Herpesvirus - BGTG.it
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HERPESVIRIDAE<br />
(>80 virus; classi a, b, g )<br />
Gli <strong>Herpesvirus</strong> umani sono 8:<br />
a HSV-1 Herpes simplex tipo 1<br />
a HSV-2 Herpes simplex tipo 2<br />
a VZV Varicella Zoster<br />
b EBV Epstein-Barr<br />
g HCMV C<strong>it</strong>omegalovirus<br />
b HHV-6<br />
b HHV-7<br />
g HHV-8 (Sarcoma di Kaposi)
HSV-1<br />
Ampio spettro di osp<strong>it</strong>e<br />
Ciclo l<strong>it</strong>ico 24 h<br />
Neurotropismo<br />
Involucro (11 gp: gC, gD, gB…)<br />
Tegumento (VP16, Vhs)<br />
Capside (162 capsomeri)<br />
TRL U L IRL IRS U S TRS<br />
Genoma (dsDNA; 152 Kb; 84 geni) in 2 un<strong>it</strong>à:<br />
si circolarizza formando isomeri diversi
GENOME<br />
CAPSIDE<br />
TEGUMENTO<br />
PERICAPSIDE<br />
GLICOPROTEINE<br />
GLICOPROTEINE
HSV possiede una serie di<br />
glicoproteine di superficie<br />
che interagiscono con una<br />
serie di recettori.<br />
Il virus entra per fusione<br />
del suo involucro con la<br />
membrana cellulare
Proteine del tegumento<br />
VP16 = a-TIF, fattore di trascrizione<br />
(cx con Oct-1 e -2)<br />
che si lega alla sequenza TAATGA-ATTTC<br />
nei promotori dei 5 geni IE.<br />
Vhs = Viral shut-off protein (gene U L 41)<br />
si lega ai ribosomi bloccando la<br />
sintesi proteica dell’osp<strong>it</strong>e.
Trascrizione IE (a)<br />
---> 5 geni IE<br />
TAATGARAT<br />
a-TIF + Oct<br />
+TBC<br />
+Pol II
I geni IE sono 5:<br />
ICP0 fattore di trascrizione<br />
ICP4 attivatore dei geni E e L<br />
repressore dei geni IE<br />
ICP22 modifica la RNA pol II<br />
ICP27 regola lo splicing<br />
ICP47 deprime l’espressione di MHC-I<br />
TRL U L IRL IRS U S TRS<br />
0 27 0 4 22 47 4
Trascrizione E (b)<br />
a4 + Sp1
7 proteine E sono necessarie per replicare il genoma virale<br />
U L 30 = DNA polimerasi<br />
U L 42 e 29 = DNA binding proteins<br />
U L 9 = ORI binding protein<br />
U L 5, 8 e 52 = Cx elicasi/primasi
Trascrizione L (g)<br />
a0, a4, a27 + DBF
1. Circolarizzazione del DNA<br />
2. VP16 + Oct-1 dirige la<br />
trascrizione IE (a)<br />
3. a0 e a4 dirigono la<br />
trascrizione E (b)<br />
4. Proteine E replicano il DNA<br />
5. a0 e a27 dirigono la<br />
trascrizione L (g)(proteine<br />
strutturali)<br />
6. Assemblaggio del capside<br />
L1. Formazione di un mini<br />
-cromosoma con nucleosomi<br />
Trascrizione bloccata<br />
L2. Stress/riattivazione<br />
L3. La trascrizione riprende
L’intero ciclo v<strong>it</strong>ale di HSV<br />
avviene nel nucleo. Dopo<br />
l’assemblaggio del capside,<br />
il virus passa per gemmazione<br />
nel c<strong>it</strong>oplasma acquisendo<br />
l’involucro (dalla membrana<br />
nucleare)
LATENZA<br />
(neuroni sens<strong>it</strong>ivi, gangli del trigemino)<br />
Nella latenza, gli istoni si legano al DNA<br />
formando mini-cromosomi.<br />
Viene trascr<strong>it</strong>to solo il gene LAT,<br />
il cui prodotto viene spliced, ma non tradotto.<br />
Probabilmente, funge da antisenso<br />
per il trascr<strong>it</strong>to del gene a0
1. Circolarizzazione del DNA<br />
2. VP16 + Oct-1 dirige la<br />
trascrizione IE (a)<br />
3. a0 e a4 dirigono la<br />
trascrizione E (b)<br />
