Coltivazione dei microrganismi - Microbiologia Generale

Coltivazione dei microrganismi

! 1. ENERGIA 

Esigenze nutrizionali 

Fototrofi: utilizzano l’energia radiante 

Chemiotrofi: utilizano l’ossidazione di composti chimici 

! 2. CARBONIO 

Fotoautotrofi 

Autotrofi: richiedono solo CO2 

Chemioautotrofi 

Eterotrofi: richiedono una forma organica di C 

Dipendono dagli organismi autotrofi per la produzione di 

carboidrati ed altre sostanze organiche 

MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 05/10

! 3. AZOTO 

Esigenze nutrizionali (cap. 5.1) 

! Costituente di proteine, acidi nucleici e coenzimi 

– Azoto atmosferico 

– Proteine 

– Composti organici e inorganici dell’azoto 

! 4. ZOLFO 

! Costituente di proteine, CoA 

– Composti organici ed inorganici dello zolfo 

! 5. FOSFORO 

! Costituente di DNA, RNA, fosfolipidi , coenzimi 

– Fosfati 


Esigenze nutrizionali (cap. 5.1) 

! ELEMENTI METALLICI 

! Sodio, potassio, calcio, magnesio, manganese, ferro, zinco, 

rame, cobalto 

! Fattori 

! di 

! crescita: 

! VITAMINE 

! H 2O 


Tipi nutrizionali di batteri 


Batteri autotrofi 

! Hanno un’elevata capacità di sintesi e possono trasformare 

composti semplici in carboidrati, grassi, proteine, acidi 

nucleici e vitamine. 

! I batteri autotrofi sono importanti nel riciclaggio degli 

elementi attraverso i sistemi biologici. 

! Terreni di coltura sintetici 

! Sono terreni costituiti da composti 

! chimici noti 


Batteri eterotrofi 

! Sono stati studiati più di quelli autotrofi in quanto 

comprendono tutte le specie patogene come anche la 

maggior parte della popolazione microbica nel nostro 

ambiente. 

! Tutti i batteri eterotrofi necessitano di una fonte di C 

organica, ma hanno esigenze nutrizionali molto diverse. 


Batteri eterotrofi 

! Nei terreni di coltura si deve usare 

una miscela bilanciata dei nutrienti 

richiesti, a concentrazioni che 

permettano una buona crescita 

! Se i terreni sono sterilizzati in autoclave, il glucosio 

deve essere sterilizzato separatamente e aggiunto 

sterilmente al terreno. Infatti quando gli zuccheri 

vengono riscaldati in presenza di altri ingredienti, in 

particolare i fosfati, sono parzialmente decomposti e 

formano sostanze che sono molto tossiche per alcuni 

microrganismi 

! Notare la differente esigenza per quanto riguarda 

la fonte di azoto: per E. coli è sufficiente il fosfato 


Terreni batteriologici 

! Per l’ordinaria 

coltivazione in 

laboratorio dei batteri 

eterotrofi si impiegano 

dei terreni costituiti da 

complesse materie 

grezze che 

promuovono 

l’accrescimento di 

molti dei 

microrganismi 

eterotrofi 

LB: Triptone 1% 

NaCl 1% 

Yeast extract 0.5% 

YPD: Glucosio 2% 

Peptone 2% 

Yeast extract 1% 

SOC: Triptone 2% 

NaCl 0.05% 

Yeast extract 0.5% 

Glucosio 20mM 

KCl 20mM 

MgCl 2 0.1M 


! Terreni arricchiti 

Tipi di terreni colturali 

– Es. aggiunta di componenti (come il sangue) che consentono la crescita di 

microrganismi esigenti 

! Terreni selettivi 

– Es. Un terreno che contenga come unica fonte di carbonio il maltosio consentirà di 

isolare solo quei microrganismi in grado di metabolizzarlo 

! Terreni differenziali 

– Es. in presenza di sangue solo i batteri emolitici formeranno colonie circondate da una 

zona limpida 

– In realtà il terreno agar-sangue può servire nello stesso tempo da terreno arricchito e 

da terreno differenziale 


Preparazione dei terreni di coltura 

! Ogni ingrediente viene 

disciolto nell’appropriato 

volume di acqua 

! Si determina il pH (ed 

eventualmente si aggiusta) 

! Si distribuisce il terreno 

nei contenitori 

! Si sterilizza il terreno 

(autoclave) 


Fattori di crescita 

! Vengono indicati con questo termine tutti quei metaboliti 

che la cellula non può sintetizzare perché priva delle relative 

catene biosintetiche o perché le ha perse in seguito ad una 

mutazione. 

! Un microrganismo con un’esigenza di questo tipo viene 

detto AUXOTROFO (microrganismo che non può 

sintetizzare alcuni nutrienti essenziali). 

