Herpesvirus - BGTG.it

HERPESVIRIDAE
(>80 virus; classi a, b, g )
Gli Herpesvirus umani sono 8:
a HSV-1 Herpes simplex tipo 1
a HSV-2 Herpes simplex tipo 2
a VZV Varicella Zoster
b EBV Epstein-Barr
g HCMV Citomegalovirus
b HHV-6
b HHV-7
g HHV-8 (Sarcoma di Kaposi)

HSV-1
Ampio spettro di ospite
Ciclo litico 24 h
Neurotropismo
Involucro (11 gp: gC, gD, gB…)
Tegumento (VP16, Vhs)
Capside (162 capsomeri)
TRL U L IRL IRS U S TRS
Genoma (dsDNA; 152 Kb; 84 geni) in 2 unità:
si circolarizza formando isomeri diversi

GENOME
CAPSIDE
TEGUMENTO
PERICAPSIDE
GLICOPROTEINE
GLICOPROTEINE

HSV possiede una serie di
glicoproteine di superficie
che interagiscono con una
serie di recettori.
Il virus entra per fusione
del suo involucro con la
membrana cellulare

Proteine del tegumento
VP16 = a-TIF, fattore di trascrizione
(cx con Oct-1 e -2)
che si lega alla sequenza TAATGA-ATTTC
nei promotori dei 5 geni IE.
Vhs = Viral shut-off protein (gene U L 41)
si lega ai ribosomi bloccando la
sintesi proteica dell’ospite.

Trascrizione IE (a)
---> 5 geni IE
TAATGARAT
a-TIF + Oct
+TBC
+Pol II

I geni IE sono 5:
ICP0 fattore di trascrizione
ICP4 attivatore dei geni E e L
repressore dei geni IE
ICP22 modifica la RNA pol II
ICP27 regola lo splicing
ICP47 deprime l’espressione di MHC-I
TRL U L IRL IRS U S TRS
0 27 0 4 22 47 4

Trascrizione E (b)
a4 + Sp1

7 proteine E sono necessarie per replicare il genoma virale
U L 30 = DNA polimerasi
U L 42 e 29 = DNA binding proteins
U L 9 = ORI binding protein
U L 5, 8 e 52 = Cx elicasi/primasi

Trascrizione L (g)
a0, a4, a27 + DBF

1. Circolarizzazione del DNA
2. VP16 + Oct-1 dirige la
trascrizione IE (a)
3. a0 e a4 dirigono la
trascrizione E (b)
4. Proteine E replicano il DNA
5. a0 e a27 dirigono la
trascrizione L (g)(proteine
strutturali)
6. Assemblaggio del capside
L1. Formazione di un mini
-cromosoma con nucleosomi
Trascrizione bloccata
L2. Stress/riattivazione
L3. La trascrizione riprende

L’intero ciclo vitale di HSV
avviene nel nucleo. Dopo
l’assemblaggio del capside,
il virus passa per gemmazione
nel citoplasma acquisendo
l’involucro (dalla membrana
nucleare)

LATENZA
(neuroni sensitivi, gangli del trigemino)
Nella latenza, gli istoni si legano al DNA
formando mini-cromosomi.
Viene trascritto solo il gene LAT,
il cui prodotto viene spliced, ma non tradotto.
Probabilmente, funge da antisenso
per il trascritto del gene a0

1. Circolarizzazione del DNA
2. VP16 + Oct-1 dirige la
trascrizione IE (a)
3. a0 e a4 dirigono la
trascrizione E (b)
4. Proteine E replicano il DNA
5. a0 e a27 dirigono la
trascrizione L (g)(proteine
strutturali)
6. Assemblaggio del capside
L1. Formazione di un mini
-cromosoma con nucleosomi
Trascrizione bloccata
L2. Stress/riattivazione
L3. La trascrizione riprende

Visitate il sito:
http://darwin.bio.uci.edu/~faculty/wagner/hsv1f.html
Una lezione molto approfondita sugli Herpesvirus
Con testo, referenze, immagini e filmati.