4. Proteine E replicano il DNA<br />
5. a0 e a27 dirigono la<br />
trascrizione L (g)(proteine<br />
strutturali)<br />
6. Assemblaggio del capside<br />
L1. Formazione di un mini<br />
-cromosoma con nucleosomi<br />
Trascrizione bloccata<br />
L2. Stress/riattivazione<br />
L3. La trascrizione riprende
Vis<strong>it</strong>ate il s<strong>it</strong>o:<br />
http://darwin.bio.uci.edu/~faculty/wagner/hsv1f.html<br />
Una lezione molto approfond<strong>it</strong>a sugli <strong>Herpesvirus</strong><br />
Con testo, referenze, immagini e filmati.
Vettori basati<br />
su VHS<br />
Attenuati<br />
Non replicativi<br />
Ampliconi
Vettori derivati dal virus dell’Herpes<br />
simplex<br />
• Vettori replicativi attenuati: cost<strong>it</strong>u<strong>it</strong>i da virus attenuati<br />
mutati o deleti di geni non essenziali per la replicazione in<br />
colture cellulari ma importanti per il ciclo v<strong>it</strong>ale del virus<br />
nell’osp<strong>it</strong>e naturale<br />
• Vettori non replicativi a genoma intero: cost<strong>it</strong>u<strong>it</strong>i da virus<br />
deleti di geni attivi durante il ciclo l<strong>it</strong>ico. Essenziali per la<br />
replicazione in colture cellulari<br />
• Vettori non replicativi di tipo plasmidico denominati ampliconi :<br />
contengono sequenze di incapsidamento di HSV, origine di<br />
replicazione
helper virus<br />
defettivo<br />
helper virus<br />
defettivo<br />
AMPLICONI VETTORI NON<br />
REPLICATIVI<br />
transgene<br />
linea cellulare<br />
complementante<br />
HSV ori<br />
E.coli ori<br />
“a”<br />
plasmide<br />
amplicone<br />
cosmidi di<br />
HSV-1<br />
colture cellulari<br />
vettore<br />
amplicone<br />
cromosoma artificiale<br />
batterico di HSV-1<br />
E.coli F<br />
U S<br />
U L<br />
virus<br />
defettivi in<br />
geni essenziali<br />
colture cellulari linea cellulare<br />
complementante<br />
X<br />
nessuna cresc<strong>it</strong>a nessuna<br />
virale produzione virale<br />
cresc<strong>it</strong>a<br />
virale<br />
VETTORI<br />
REPLICATIVI<br />
virus<br />
con delezioni in<br />
geni non essenziali<br />
colture cellulari<br />
produzione<br />
virale<br />
lim<strong>it</strong>ata<br />
cresc<strong>it</strong>a virale
Ampliconi<br />
Vecchia<br />
generazione<br />
Nuova<br />
generazione<br />
Alta contaminazione<br />
da helper (1/1)<br />
Helper-free<br />
Cosmidi<br />
HSV-BAC<br />
Bassa contaminazione<br />
da helper (1/100)
virus helper<br />
defettivo<br />
virus helper<br />
defettivo<br />
transgene<br />
linea cellulare<br />
complementante<br />
VHS ori<br />
AMPLICONI<br />
“a” plasmide<br />
amplicone<br />
cosmidi di<br />
VHS-1<br />
E.coli ori<br />
colture cellulari<br />
vettore<br />
amplicone<br />
cromosoma artificiale<br />
batterico di VHS-1<br />
E.coli F<br />
U S<br />
nessuna cresc<strong>it</strong>a<br />
virale<br />
U L
Plasmide amplicone<br />
pac<br />
ori<br />
pac<br />
ori<br />
Taglio<br />
Funzioni helper di VHS-1<br />
~ 152 kb<br />
Replicazione del DNA con meccanismo a “rolling circle”<br />
e formazione del concatamero testa-coda<br />
Vettore amplicone<br />
Taglio
Il genoma dell’amplicone è composto da copie multiple di DNA plasmidico<br />
