>di</strong> pianta presentano<br />
ridotta massa tumor<strong>al</strong>e<br />
Tumour volume (cm 3 )<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
Nb-PVXE7<br />
His-E7 + Quil A<br />
Nb-PVXw t<br />
none<br />
7 14 21 28 35 42 49 56<br />
Days after C3 ch<strong>al</strong>lenge<br />
Il volume<br />
<strong>del</strong><br />
tumore è<br />
il 15% <strong>di</strong><br />
quello dei<br />
topi non<br />
vaccinati
Brevetto ENEA/ISS/IRE<br />
FRANCONI R. et <strong>al</strong>. (2001) ‘<strong>Vaccini</strong> a subunità e<br />
proce<strong>di</strong>menti per la loro produzione’ PCT/IT02/00354.
Conclusioni<br />
Stabilita una procedura economica ed<br />
efficace per produrre un vaccino antitumor<strong>al</strong>e<br />
da pianta basato sulla proteina E7<br />
Lavoro futuro<br />
Comprendere la natura dei macroaggregati<br />
e l’effetto a<strong>di</strong>uvante <strong>del</strong>l’estratto <strong>di</strong> pianta<br />
Aumento dei livelli <strong>di</strong> espressione e<br />
purificazione <strong>del</strong>la proteina E7 per sua<br />
caratterizzazione biochimica
S. Massa<br />
E. Illiano<br />
E. Benvenuto<br />
O. Bitti<br />
R. Franconi<br />
ENEA, BIOTEC GEN<br />
Prof. S. Duprè<br />
Dip. Biochimica<br />
Università ‘La Sapienza’, Sapienza’ , Roma<br />
A. Cirilli<br />
A. Muller<br />
P. Simeone<br />
A. Venuti<br />
Lab. <strong>di</strong> Virologia,<br />
Istituto Regina Elena, Roma<br />
L. Accar<strong>di</strong><br />
P. Di Bonito<br />
M. G. Donà<br />
C. Giorgi<br />
Lab. <strong>di</strong> Virologia<br />
Istituto Superiore <strong>di</strong> Sanità, Roma<br />
Finanziamenti<br />
PNR AIDS 2000-1-2<br />
Associazione it<strong>al</strong>iana Ricerca sul Cancro (AIRC) 2001-3<br />
Ricerca Fin<strong>al</strong>izzata Ministero <strong>del</strong>la S<strong>al</strong>ute 2000, 2002