Vettori basati
su VHS
Attenuati
Non replicativi
Ampliconi

Vettori derivati dal virus dell’Herpes
simplex
• Vettori replicativi attenuati: costituiti da virus attenuati
mutati o deleti di geni non essenziali per la replicazione in
colture cellulari ma importanti per il ciclo vitale del virus
nell’ospite naturale
• Vettori non replicativi a genoma intero: costituiti da virus
deleti di geni attivi durante il ciclo litico. Essenziali per la
replicazione in colture cellulari
• Vettori non replicativi di tipo plasmidico denominati ampliconi :
contengono sequenze di incapsidamento di HSV, origine di
replicazione

helper virus
defettivo
helper virus
defettivo
AMPLICONI VETTORI NON
REPLICATIVI
transgene
linea cellulare
complementante
HSV ori
E.coli ori
“a”
plasmide
amplicone
cosmidi di
HSV-1
colture cellulari
vettore
amplicone
cromosoma artificiale
batterico di HSV-1
E.coli F
U S
U L
virus
defettivi in
geni essenziali
colture cellulari linea cellulare
complementante
X
nessuna crescita nessuna
virale produzione virale
crescita
virale
VETTORI
REPLICATIVI
virus
con delezioni in
geni non essenziali
colture cellulari
produzione
virale
limitata
crescita virale

Ampliconi
Vecchia
generazione
Nuova
generazione
Alta contaminazione
da helper (1/1)
Helper-free
Cosmidi
HSV-BAC
Bassa contaminazione
da helper (1/100)

virus helper
defettivo
virus helper
defettivo
transgene
linea cellulare
complementante
VHS ori
AMPLICONI
“a” plasmide
amplicone
cosmidi di
VHS-1
E.coli ori
colture cellulari
vettore
amplicone
cromosoma artificiale
batterico di VHS-1
E.coli F
U S
nessuna crescita
virale
U L

Plasmide amplicone
pac
ori
pac
ori
Taglio
Funzioni helper di VHS-1
~ 152 kb
Replicazione del DNA con meccanismo a “rolling circle”
e formazione del concatamero testa-coda
Vettore amplicone
Taglio

Il genoma dell’amplicone è composto da copie multiple di DNA plasmidico
(il plasmide amplicone) che contiene un’origine di replicazione (ori s) e il
segnale di packaging (pac) del genoma di HSV-1.
Le funzioni richieste per la replicazione, il packaging del DNA e la
produzione di particelle virali (i vettori ampliconi),sono fornite
o da virus helper, o da sistemi helper-free.
In presenza delle funzioni helper, il plasmide amplicone viene prima
replicato sotto forma di concatameri testa-coda,che vengono
successivamente inseriti nei capsidi preformati con formazione del
vettore amplicone

VANTAGGI (1)
Non sono tossici per le cellule infettate in quanto non contengono il
genoma di HSV-1;
il carattere ripetitivo del genoma (fino a 153 kbp) permette il
trasferimento di copie multiple del transgene;
può infettare numerosi tipi di cellule, incluse quelle dendritiche;
lo stesso protocollo di immunizzazione permette la presentazione
antigenica mediata sia da MHC di classe I che di classe II;
può esprimere uno o più antigeni appartenenti allo stesso virus o a
virus differenti (vaccini mono-componenti, multi-componenti o
combinati).

VANTAGGI DEI VETTORI AMPLICONI
Combinano le proprietà dei: a) vaccini a DNA, b) vaccini a subunità, e c)
vaccini con vettori erpetici ricombinanti
(I) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto
di MHC-I: gli antigeni selezionati sono codificati dal plasmide
amplicone e sono espressi dalle cellule infettate.
(II) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto
di MHC-II: gli antigeni selezionati sono incorporati nelle particelle del
vettore (pericapside e/o tegumento).
(III) favoriscono la formazione di VLPs: gli antigeni vaccinali codificati
dall’amplicone plasmide ed espressi dalle cellule infettate si
autoassemblano formando VLPs che vengono secrete dalle cellule.
(IV) Si può favorire la diffusione dell’antigene dalle cellule-bersaglio a
quelle vicine: utilizzando VP22, proteina del tegumento di HSV-1.