(il plasmide amplicone) che contiene un’origine di replicazione (ori s) e il<br />
segnale di packaging (pac) del genoma di HSV-1.<br />
Le funzioni richieste per la replicazione, il packaging del DNA e la<br />
produzione di particelle virali (i vettori ampliconi),sono forn<strong>it</strong>e<br />
o da virus helper, o da sistemi helper-free.<br />
In presenza delle funzioni helper, il plasmide amplicone viene prima<br />
replicato sotto forma di concatameri testa-coda,che vengono<br />
successivamente inser<strong>it</strong>i nei capsidi preformati con formazione del<br />
vettore amplicone
VANTAGGI (1)<br />
Non sono tossici per le cellule infettate in quanto non contengono il<br />
genoma di HSV-1;<br />
il carattere ripet<strong>it</strong>ivo del genoma (fino a 153 kbp) permette il<br />
trasferimento di copie multiple del transgene;<br />
può infettare numerosi tipi di cellule, incluse quelle dendr<strong>it</strong>iche;<br />
lo stesso protocollo di immunizzazione permette la presentazione<br />
antigenica mediata sia da MHC di classe I che di classe II;<br />
può esprimere uno o più antigeni appartenenti allo stesso virus o a<br />
virus differenti (vaccini mono-componenti, multi-componenti o<br />
combinati).
VANTAGGI DEI VETTORI AMPLICONI<br />
Combinano le proprietà dei: a) vaccini a DNA, b) vaccini a subun<strong>it</strong>à, e c)<br />
vaccini con vettori erpetici ricombinanti<br />
(I) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto<br />
di MHC-I: gli antigeni selezionati sono codificati dal plasmide<br />
amplicone e sono espressi dalle cellule infettate.<br />
(II) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto<br />
di MHC-II: gli antigeni selezionati sono incorporati nelle particelle del<br />
vettore (pericapside e/o tegumento).<br />
(III) favoriscono la formazione di VLPs: gli antigeni vaccinali codificati<br />
dall’amplicone plasmide ed espressi dalle cellule infettate si<br />
autoassemblano formando VLPs che vengono secrete dalle cellule.<br />
(IV) Si può favorire la diffusione dell’antigene dalle cellule-bersaglio a<br />
quelle vicine: utilizzando VP22, proteina del tegumento di HSV-1.
Vettore Amplicone Plasmide Amplicone<br />
Amp R<br />
Ori S<br />
Gene<br />
Vaccinale<br />
gB gD E1-E2 C Tat Tat22 E7 L1-L2<br />
HSV HCV HIV HPV-16<br />
Antigeni Vaccinali<br />
Pac
VANTAGGI DEI VETTORI AMPLICONI<br />
Combinano le proprietà dei: a) vaccini a DNA, b) vaccini a subun<strong>it</strong>à, e c)<br />
vaccini con vettori erpetici ricombinanti<br />
(I) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto<br />
di MHC-I: gli antigeni selezionati sono codificati dal plasmide<br />
amplicone e sono espressi dalle cellule infettate.<br />
(II) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto<br />
di MHC-II: gli antigeni selezionati sono incorporati nelle particelle del<br />
vettore (pericapside e/o tegumento).<br />
(III) favoriscono la formazione di VLPs: gli antigeni vaccinali codificati<br />
dall’amplicone plasmide ed espressi dalle cellule infettate si<br />
autoassemblano formando VLPs che vengono secrete dalle cellule.<br />
(IV) Si può favorire la diffusione dell’antigene dalle cellule-bersaglio a<br />
quelle vicine: utilizzando VP22, proteina del tegumento di HSV-1.