! Spesso i fattori di crescita rientrano in queste categorie. 

– vitamine del gruppo B 

– aminoacidi 

– acidi grassi 

– basi puriniche o pirimidiniche 


Figura 6.16 

Effetto della Temperatura sul 

tasso di crescita 

Temperature cardinali 


Condizioni fisiche necessarie per 

! 1. TEMPERATURA 

Figura 6.17 

l’accrescimento 



! 1. 

TEMPERATURA 


Effetto della temperatura 

sull’accrescimento di una specie psicrofila 


Figura 6.18 


Adattamenti molecolari alla 

psicrofilia 

! Maggiore quantità di !-eliche, minore quantità di foglietti " 

– Maggiore flessibilità in ambiente freddo 

! Efficiente trasporto attivo grazie alla notevole quantità di 

acidi grassi insaturi, responsabili del mantenimento della 

fluidità delle membrane a basse temperature 


Figura 6.20 Yellowstone National Park 


Tabella 6.1 Limiti superiori di temperatura 

Group Upper temp limit 

(°C) 

Animals 

Fish 38 

Insects 45-50 

Crustaceans 49-50 

Plants 

Vascular Plants 45 

Mosses 50 

Eukaryotic Microorganisms 

Protozoa 56 

Algae 55-60 

Fungi 60-62 

Prokaryotes 

Bacteria 

Cyanobacteria 70-74 

Anoxygenic 

phototrophs 

70-73 

Chemotrophs 95 

Archaea 113 


Adattamento alle alte 

temperature 

Cap. 6.10 e 18.11 

! PROTEINE 

– la sequenza primaria non differisce di molto dalle altre proteine, tuttavia 

presentano un nucleo idrofobico che diminuisce la tendenza della proteina ad 

aprirsi (unfolding). 

– poiché la capacità di avvolgimento (folding) è essenziale, sono sufficienti 

minime variazione della sequenza primaria per rendere una proteina più 

resistente alle alte temperature. 

– aumentano i legami ionici tra le cariche positive e quelle negative di vari 

aminoacidi. 

– soluti quali di-inositolo fosfato, diglicerolfosfato e manosilglicerato 

stabilizzano le proteine contro la degradazione termica. 

– chaperonine 


Adattamento alle alte temperature 

Cap. 6.10 e 18.11 

! DNA 

– 2,3-difosfoglicerato di potassio ciclico: previene danni chimici al DNA 

causati dalle alte temperature(es. depurinazione) 

– DNA girasi inversa: induce superavvolgimenti positivi 

– proteine simili agli istoni consentirebbero l’apertura delle eliche per la 

trascrizione 

– Sac7 (Sulfolobus): questa proteina si lega al solco minore del DNA e ne 

aumenta la temperatura di fusione di 40°C 



Cap. 6.10 e 18.11 

! LIPIDI 

– Presenza di acidi grassi saturi, tetraeteri di bifitanile 



Cap. 6.10 e 18.11 

! MONOMERI 

– ATP e NAD si idrolizzano rapidamente ad alta temperatura, nonostante ciò la 

vita sembra compatibile a temperature superiori a 120°C (Pyrodictium) 

– Se si riuscisse ad isolare un organismo in grado di crescere oltre i 150°C, 

questo dovrebbe avere un metabolismo energetico basato su qualche cosa di 

diverso dall’ATP. 


Aspetti biotecnologici della 

termofilia 

! DNA polimerasi isolata dal termofilo Thermus 

aquaticus 

! Taq polimerasi …………. PCR 

! Enzimi termostabili per applicazioni industriali 



Fig. 6.22 

l’accrescimento: pH 


! 2. Ph 



! Il pH del terreno può variare durante la crescita. Per 

questo motivo si può usare incorporato nel terreno un 

tampone. 

! Es. Tampone fosfato 

! KH 2PO 4+K 2HPO 4 

! K 2HPO 4+HCl KCl + KH 2PO 4 

! KOH+ KH 2PO 4 H 2O+K 2HPO 4 




! Acidofili: Thibacollus, Solfolobus, Thermoplasma, 

Ferroplasma. La membrana plasmatica lisa a pH vicini alla 

neutralità in quanto gli ioni H+ sono necessari per 

mantenere la stabilità della membrana plasmatica. 

! Basofili: Bacillus, alcuni Archea. Usati per la produzione di 

enzimi da usare come additivi ai detersivi (es. proteasi, 

lipasi). Interessanti problemi bioenergetici. 