Vettore Amplicone Plasmide Amplicone
Amp R
Ori S
Gene
Vaccinale
gB gD E1-E2 C Tat Tat22 E7 L1-L2
HSV HCV HIV HPV-16
Antigeni Vaccinali
Pac

VANTAGGI DEI VETTORI AMPLICONI
Combinano le proprietà dei: a) vaccini a DNA, b) vaccini a subunità, e c)
vaccini con vettori erpetici ricombinanti
(I) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto
di MHC-I: gli antigeni selezionati sono codificati dal plasmide
amplicone e sono espressi dalle cellule infettate.
(II) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto
di MHC-II: gli antigeni selezionati sono incorporati nelle particelle del
vettore (pericapside e/o tegumento).
(III) favoriscono la formazione di VLPs: gli antigeni vaccinali codificati
dall’amplicone plasmide ed espressi dalle cellule infettate si
autoassemblano formando VLPs che vengono secrete dalle cellule.
(IV) Si può favorire la diffusione dell’antigene dalle cellule-bersaglio a
quelle vicine: utilizzando VP22, proteina del tegumento di HSV-1.

gD
VP22
gC
Vettore
Amplicone
gH/gL
gB
Antigene di HIV
Antigene di HCV

VANTAGGI DEI VETTORI AMPLICONI
Combinano le proprietà dei: a) vaccini a DNA, b) vaccini a subunità, e c)
vaccini con vettori erpetici ricombinanti
(I) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto
di MHC-I: gli antigeni selezionati sono codificati dal plasmide
amplicone e sono espressi dalle cellule infettate.
(II) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto
di MHC-II: gli antigeni selezionati sono incorporati nelle particelle del
vettore (pericapside e/o tegumento).
(III) favoriscono la formazione di VLPs: gli antigeni vaccinali codificati
dall’amplicone plasmide ed espressi dalle cellule infettate si
autoassemblano formando VLPs che vengono secrete dalle cellule.
(IV) Si può favorire la diffusione dell’antigene dalle cellule-bersaglio a
quelle vicine: utilizzando VP22, proteina del tegumento di HSV-1.

Produzione di VLPs di HPV e HCV da cellule transdotte con gli ampliconi
1a. Infezione di cellule VERO con i
vettori ampliconi ricombinanti
che esprimono L1-L2 (HPV):
o
CITOPLASMA
NUCLEO
proteine C-E1-E2
(HCV)
2a. Infezione di cellule VERO con i
vettori ampliconi ricombinanti
che esprimono C-E1-E2 (HCV):
o
1b. Produzione e rilascio di “virus-like particles”
di HPV-16,costituite dalle proteine L1 e L2.
proteine L1-L2
(HPV)
2b. Produzione e rilascio di “virus-like particles”
di HCV,costituite dalle proteine C, E1 ed E2.

VANTAGGI DEI VETTORI AMPLICONI
Combinano le proprietà dei: a) vaccini a DNA, b) vaccini a subunità, e c)
vaccini con vettori erpetici ricombinanti
(I) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto
di MHC-I: gli antigeni selezionati sono codificati dal plasmide
amplicone e sono espressi dalle cellule infettate.
(II) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto
di MHC-II: gli antigeni selezionati sono incorporati nelle particelle del
vettore (pericapside e/o tegumento).
(III) favoriscono la formazione di VLPs: gli antigeni vaccinali codificati
dall’amplicone plasmide ed espressi dalle cellule infettate si
autoassemblano formando VLPs che vengono secrete dalle cellule.
(IV) Si può favorire la diffusione dell’antigene dalle cellule-bersaglio a
quelle vicine: utilizzando VP22, proteina del tegumento di HSV-1.

VP22
Componente del tegumento di HSV-1
Proteina di 38 KDa, basica, altamente
fosforilata con alta affinità per la cromatina
Esportata dal citoplasma delle cellule che la
esprimono, viene importata nelle cellule
vicine dove si accumula nel nucleo
E’ dotata di diffusione inter-cellulare
Il suo movimento fra le cellule coinvolge i
filamenti di actina