gD<br />
VP22<br />
gC<br />
Vettore<br />
Amplicone<br />
gH/gL<br />
gB<br />
Antigene di HIV<br />
Antigene di HCV
VANTAGGI DEI VETTORI AMPLICONI<br />
Combinano le proprietà dei: a) vaccini a DNA, b) vaccini a subun<strong>it</strong>à, e c)<br />
vaccini con vettori erpetici ricombinanti<br />
(I) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto<br />
di MHC-I: gli antigeni selezionati sono codificati dal plasmide<br />
amplicone e sono espressi dalle cellule infettate.<br />
(II) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto<br />
di MHC-II: gli antigeni selezionati sono incorporati nelle particelle del<br />
vettore (pericapside e/o tegumento).<br />
(III) favoriscono la formazione di VLPs: gli antigeni vaccinali codificati<br />
dall’amplicone plasmide ed espressi dalle cellule infettate si<br />
autoassemblano formando VLPs che vengono secrete dalle cellule.<br />
(IV) Si può favorire la diffusione dell’antigene dalle cellule-bersaglio a<br />
quelle vicine: utilizzando VP22, proteina del tegumento di HSV-1.
Produzione di VLPs di HPV e HCV da cellule transdotte con gli ampliconi<br />
1a. Infezione di cellule VERO con i<br />
vettori ampliconi ricombinanti<br />
che esprimono L1-L2 (HPV):<br />
o<br />
CITOPLASMA<br />
NUCLEO<br />
proteine C-E1-E2<br />
(HCV)<br />
2a. Infezione di cellule VERO con i<br />
vettori ampliconi ricombinanti<br />
che esprimono C-E1-E2 (HCV):<br />
o<br />
1b. Produzione e rilascio di “virus-like particles”<br />
di HPV-16,cost<strong>it</strong>u<strong>it</strong>e dalle proteine L1 e L2.<br />
proteine L1-L2<br />
(HPV)<br />
2b. Produzione e rilascio di “virus-like particles”<br />
di HCV,cost<strong>it</strong>u<strong>it</strong>e dalle proteine C, E1 ed E2.
VANTAGGI DEI VETTORI AMPLICONI<br />
Combinano le proprietà dei: a) vaccini a DNA, b) vaccini a subun<strong>it</strong>à, e c)<br />
vaccini con vettori erpetici ricombinanti<br />
(I) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto<br />
di MHC-I: gli antigeni selezionati sono codificati dal plasmide<br />
amplicone e sono espressi dalle cellule infettate.<br />
(II) Permettono la presentazione di antigeni virali in un contesto<br />
di MHC-II: gli antigeni selezionati sono incorporati nelle particelle del<br />
vettore (pericapside e/o tegumento).<br />
(III) favoriscono la formazione di VLPs: gli antigeni vaccinali codificati<br />
dall’amplicone plasmide ed espressi dalle cellule infettate si<br />
autoassemblano formando VLPs che vengono secrete dalle cellule.<br />
(IV) Si può favorire la diffusione dell’antigene dalle cellule-bersaglio a<br />
quelle vicine: utilizzando VP22, proteina del tegumento di HSV-1.
VP22<br />
Componente del tegumento di HSV-1<br />
Proteina di 38 KDa, basica, altamente<br />
fosforilata con alta affin<strong>it</strong>à per la cromatina<br />
Esportata dal c<strong>it</strong>oplasma delle cellule che la<br />
esprimono, viene importata nelle cellule<br />
vicine dove si accumula nel nucleo<br />
E’ dotata di diffusione inter-cellulare<br />
Il suo movimento fra le cellule coinvolge i<br />
filamenti di actina