! pH intracellulare: 

– neutrofili: 6-8 

– acidofili:4,6 

– basofili: 9,5 



l’accrescimento: osmolarità 

! Attività dell’acqua: 

! E’ il rapporto tra la pressione di 

vapore dell’aria in equilibrio con una 

sostanza, o con una soluzione, e la 

pressione di vapore dell’acqua pura 

! Normalmente le cellule sono in 

equilibrio idrico positivo, ma se si 

trovano in un ambiente in cui l’attività 

dell’acqua è bassa, tenderanno a 

perdere acqua. 

Ambiente ipertonico 



l’accrescimento: osmolarità 

Fig. 6.23 



! 3. OSMOLARITA’ 


! Osmotolleranti: sono in grado di mantenere una 

concentrazione interna di soluto sufficientemente elevata 

per trattenere l’acqua. 

! Meccanismi 

– Batteri: ++ concentrazione amminoacidi (es. Pro, Glu) 

– Funghi: ++ concentrazione di saccarosio e polioli 

(arabitolo, glicerolo e mannitolo) 

! Alofili: richiedono per la crescita concentrazioni di 

sale comprese tra 2.8M e 6.2M 

! Meccanismi 

– Significative modificazioni strutturali delle proteine e 

della membrana. 

Ambiente ipertonico 


- Aminoacidi e loro derivati 

- Zuccheri altamente solubili 

in acqua 

- Alcoli 

Fig. 6.24 

Soluti compatibili 

derivato ciclico dell’acido 

aspartico 


Fig. 6.24 

Soluti compatibili 



l’accrescimento: esigenze gassose 



! 4.ESIGENZE GASSOSE 


! Le forme tossiche dell’O 2 , formati 

come prodotti secondari della 

respirazione, sono: 

! perossido d’idrogeno H 2O 2 

! anione superossido O 2 - 

! radicale ossidrile OH . 


Tabella 6.4 Relazioni con l’O2 di vari microrganismi 

Gruppo Relazioni con 

l’ O2 

Tipo di 

metabolismo 

Aerobi 

Obligati Necessaria Respirazione 

Facultativi Non necessaria, 

ma crescono 

meglio in 

presenza di O2 

Microaerofili Necessario ma a 

livelli più bassi 

di quello 

atmosferico 

Anaerobi 

Aerotoleranti Non necessario, 

non crescono 

meglio in 

presenza di O2 

Obbligati Pericoloso o 

letale 

aerobica 

Respirazione 

aerobica, 

anaerobica, 

fermentazione 

Respirazione 

aerobica 

Fermentazione Streptococcus 

pyogenes 

Fermentazione 

o respirazione 

anaerobica 

Esempio Habitat 

Micrococcus luteus Pelle, polvere 

Escherichia coli Intestino di 

mammiferi 

Spirillum volutans Acque lacustri 

Methanobacterium 

formicicum 

Parte alta delle 

vie respiratorie 

Fanghi attivati 

sedimenti 

anossici lacustri 


Metodi per visualizzare lo stato di 

Il tioglicolato è 

un buon agente 

riducente 

Figure 6.25 

ossidazione o eliminare l’O 2 

aerobico anaerobico facultatiovo microaerofilico aerotollerante 

La resazurina 

è un 

indicatore 

redox (rosa 

quando 

ossidata, 

incolore 

quando ridotta 


Fig. 6.26 

H 2 

CO 2 


Fig. 6.26 


ROS , specie tossiche dell’ossigeno 

Figura 6.27 

flavoproteine, chinoni, 

tioli, proteine ferro-zolfo 

Il più reattivo. 

Fonte: radiazioni 

ionizzanti, perossidi 


Enzimi che agiscono sui composti 

tossici dell’ossigeno 

Gli anaerobi obbligati sono tali perché non hanno questi enzimi. Alcuni 

anaerobi obbligati usano la superossido reduttasi 

Figura 6.28 


Figura 6.29 

test per la presenza della catalasi 

H2O2 + H2O2 # 2 H2O + O2 MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 05/10

Anaerobi obbligati 

! Privi di superossido dismutasi 

! Uso della superossido reduttasi: riduce il superossido a 

H 2 O 2 senza la produzione di O 2 

! Assente la catalasi 

! H 2O 2 rimossa dall’attività di enzimi perossidasi-simili 

cheproducono H 2O come composto finale 




! Precauzioni per eliminare l’ossigeno atmosferico 

! 1. aggiunta di tioglicato di sodio 

! 2. rimozione meccanica dell’ossigeno 

! 3. reazione chimica all’interno del recipiente (es. una caldela 

converte l’ossigeno in anidride carbonica) 

! Influenza dell’ossigeno nei processi di produzione 

! Acido citrico ++++ O 2 

! Aspergillus niger 

! Amilasi + O 2 



! 5. PRESSIONE 


! Normalmente la pressione è di 1atmosfera 

! Barotolleranti 

! Barofili 

– Batteri abitanti delle profondità marine

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